A rastre�el<em&gt; In Vivo</em&gt; Ensaio para mitocondrial Modulators Usando Transgenic Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Resumo

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

Resumo

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode’s ATP levels.^1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.^4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

Introdução

O objetivo geral deste procedimento é a rápida quantificação do status de energia do C. elegans in vivo, com vista a utilizar este como um ponto final na triagem composto. A base racional é com base na expressão transgénica da luciferase de pirilampo, no nemátodo C. elegans ^1-3 através do plasmídeo pSLGCV ⁽¹ https://www.addgene.org/49862). A enzima luciferase é fundida com a proteína fluorescente verde GFP e é expressa constitutivamente e ubiquamente no citoplasma (o sinal de direccionamento de peroxissoma luciferase foi removido). Isto conduz a emissão de luz, quando o substrato luciferina é fornecido exogenamente. À medida que o sem-fim é transparente, a luz pode ser medida num luminómetro como unidades relativas de luz (RLU). Combustíveis de ATP celular a reacção de bioluminescência e a sua disponibilidade determina os níveis de luz produzidos. Consequentemente, luminometria oferece uma convenient meios de avaliar os níveis relativos de ATP e função mitocondrial por extensão, uma vez que a produção de ATP ocorre principalmente nas mitocôndrias. A relação entre os níveis de função e bioluminescência mitocondriais tem sido demonstrada previamente através do silenciamento dos genes da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial e concomitante redução da produção de luz. ¹

As cepas bioluminescência gerados foram designados PE254 (feIs4) e PE255 (feIs5) ¹ (ver lista de materiais) e podem ser utilizados indiferentemente. ³ Um número de estudos foram utilizadas essas estirpes de sensores para informar sobre os níveis de ATP celular in vivo a seguir a exposição a vários produtos químicos xenobióticos tais como azida de sódio ^1, cádmio ^2, esgoto extracto de lamas ^3, 5'-f luoro-2-desoxiuridina ^6, e uma nitrosamina específica do tabaco ^7. As cepas também têm sido úteis para monitorizar os efeitos da exposição à radiação ultravioleta C 8 e efeitos de perturbar a função da cadeia respiratória mitocondrial. ^1,9 Uma primeira versão do sensor de luminescência que expressa o gene da luciferase sem uma fusão GFP (PE39) também tem sido utilizada na investigação dos efeitos de metais pesados ​​e de um respiratória . ¹⁰ Cepas PE254 PE255 e desacoplador levar a luciferase: GFP fusão e fluorescência da GFP foi mostrado para aumentar proporcionalmente com massa nematóide, oferecendo um meio conveniente para a normalização dos valores de luminescência ^6,9 Os efeitos do montante diferencial de vermes por poço também pode ser. tidas em conta, incluindo várias repetições técnicas no ensaio (um mínimo de 5 poços por condição). ³

O protocolo oferece a possibilidade de monitorização in vivo dos níveis de energia (em oposição a mais tecnicamente laboriosa determinações in vitro de ATP), que permite rastreio de compostos e reposicionamento no contexto fisiológico de um mu inteirolticellular organismo. O procedimento pode ser estendido para uma variedade de origens genéticas, atravessando o transgene cromossomicamente integrados em cepas mutantes disponíveis e / ou por silenciar genes por RNA de interferência; Assim, aproveitando ao máximo C. elegans como organismo modelo. O método deve ajudar a reduzir a falta de fase tardia de candidatos a medicamentos devido à toxicidade mitocondrial e fazer uma contribuição para a redução de maior experimentação animal.

Protocolo

NOTA: Realizar todas as etapas sob condições estéreis (laminar fluxo de gabinete) e com materiais pré-esterilizados em autoclave (126 ° C, 11 min). Uma placa de LB com estrias E. coli OP50 mantidas a 4 ° C é necessária, raia-se para placas de LB fresco e restreak cada mês.

1. Bacteriana Alimentos (Escherichia coli OP50) Preparação

1. Dia 1. Inocular 2 x 5 ml de LB em duas garrafas universais com uma única colônia de E. coli e OP50 lugar em agitação incubadora a 37 ° C (220 rpm) durante 8 horas.
2. Após 8 horas de incubação, utilizar 2 ml de E. coli OP50 LB cultura para inocular cada um dos 3 x 200 ml de LB. Colocar em frascos de agitação incubadora (220 rpm) O / N (17 horas) a 37 ° C.
3. Pesar 20 x 50 ml de tubos de centrífuga e escrever o peso sobre o tubo.
4. Dia 2. Usando uma pipeta sorológica, alíquota de 30 ml de O / N E. coli em cultura OP50 a pré pesava tubos de centrífuga. Centrifugar a 7,741 xg, 10 ° C, 8 min.
5. Decantar o sobrenadante cuidadosamente, manter o tubo invertido com tampa e deixar repousar durante vários minutos. Usando uma pipeta de remover qualquer excesso de sobrenadante que pode ter recolhido na tampa. Pesa-se o tubo e calcular o peso do pelete.
6. Calcular o volume necessário para proporcionar uma suspensão de 30 g / L e marcar este volume no tubo. Data, etiqueta e colocar os tubos a -20 ° C para utilização no prazo de 1-3 meses ou a - 80 ° C, se o armazenamento por mais de 3 meses.
7. Prepare a suspensão bacteriana para o crescimento de nemátodos; permitir sedimento bacteriano para descongelar e adicionar o volume necessário de S ^11,12 meio completo a cada tubo, de vórtice suavemente para ressuspender sedimento, conteúdo de piscina de tubos diferentes para se obter o volume requerido. Trabalhar sob condições estéreis.

2. Preparação de Padrões droga num formato de placa de 96 poços

NOTA: Se estiver usando uma biblioteca de fármacos, placas de drogas são fornecidos em um únicoconcentração de composto em DMSO. Rastreio primário irá testar compostos a uma única operação de concentração. Instruções de seguir para a preparação de medicamentos para a placa de teste confirmativo composto numa gama de concentrações de entre 0-160 uM, seleccionada após significância estatística a 10 uM. Os passos que se seguem podem ser adaptadas para testar outras concentrações.

CUIDADO! Siga as precauções necessárias para a manipulação de drogas (geralmente enfrentam máscara, óculos de segurança, luvas são obrigatórios).

1. Prepare a placa de droga com as normas para o rastreio de confirmação de trabalho: pesar a quantidade necessária de composto em tubo estéril de microcentrífuga de 1,7 ml e se preparar o composto 16 mM em DMSO (ou seja, em relação à concentração de 100x superior desejado para exposição concentrada).
2. Serialmente diluídas estoque 16 mM de 1: 2 em DMSO para se obter 8, 4, 2, 1, 0,5 e 0,25 mm (padrões condições estéreis). Estes são 100x concentrada e será diluído até concentrações finais de 0 (apenas veículo),2,5, 5, 10, 20, 40, 80 e 160 uM (em DMSO a 1%) durante a exposição à droga.
3. Em uma câmara de fluxo laminar, colocar 20-50 uL por poço de padrões compostos dentro de uma coluna de uma placa de 96 poços, por exemplo A1 posição da placa: 16 mm, B1: 8 mM, C1: 4 mM, D1: 2 mM, E1: 1 mM, F1: 0,5 mM, G1: 0,25 mM de droga e H1: DMSO. Use diferentes colunas para a série de diluição de drogas diferentes.
4. Veículo alíquota para as cavidades da coluna 12 na placa de fármaco.
   NOTA: Este irá facilitar os testes de controlo do veículo para baixo colunas em adição ao teste ao longo fila H, assegurando desse veículo é testado em posições representativas de toda a placa.
   NOTA: Cada placa de drogas para o rastreio de confirmação contém uma série de diluição para um máximo de 11 diferentes drogas a serem testadas mais o controlo do veículo.
5. Rótulo e placa de vedação, cubra com papel alumínio e coloque a -20 ° C até serem necessárias.

3. Experimentos Nematóides

NOTA: Realizar todas as etapas under condições estéreis, assepticamente e com pré esterilizado materiais e reagentes. Manter C. elegans estirpes rotineiramente em placas NGM com E. ¹² coli OP50. timings sugerido para as diferentes etapas do protocolo são apresentados na Tabela 1.

1. Dia 1 de tarefas: configurar cultura líquida de biossensor tensão para sincronização subseqüente.
   1. Tome-se nemátodes de uma placa NGM 6 centímetros (com abundância de larvas jovens onde a comida acaba de correr para fora) em 2 mL S completa e transferir para balão com 30 g / L E. coli OP50 em S completo (volume total de 30 ml em um balão de vidro cónico de 250 ml de capacidade). Incubar 3 dias a 20 ° C, 160 rpm.
2. Dia 4 de tarefas (permitir que cerca de 30-35 min): cultura lixívia para colher os ovos e sincronizar população worm. Realizar todos os passos de centrifugação durante 1 min, 600 x g.
   1. Prepare solução de água sanitária imediatamente antes da utilização: para cada 16 ml de 0,156 M KOH / NaOH adicione 4 ml de lixívia.
   2. Despeje 2 x 14 mlcultura verme em 15 ml tubos de centrifugação cónicos. Permitir vermes para resolver pela força da gravidade (3 min). Remova e descarte nematóides acima liquidados líquidos. Adicionar 5 ml de solução de água sanitária para cada tubo e iniciar o temporizador. Combine volumes em um tubo.
   3. Inverta tubo suavemente durante 2 min, verificar sob estereoscópio para a quebra de vermes e a liberação de ovos em suspensão. Quando a maioria de ovos são liberados ou em um tempo máximo de 2 minutos na solução de água sanitária, centrífuga.
   4. Remover o sobrenadante cuidadosamente. Lave 1x de pelotização com 14 ml S completa e centrifugar.
   5. Elimine o sobrenadante, adicionar solução de água sanitária 10 ml e iniciar o temporizador (esta segunda etapa de branqueamento garante que a maior parte das carcaças do sem-fim se desintegrar e já não são vistos sob estereoscópio). Depois de um tempo máximo em solução de água sanitária de 2 min, centrífuga.
   6. Lavar 3x pellet em S completa, decantar cuidadosamente sobrenadante e ressuspender sedimento em 14 ml S completos após cada centrifugação. Após lavagem final, ressuspender pellet ovo em 14 ml S complete.
   7. Transferir o volume para um frasco de vidro cónico. Incubar 18-24 h a 20 ° C, 160 rpm.
      NOTA: Colhida ovos eclodem O / N e prender o desenvolvimento na primeira fase larval (L1) devido à falta de comida, portanto, todos eles vão estar no mesmo estágio de crescimento.
3. Dia 5 de tarefas: configurar culturas vermes sincronizados para ensaios de drogas.
   NOTA: Worms suspensas em meio de privação tendem a aderir às superfícies plásticas hidrofóbicas, tais como as pontas das pipetas e tubos. 0,01% Tween-20, um agente tensioactivo é utilizado aqui para tornar as superfícies de plástico mais hidrofílico e permitir uma maior precisão na contagem (0,01% de Triton-X100 também pode ser utilizado). Quando nematóides estão no meio suplementado bacteriana, eles não tendem a ficar com plástico.
   1. Determinar o número de eclodidos L1 do em balão, balão de manter em plataforma de agitação (160 rpm).
      1. Tome 3x 100 amostras ul da garrafa (use uma ponta limpa de cada vez) em 1,7 ml separados microtubos com 900 ul líquido medium 0,01% de Tween-20.
         NOTA: Aspire amostra de 100 mL na ponta limpo apenas uma vez. Então, quando a distribuição, pipeta cima e para baixo algumas vezes para o meio tween suplementado para liberar quaisquer vermes que aderiram à ponta.
      2. Conte os nematóides em 4x 10 gotas ul de cada tubo de diluição triplicado. Calcular o valor médio e estimar o número de vermes presentes no frasco de vidro cônico.
   2. Calcule o volume de suspensão de nematóides chocado necessário para configurar uma cultura ml 2 x 20 com 10 nemátodos por 10 jul. Aumentar o volume calculado em 10% a conta para alguma perda nematóide subsequente durante passos de centrifugação.
   3. Decantar o volume necessário em 2 x 15 ml tubos de centrifugação (pré-pesado). Pesar os tubos para se obter o volume real dispensado, vortex suavemente e ajustar a meta de volume, removendo o excesso de volume com uma pipeta de 5 ml (apenas a ponta estéril deve entrar no tubo).
   4. Faça o volume para 14 ml com S frescos completos a erah nematóides. Centrífuga (1 min, 600 g). Retire e elimine o sobrenadante com cuidado para não perturbar o pellet nematóide.
   5. Adicionar 5 ml de S completo com 30 g / L de E. coli OP50 a nematóides peletizadas. Transferir os 5 ml em cada tubo para um frasco de vidro cónico contendo 15 ml S completo com 30 g / L de E. coli OP50. Anote nematóides tempo foram primeiro fornecidos com alimentos.
   6. Agite suavemente frasco (160 rpm), tome 9 x 10 gotas ul em lâminas microscópicas (use dicas frescos cada vez) para contar nematóides e confirmar média de cerca de 10 (± 2) por 10 ul.
   7. Coloque frascos de nematóides em agitação incubadora a 20 ° C, 160 rpm durante 42-44 horas.
4. Dia 7 tarefa: nematóides de transferência para placas de 96 poços e iniciar a exposição ao medicamento.
   1. Combinar culturas de nematóides em um único frasco, manter rodando frasco delicadamente e coloque 3 x 4 ml de cultura nematóide em uma calha de 60 ml estéril. Coloque calha em uma plataforma de agitação (160 rpm).
   2. Use 8 chanNel de pipeta 25 ul alíquota nemátodos suspensos por poço de placas de microtitulação de 96 poços pretas com fundo transparente plana (para tirar ambas as leituras de luminescência e de fluorescência, ou luminescência para placas brancas apenas). Cubra com placa da tampa e reserve.
      1. Depois de configurar a cada 2 placas, coloque mais 2 x 2,5 ml nematóides na calha para substituir o volume perdido (manter um "volume morto" na calha de aproximadamente 7 ml).
      2. Configure 13/14 placas com nematóides. 11 placas de nematóides serão necessários para testar duas placas de drogas de 96 poços. A placa ¹² de nemátodo será carregado exclusivamente com veículo como controlo. A ¹³ de placa será usado para estabelecer a fluorescência de fundo no dia 8 (ver abaixo). Uma placa extra pode ser preparado para uso deve ocorrer erros durante a configuração.
   3. Alíquota 74 ul de S completas a cada poço e colocar a placa em uma câmara úmida (ver lista de materiais) em uma incubadora de agitação (20 ° C, 160 rpm) untIL pronto para compostos de teste alíquota no tempo de desenvolvimento pré-seleccionada (por exemplo, 45 h 30 min após a alimentação fornecida). [Volume por poço é agora 99 ul].
   4. Descongelar placa (s) droga para teste.
   5. Use pipeta multicanal para configurar placas de nematóides com drogas, trocando as pontas de cada vez. Permitir 5 minutos por placa de 96 poços de alíquotas de drogas.
      1. Tomar 1 ml de uma coluna ^st da placa de drogas e adicionar colunas 1-5 de uma placa contendo nematóides; repita a partir do 2 ^nd coluna na placa de droga em colunas 8-12 da placa contendo nematóides. Adicionar 1 ml de veículo para colunas 6 e 7 da placa de nematóide.
         NOTA: O volume total por poço na placa de nemátodo é 100 ul resultando em uma diluição de 1: 100 de composto / veículo.
      2. Repita processo por adição de 1 ul de o 3 ^{rd /} 4 ^th coluna da placa de fármaco às colunas 1-5 / 8-12 da segunda placa de nemátodos; adicionar veículo para colunas 6 e 7 da placa de nematóide.
      3. Continuar a testar colunas de pratos de drogas restantes. Configurar um mínimo de uma placa nematóide com o veículo em todos os poços, por amostragem, da coluna 12 da placa de drogas. Coloque placas traseiras em câmaras úmidas em agitação incubadora (20 ° C, 160 rpm) durante 20-22 horas (ver nota para o dia 8).
   6. Parte-se preparar o tampão de luminescência por dia seguinte: adiciona-se DMSO e 10% de Triton-X-100 para o volume necessário de S completa para se obter 1% de DMSO e 0,15% de Triton X-100. Permitir 5 ml por placa de leitura de luminescência, mais 1 ml para priming luminometer injector.
5. Dia 8 de tarefas: Leia endpoints experimentais - fluorescência e bioluminescência. (Leituras de fluorescência de GFP são recomendadas como um meio para normalizar os dados de bioluminescência.)
   NOTA: Aponte para ler endpoints por 66-67 horas após a alimentação fornecida aos nematóides, a fim de evitar a produção de progênie significativa nas condições experimentais descritas.
   1. Configurar placa ao uso como controle de fundo para as leituras de GFP. Combine bem conteúdo dos 13 ^th placa em um tubo de 15 ml. Permitir nematóides para resolver (2-3 min). Use sobrenadante para carregar uma microplaca (preto com fundo transparente) com 100 suspensão bacteriana ul por poço.
      1. Observe fundo placa de controle sob o microscópio anotando poços onde os nematóides podem ser vistos. Excluir estes a partir da estimativa de fundo usada na análise de dados subsequente.
   2. Ler a fluorescência de cada placa de 96 poços, incluindo o controle de fundo. (Configurações: sistema ótico de fundo da placa; filtros 485/20 excitação; emissão 528/20).
   3. Preparar tampão para leituras de luminescência: adiciona luciferina (20 mM) de co-preparado tampão (a partir do dia anterior), para se obter tampão de luminescência com 1% de DMSO (1x), 0,15% de Triton-X100 (3x) e 0,3 luciferina mM (3x ). Primeiro luminómetro injector 6x com 150 ul de tampão de luminescência.
      1. Etapa anterior assume 1% DMSO como veículo durante a exposição à droga. Quando o veículo é água, ajustar o concentration de DMSO em tampão de luminescência a 3% (isto é, 3x).
   4. Trabalhar com uma placa de cada vez. Dispensar tampão 50 ul por poço de luminescência. (150 mL de volume final em bem; 3x diluição de tampão luminescência: DMSO 1%, 0,05% Triton-X100 e 0,1 mM concentrações luciferina finais). Coloque imediatamente na plataforma de agitação e iniciar o temporizador.
      1. Após 3 min em plataforma de agitação (160 rpm), leia luminescência (1 seg por medição).

Análise 4. Dados

1. Subtrair fundo GFP média dos resultados de leitura de fluorescência. Divida bioluminescência pela respectiva leitura GFP.
   1. Quando um valor elevado de GFP é detectado por nemátodos expostos a um composto, medir a fluorescência do composto por si próprio em conta qualquer fluorescência do composto. Se superior à média, usar isso como plano de fundo em vez disso.
2. Bioluminescência expresso, um GFP normalizada bioluminescênciand dados de fluorescência de GFP como uma percentagem do valor médio de controlo de veículo em cada placa.
3. Traçar os valores médios e as barras de erro para cada concentração.
4. Teste de significância estatística usando 2-way análise de variância (ANOVA) com efeitos de 'concentração', 'Experiment' e sua interação (cada ponto de dados refere-se a um único poço), e usar o teste de Dunnett como teste post-hoc (vs . controle do veículo).
   NOTA: Se o "experimento" ou os termos "interação" são significativos, novos experimentos podem ser necessárias para confirmar a resposta. Onde há variabilidade entre os experimentos resulta da observação dos gráficos de dados, um One-way ANOVA pode ser realizada em dados obtidos a partir de experimentos independentes.
   1. Para a análise estatística da placa (s) apenas com veículo, seleccione todos os poços em colunas 6 -7 e todos os poços na fila H como grupo controle (estas são as posições rotineiramente atribuídos ao veículo durante o teste composto).

Resultados

Os resultados representativos para ilustrar o método foram obtidos para rotenona (Figura 1), o paraquat (Figura 2), o oxaloacetato (Figura 3), e 4 compostos que foram apanhados inibidores como luciferase de pirilampo durante o rastreio de uma biblioteca de medicamentos ¹³ (Figura 4). A exposição da droga foi iniciada na fase de L4 em todos os casos, mas os experimentos de exposição paraquat foram iniciadas em 41 horas após a primeira comida fornecida aos nematóides em comparação com 45-46 horas para os outros compostos. O protocolo permite um grau de flexibilidade na selecção de tempo para o início da exposição ao fármaco e a duração da exposição. No entanto, para fins de rastreio, definir horários devem ser respeitados, uma vez selecionados, para a reprodutibilidade entre os experimentos. Endpoints deve ser medido por 66-67 hr tempo de desenvolvimento, a fim de evitar extensa postura de ovos para incubação e de progênie em poços. Diretrizes para horários são fornecidos em Tcapaz 1.

Rotenona, um complexo mitocondrial I de inibidor, reduzida bioluminescência após ambas as exposições relativamente curtas (2 horas) e mais longo (24 horas) para uma gama de concentrações (Figura 1). Neste exemplo, as medições foram levadas GFP, mas o número de repetições técnicos utilizados (n = 6) é suficiente para uniformizar quaisquer diferenças nos números de vermes entre ³ poços. A exposição de 24 horas é uma janela de tempo durante o qual os nemátodos crescer, e desenvolvimento mais lento, como resultado da complexa inibição eu era esperado para contribuir para o declínio da bioluminescência. Isto foi confirmado por observação visual sob estereoscópio com desenvolvimento retardado visto, particularmente em concentrações de 20 ^ M e acima; Além disso, alguns letalidade foi observada a partir de 40? M (observações qualitativas não quantificada). Sem letalidade foi observada após a exposição 2 hr, mas efeitos sobre o movimento sem-fim foram vistos. Um declínio acentuado na bioluminescência em relação aos controles ocurred na concentração mais baixa testada de rotenona 2,5 uM, para os quais os efeitos não foram facilmente detectadas por observação visual rápida em 2 horas de exposição. Este declínio da bioluminescência é consistente com a redução do ATP celular. A inibição máxima foi alcançada com a concentração mais baixa de rotenona utilizado (2,5 uM), indicando que todas as experiências subsequentes destinadas especificamente às rotenona deve ser realizada entre 0 e 5 uM [na gama de concentrações 0-160 uM foi seleccionado como parte de uma comparação com outras drogas inicialmente identificado como tendo efeitos significativos em 10 mM (a ser publicado em outro lugar)].

O herbicida paraquat afeta a função mitocondrial por meio de aumento de espécies reativas de oxigênio. Aqui, demonstramos o seu efeito sobre a bioluminescência de C. elegans estirpe PE254 após exposição a uma gama de concentrações de 24 h (Figura 2). À medida que a tensão carrega uma luc :: fusão GFP, fluorescência da GFP foi alsO medidos como um meio de normalização. paraquat ^6,9 diminuiu a bioluminescência, fluorescência da GFP e bioluminescência normalizada significativamente. O teste post-hoc Dunnet indicaram que as concentrações de paraquat com diferenças significativas em relação ao controlo do veículo foram 4 e 8 mm para a bioluminescência e bioluminescência normalizado, bem como 2 mM para bioluminescência normalizado. A única concentração reduzindo significativamente fluorescência da GFP foi 8 mm, uma concentração em que os efeitos do crescimento e do verme morto ocasionais foram vistos (observações qualitativas). O declínio na bioluminescência (e bioluminescência normalizado) foi maior do que a de fluorescência, consistente com uma diminuição da função mitocondrial e os efeitos sobre a produção de ATP.

O oxaloacetato intermediário do ciclo do ácido cítrico testado em C. elegans estirpe PE254 numa concentração única de 8 mM, levou a um aumento da bioluminescência (Figura 3). Sem fluorescência da GFPNCE medições foram obtidas ou observação visual adicional realizado; no entanto, tais resposta a uma única operação de concentração merecem uma exposição de confirmação para uma gama de concentrações, e observações mais detalhadas sobre os efeitos. Um acessório de bioluminescência por este composto não é surpreendente, uma vez que pode ser postulada para levar a uma maior actividade do ciclo do ácido cítrico, com última análise, uma maior produção de ATP (no entanto, seria aconselhável controlar a quaisquer efeitos sobre os níveis de luciferase por meio da avaliação fluorescência da GFP em experiências subsequentes). Os conjuntos de dados oxaloacetato mostrado revelam o grau de variabilidade na resposta vista com base em experiências de luciferase. Em nossa experiência esta variabilidade é uma característica do sistema de teste particularmente para as condições de exposição menos prejudiciais.

O compostos inibidores da luciferase do pirilampo DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 e DDD00023047 foram testadas in vitro vendo os efeitos sobre a puenzima rified e in vivo usando o C. elegans luc: GFP expressando tensão. Não houve evidências de que qualquer um dos compostos testados causou a morte de nemátodos sob as condições de exposição. Todos os 4 compostos afectou a actividade de luciferase in vitro para as concentrações testadas 2 25 e 100 uM (Figura 4A). DDD00001434 matou a actividade da luciferase purificada quase completamente, o que proporcionou uma justificação credível para o grande decréscimo na bioluminescência in vivo (Figura 4B). Embora, in vitro e in vivo em ensaios não são directamente comparáveis, a resposta a DDD00023047 foi semelhante em ambos os ensaios. DDD0001477 e DDD00000635 causou um declínio maior in vivo do que in vitro. Estes compostos foram fornecidos para os vermes vivos 22 h antes de o substrato luciferina, e os resultados podem reflectir que eles não eram facilmente deslocado do local activo de luciferase luciferina quando se tornou pilable. Alternativamente, DDD0001477 e DDD00000635 pode ter um efeito adicional sobre os níveis de ATP celular. Isso teria de ser avaliado por meio que não envolvem a luciferase de vaga-lume. De destacar a forte valorização do sinal GFP em vermes vivos expostos ao composto DDD00000635. Isto será discutido a seguir.

Figura 1. O complexo mitocondrial I inibidor rotenone diminuiu o estado de energia de C. elegans como medido por bioluminescência de estirpe PE254. Sincronizada L4 vermes estágio (45-46 h após o alimento fornecido a larvas L1) expostas a 0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 e 160 uM em rotenona 1% de DMSO durante 2 hr (short) ou 24 horas (exposição longa) leituras anteriores de bioluminescência, respectivamente, em 48 e 69 h de desenvolvimento verme após o alimento fornecido. Bioluminescência (unidade relativa Unidades de luz, RLU) foi expressa como uma percentagem do veículo (1% DMS) Os valores de S. As barras de erro representam SEM de réplicas para cada concentração de técnicas rotenona (n = 6). Todas as concentrações testadas resultou em uma diferença altamente estatisticamente significante em relação ao controle de veículo (p <0,001).

Figura 2. O paraquat estressor oxidativo diminuiu o estado de energia de C. elegans PE254 estirpe de um modo dependente da concentração (medida por bioluminescência). vermes fase sincronizada L4 (por conveniência, neste caso a 41 horas após o alimento fornecido a larvas L1) foram expostas a 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4 ou 8 paraquat mM durante 24 h. A fluorescência de GFP (unidades de fluorescência relativa unitários, RFU) foi usado para normalizar os dados de bioluminescência (unidade RLU), ambos os pontos finais obtidos em 65 h de desenvolvimento. Os dados são expressos como uma percentagem de controlo (DMSO a 1%). As barras de erro representam SEM de réplicas técnicas(n = 5 para diferentes concentrações; n = 18 para os controlos). One-way ANOVA: *** p <0,001 em relação ao veículo de controlo.

Figura 3. O intermediário oxaloacetato ciclo do ácido cítrico (8 mM) aumentaram a bioluminescência de C. elegans PE254 tensão. Synchronized L4 vermes estágio (45-46 horas após a refeição fornecida às larvas L1) foram expostos a recém-preparados 8 oxaloacetate mM durante 18 horas ± 30 min. A bioluminescência (unidade RLU) foi lida a um período de desenvolvimento de HR 63,5 ± 1 h e esta foi expressa como uma percentagem do controlo de veículo _(ddH2O). Diferentes colunas representam diferentes conjuntos de 8 repetições técnicas atribuídas a diferentes placas de 96 cavidades dentro da mesma experiência de dados. As barras de erro representam SEM de réplicas técnicas (n = 8). 2 way-ANOVA com 'set' e 'concentração' como fatores: ̵6; Definir 'p> 0,05' ', p concentração <0,001 e termo de interação p> 0,05.

UMA

B

Figura 4. Teste de respostas a 4 compostos da biblioteca Dundee descoberta da droga composto ¹³ (C1: DDD00001434, C2: DDD0001477, C3: DDD00000635 e C4: DDD00023047) com atividade inibitória conhecida em vaga-lume luminescência da luciferase. (A) Efeito dos compostos sobre a actividade de luciferase de pirilampo purificada (medido como unidades de luz, RLU), expresso como uma percentagem do controlo de veículo. O kit de bioluminescência de ATP CLSII (Roche, Manheim, Alemanha) foi usada de acordo com instruções fornecidas com a mesma quantidade de enzima luciferase aliquotadas para poços de branco (96-Well placas de microtitulação). ATP foi fornecido a uma concentração final de 10 uM e 1 ul de composto (concentração final indicada) ou DMSO (1%) foi adicionado. Sinal de luminescência foi integrado durante 10 segundos. As barras de erro representam SEM de réplicas técnicas (n = 4). Análise: One-way ANOVA; * p <0,05 ou *** p <0,001 em relação ao veículo de controlo. Diferenças entre 25 e 100 uM altamente significativas para C1 (DDD00001434; p <0,001), e significativo para C2 e C3 (respectivamente DDD0001477 e DDD00000635; p <0,05). (B) in vivo medições de bioluminescência, bioluminescência normalizado a fluorescência da GFP e fluorescência da GFP de C. elegans PE254 estirpe em 67 hr tempo de desenvolvimento após a exposição a compostos de teste durante 22 h. As barras de erro representam SEM de réplicas técnicas (n = 8). A análise estatística (one-way-ANOVA) realizada em dados agrupados de 3 conjuntos de dados (3 xn = 8). * p <0,05 ou *** p <0,001 em relação ao controlo de veículo respectivo. Diferenciadaces entre 25 e 100 mm única estatisticamente significativa (p <0,05) para a bioluminescência normalizado após a exposição a C4 (DDD00023047).

Hora do dia	Dia 1	Dia 2	Dia 3	Dia 4	Dia 5	Dia 6	Dia 7	Dia 8
9-10								Passo 5
10-11								Passo 5
11-12							Passo 4	Passo 5
12-13							Passo 4
13-14
14-15
15-16
16-17	Passo 1				Passo 3
17-18
18-19				Passo 2

Tabela 1. Visão geral das etapas do protocolo a ser realizado em cada dia de experimentos de nematóides (Seção 3) e sugeriu timings.

Discussão

O organismo modelo C. elegans fornece um poderoso sistema experimental. É fácil de cultura abundante e produz progenia geneticamente idênticos, com um ciclo de vida do dia 3,5 de ovo a reprodução de adulto (através de estágios larvais juvenis através L1 a L4). Devido ao seu pequeno tamanho, pode ser convenientemente cultivadas em placas de 96 poços, o que facilita a triagem composto. Nós apresentamos um protocolo de triagem fenotípica com base em cepas de C. elegans que actuam como sensores in vivo dos níveis de energia ¹⁴ O protocolo. é aplicável a qualquer laboratório, embora seja necessário um luminómetro de placas de 96 poços e um armário estéril. É importante evitar a contaminação em ensaios usando boa técnica laboratorial. Se trabalhar manualmente, o número máximo de placas de nematóides atingível é de 13 por experimento permitindo o teste de 2 x placas de 96 poços e de drogas incluindo duas placas de veículos. Os resultados representativos são apresentados para o complexo mitocondrial I inibidor rotenone, o paraquat gerador de superóxido, o oxaloacetato intermediário ciclo de ácido cítrico e quatro compostos com conhecida atividade inibitória da luciferase do pirilampo. Os primeiros dois compostos conduziu a um decréscimo na bioluminescência como previsto oxaloacetato Considerando que conduziu a uma melhoria, podem resultar de uma maior geração de ATP. Os conjuntos de dados oxaloacetato também demonstram a variabilidade intrínseca em experiências com base na luciferase do pirilampo como um repórter. Um mínimo de três experiências independentes são aconselháveis ​​para determinar a robustez das respostas aos compostos desconhecidos.

A inibição da actividade da luciferase do pirilampo foi identificável com um ensaio in vitro utilizando um kit comercial. ³ Um dos compostos resultou num aumento substancial da fluorescência da GFP consistente com o inibidor de aumentar os níveis de luciferase de pirilampo pela ligação à enzima luciferase do activo marcado com GFP local, e tornando-o mais estável. ¹⁵ Em alguns casos(não, neste caso particular), o que pode levar ao aumento dos níveis de bioluminescência quando o inibidor é deslocada por um excesso de substrato. ¹⁵ É, portanto, importante não interpretar os resultados erradamente a partir de compostos que interagem com a enzima de pirilampo como níveis de ATP diminuída ou aumentada / função mitocondrial. As alterações no sinal de luminescência muitas vezes se correlacionam com as medições adicionais de saúde, tais como movimento, crescimento e desenvolvimento. Como um exemplo, um composto é um inibidor da luciferase suspeito se um declínio dramático do sinal de bioluminescência é detectado mas os vermes são indistinguíveis dos controlos por observação microscópica. Um aumento na fluorescência da GFP, não explicado pelo crescimento ou autofluorescência composto, também pode apontar para um inibidor. Uma série de inibidores da luciferase ¹⁵ são conhecidos e foram celebrados PubChem. Portanto, em primeira instância, é uma boa prática de consultar informações sobre os inibidores da luciferase detidas por PubChem; seguido por tressante os efeitos de compostos em ensaios in vitro com a enzima purificada, ³ e / ou a confirmação de efeitos sobre a função mitocondrial por meios adicionais. ^16,17

Medições de fluorescência da GFP permitir a detecção de níveis de luciferase de pirilampo (ea detecção potencial de alguns inibidores da enzima luciferase, como discutido acima) fazendo um forte argumento para a medição deste parâmetro ao lado de bioluminescência sempre que possível. A normalização das leituras bioluminescência a GFP é também um meio de contabilizar variações no número de vermes entre poços (embora isto também pode ser conseguido pela inclusão de múltiplas repetições técnicas). Para uma maior sensibilidade, é importante para subtrair a fluorescência de fundo de leitura. O protocolo avalia contribuição da suspensão bacteriana para a fluorescência de fundo, no entanto nemátodo autofluorescência não é contabilizada (uma limitação do ensaio corrente, particularmente crítico para qualquer Stu envelhecimentomorre dado que nematóide autofluorescência aumenta com a idade). Autofluorescência de compostos de teste também deve ser avaliada em paralelo. GFP normalização pareceria indispensável quando investigadores deseja adaptar o protocolo para comparar piscinas de ATP celular em diferentes mutantes genéticos ou após o silenciamento de genes diferentes, a fim de controlar para quaisquer diferenças de tensão ao nível de expressão do transgene bioluminescência.

Os parâmetros críticos dentro do protocolo de incluir a fase de desenvolvimento em que a exposição é iniciada, a duração da exposição, e a obtenção de um número semelhante de nemátodos nos diferentes poços. A exposição pode começar em qualquer fase de desenvolvimento dos nematóides, no entanto fase L3 ou mais é preferível. A partir dessa etapa, nematóides depender de fosforilação oxidativa para o desenvolvimento até a idade adulta, como evidenciado por um aumento muito significativo no teor de mtDNA, consumo de oxigênio e níveis de ATP. ^18,19,20 O presente protocolo inicia exposure no estádio L4. A razão para alíquotas nemátodos para placas de 96 poços apenas nesta fase (ao invés do que quando eles foram em primeiro lugar dotado de comida na fase L1), é que, embora as placas são colocadas em câmaras húmidas para minimizar a evaporação, um grau de evaporação ainda ocorre em nossa incubadora de agitação, vista como muito pequenas gotículas que formam nas tampas (isto pode não ser um problema com outras incubadoras agitação). Por nemátodos alíquotas para placas imediatamente antes da adição de padrões de droga, a concentração efectiva da droga não é afectada por qualquer variação pequena no volume devido a evaporação. Carregando uma placa com nematóide veículo só é útil para verificar se os nematóides foram distribuídos uniformemente entre os poços. Não existem diferenças significativas para o veículo só placa seria indicativo de má técnica na distribuição dos nematóides aos poços.

A duração da exposição é um fator importante a considerar. Se os efeitos sobre o estado de energia de forma independente do crescimento são de interesse, o proprotocolo pode ser modificado para acomodar exposições mais curtas (de respostas quase imediatos para, por exemplo, 2 horas). Por outro lado, a entrada de compostos em C. tecidos elegans pode levar algum tempo. Por exemplo são necessárias 12-24 horas para atingir as concentrações máximas internas do resveratrol e 5-fluoro-2'-desoxiuridina (FUdR). ²¹ Por conseguinte, uma exposição mais longa (18 a 24 horas) pode ser justificada para maximizar os níveis de exposição. O tempo de exposição deve ser limitado aos tempos que não permitem níveis significativos de reprodução para tomar lugar no poço. Recomendamos que o tempo total de desenvolvimento de nematóides é mantida sob 66-67 h. Embora conveniente, nematóides estão grávidas até lá e deram início a oviposição. No entanto descobrimos leituras bioluminescência preparações de ovo a ser insignificante (não mostrado). O sur-5 promotor impulsionado expressão do transgene é primeiro detectada apenas 2-2 horas e meia após a fertilização na fase 100 célula ^{22 e a} ccasca de ovo hitinous é susceptível de limitar a entrada de luciferina. Outros descobriram que os ovos embrionados não contribuem significativamente para o metabolismo dos adultos grávidos. ²³ No entanto, as condições que permitem a produção de descendência significativo, devem ser evitados. Se preferir, a escala de tempo experimental pode ser deslocado de volta: nós já iniciou a exposição a uma toxina ambiental na tarde L3 fase larval (36 h) e realizado bioluminescência e GFP medições a 55 hr ^{2 fundos} alternativa, genéticas que são condicionalmente estéril. pode ser usado para evitar a produção de descendência, como por exemplo o fer-15 (B16) II; Fem-1 (hc17) IV mutante duplo que pode ser mantida a 15 ° C, mas é estéril a 25 ° C. ²⁴ A utilização de FUDR para induzir a esterilidade não é recomendada como este pode, por si só afecta o metabolismo de nemátodos. ²⁵ O ensaio pode também ser realizada em estirpes com cutículas mais permeáveis, tais como perda parcial-do-functião barramento-8 mutantes que são devidos a aumento da permeabilidade de drogas sensíveis a fármacos múltiplos. ²⁶ Isto irá facilitar a exposições mais curtas e baixas concentrações de composto. As condições para a adição de luciferina a estes nemátodos podem também precisam de ajuste ou seja, 1% DMSO e 0,05% de Triton-X100 no buffer de luminescência pode não ser necessária para aumentar a disponibilidade luciferina.

O protocolo usa 1% de DMSO como veículo para a entrega do composto. Embora não letal, esta concentração de DMSO tem alguns efeitos biológicos como já discutido na publicação anterior. ³ Muitas das bibliotecas de medicamentos disponíveis são preparadas em 100% de DMSO, em concentrações que serão adequados para os ensaios baseados em células, após a diluição de veículo a 0,1%. Concentrações de composto mais elevados são necessários para induzir respostas em C. elegans quando comparado com células de origem humana, de tal modo que muitas vezes não é possível realizar ensaios em menor do que 1% de DMSO. Mais uma vez, a utilização de estirpes comcutículas mais permeáveis ​​podem levar a testes com concentrações mais baixas de veículo. As concentrações de DMSO de 1% mais elevada do que não são recomendados.

Um tempo de incubação conjunto com luciferina antes de leituras devem ser respeitados. Como foi mostrado anteriormente, luminescência atinge seus níveis máximos no segundo minuto após a adição de luciferina, permanecendo relativamente estável para o primeiro 5 min, seguido por uma diminuição gradual lento na luminescência ao longo do próximo 30 min ^1. Respostas cinéticas para uma determinada substância química pode ser levada a cabo durante esta etapa inicial de 30 minutos após a distribuição inicial da luciferina.

O protocolo envolve um passo de fome após a coleta de ovos para conseguir a sincronização da população do nematóide. Recomendamos sincronização de populações de nemátodos de teste uma vez que diferentes estágios de desenvolvimento diferem nos níveis de ATP celular e pode responder de forma diferente para os compostos de teste. Ao realizar a fome no S completomédio, por oposição a M9, os nemátodos incubação são fornecidos com uma fonte de carbono (etanol), de modo que as larvas não se desenvolvem, mas não são completamente fome ^27,28. Também tem sido demonstrado que são presos L1 do preparado de resposta rápida ao alimento e L1 taxa de crescimento normal é alcançado dentro de 3 h após o alimento fique disponível. ²⁹ No entanto, a possibilidade de que o passo de jejum pode alterar o metabolismo de C. elegans não pode ser excluída. ³⁰ Por esta razão, o comprimento de fome não deve ser superior a 24 horas (18 horas é suficiente para sincronização). Alguns laboratórios podem ter a possibilidade de utilizar uma Copas Biosorter para sincronização de idade ignorando o passo fome completamente. Outros laboratórios podem ter uma preferência para a expansão da população de nematóides em meio sólido (placas NGM com OP50) antes do branqueamento (passo 3.1) e isso vai funcionar muito bem. Nós usamos meio S durante a exposição composto como um meio padrão para nematóide cultura, however outros meios de comunicação pode ser seleccionado, por exemplo K médio ou EPA moderadamente água dura são frequentemente utilizados para estudos ecotoxicológicos ^31,32.

O protocolo proporciona um meio para rastrear e identificar candidatos para análises adicionais em termos dos efeitos sobre a função mitocondrial. Na fase de rastreio primário, é provável que alguns compostos que foram perdidas devido a uma única concentração a ser testada, por conseguinte, telas de drogas não deve ser considerada exaustiva. Visitas podem ser validados pelo uso de técnicas para avaliar diferentes aspectos da função mitocondrial por exemplo o consumo de oxigénio, C. elegans com estirpes expressando GFP mitocôndrias, manchas de potencial de membrana mitocondrial e / ou medições de ROS. ^16,33,34 A maior importância da metodologia é ter um meio para o rastreio de grande número de compostos e / ou condições ao nível do organismo multicelular, e mais importante, de ser capaz de tirar vantagem do the tratabilidade genética de C. elegans para investigar os mecanismos de ação. A técnica pode ajudar a acelerar e encontrar novos caminhos para a descoberta de compostos e alvos interessantes. Prevê-se que a combinação do sensor com fundos genéticos associados à doença humana para o rastreio de bibliotecas de compostos, num contexto em causa doença terá muito a oferecer.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Orion II Microplate Luminometer	Berthold Detection Systems		with injector and the Simplicity 4.2 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement
FLx800 fluorimeter	Biotek		with Gen5 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement
Ks 130 basic shaking platform	Ika	#0002980000
Innova 4349	New Brunswick Scientific		Refrigerated incubator shaker
Eppendorf centrifuge 5804R	Eppendorf		with eppendorf rotor A-4-44  (for 50/15 ml tubes)
Stripette, Costar	Corning	#4489	Serological pipette
Cellstar 50 ml tubes	Greiner bio-one	#227661
Cellstar 15 ml tubes	Greiner bio-one	#188261
Cellstar 60 mm tissue culture plates	Greiner bio-one	#628160
Superfrost Microscope slides	VWR	#631-0909
Sterile spatula	Corning	#3007; #3004	for weighing out chemicals
0.22 mM Millex GP filters	Millipore	#SLGP033RS
Axygen eppendorf tubes 1.5 ml	Fisher Scientific	#MCT-150-R
Corning 96 well assay plate	VWR	#3603	Black plate clear bottom with lid
Nunc 96 well assay plate	Fisher Scientific	#236105	White plate with lid
Reservoir reagent 60 ml	Thermo Scientific Finnpipette	#9510027	used as trough for nematodes in protocol section 4.4.1
Storage box/damp chamber	Roche Diagnostics	#10 800 058 001	174 x 101 x 56.6 mm, used as a damp chamber with wet paper towels; 2x 96-well plates with lids can fit into one, the lower sitting on top of a microplate lid
Bleach: Sodium hypochlorite solution 4-4.99% Chlorine content	Sigma Aldrich	#239305	Store in aliquots at 4 °C,  seal with Parafilm to prevent loss of chlorine and cover in foil
D-Luciferin, potassium salt	Biotium Inc	# 10101-2	Molecular Probes can also be used as supplier; prepare a 20 mM stock in ddH2O, keep at -20 °C in aliquots
[header]
Tween 20	Sigma Aldrich	# P9416
DMSO	CalBiochem	#317275	Purity 99.99%
Triton X100	Alfa Aesar	#A16046	Diltute to 10% in ddH2O
Nystatin	CalBiochem	#475914
C. elegans bioluminescent strains	Author's own laboratory	PE254, PE255	contain integrated arrays feIs4 and feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] respectively on chromossome V and X; select for homogeneous and strong expression of luc::GFP by fluorescence microscopy (e.g. pick 15 worms) every now and then.
E. coli OP50	CGC
General chemicals	Sigma Aldrich/Fisher Scientific