Un criblables<em&gt; In Vivo</em&gt; Essai de modulateurs mitochondriale utilisant transgénique Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Résumé

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

Résumé

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode’s ATP levels.^1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.^4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

Introduction

L'objectif global de cette procédure est la quantification rapide de l'état énergétique de C. elegans in vivo en vue d'utiliser cela comme un point final dans le dépistage du composé. La raison est basée sur l'expression transgénique de la luciférase de luciole dans le nématode C. elegans ^1-3 par l'intermédiaire du plasmide pSLGCV ⁽¹ https://www.addgene.org/49862). L'enzyme luciférase est fusionnée à la GFP fluorescente verte de la protéine exprimée de manière constitutive et ubiquitaire et dans le cytoplasme (le peroxysome luciférase signal de ciblage a été retiré). Cela conduit à l'émission de lumière lorsque le substrat luciférine est fourni de manière exogène. Comme la vis sans fin est transparente, la lumière peut être mesurée dans un luminomètre en unités lumineuses relatives (RLU). Combustibles ATP cellulaire la réaction de bioluminescence et sa disponibilité détermine les niveaux de lumière produites. Par conséquent, luminométrie offre une convenient signifie d'évaluer les niveaux d'ATP relatifs et, par extension, la fonction mitochondriale, puisque la production de l'ATP se produit principalement dans les mitochondries. Un lien entre les niveaux de fonction, de bioluminescence mitochondriales a été démontré précédemment par le silençage des gènes de la chaîne de transport d'électrons mitochondriaux et sortie de lumière réduite concomitante. ¹

Les souches de bioluminescence générés ont été désignés PE254 (feIs4) et PE255 (feIs5) ¹ (voir la liste des matériaux) et peut être utilisé de manière interchangeable. ³ Un certain nombre d'études ont utilisé ces souches de capteurs de faire rapport sur ​​les niveaux d'ATP cellulaire in vivo suite à l'exposition à divers produits chimiques xénobiotiques tels que l'azoture ^de sodium à 1, le cadmium ^2, les eaux usées extrait des boues ^3, 5'-fluoro-2-désoxyuridine ^6, et une nitrosamine spécifique du tabac ^7. Les souches ont également été utile pour surveiller les effets de l'exposition au rayonnement ultraviolet C 8 et les effets de perturber la fonction respiratoire mitochondriale de la chaîne. ^1,9 Une première version du capteur de luminescence exprimant le gène de la luciférase sans fusion GFP (PE39) a également été utilisé dans l'étude des effets des métaux lourds et d'une respiratoires . découplant ¹⁰ souches PE254 et PE255 portent la luciférase: fusion et GFP fluorescence de la GFP a été montré pour augmenter proportionnellement avec la masse des nématodes, offrant un moyen pratique pour la normalisation des valeurs de luminescence ^6,9 Les effets de la quantité différentielle de vers par puits peuvent aussi être. pris en compte en intégrant les multiples répétitions techniques dans le dosage (un minimum de 5 puits par condition). ³

Le protocole offre la possibilité d'une surveillance in vivo de niveaux d'énergie (par opposition à plus laborieux techniquement déterminations in vitro de l'ATP) permettant de criblage de composés et de repositionnement dans le contexte physiologique de toute une multicellular organisme. La procédure peut être étendue à une variété de fonds génétiques en traversant le transgène intégré dans le chromosome des souches mutantes disponibles et / ou de faire taire des gènes par ARN interférence; Ainsi, en tirant pleinement parti de C. elegans comme organisme modèle. La méthode devrait contribuer à réduire l'échec en phase tardive de candidats médicaments en raison de la toxicité mitochondriale et apporter une contribution à la réduction de l'expérimentation animale supérieur.

Protocole

REMARQUE: Effectuer toutes les mesures dans des conditions stériles (de hotte à flux laminaire) et avec des matériaux pré-stérilisés (par autoclavage à 126 ° C, 11 min). Une plaque LB avec strié sur E. coli OP50 conservé à 4 ° C est nécessaire, stries sur des plaques LB frais et restreak chaque mois.

1. bactérienne des aliments (Escherichia coli OP50) Préparation

1. Jour 1. Inoculer 2 x 5 ml LB dans deux bouteilles universelles avec une seule colonie de E. coli OP50 et lieu à secouer incubateur à 37 ° C (220 rpm) pendant 8 heures.
2. Après 8 heures d'incubation, utiliser 2 ml de E. coli OP50 LB culture pour inoculer chacun de 3 x 200 ml LB. La place des flacons en secouant incubateur (220 rpm) O / N (17 h) à 37 ° C.
3. Peser 20 x 50 ml tubes de centrifugeuse et écrire poids sur le tube.
4. Jour 2. A l'aide d'une pipette sérologique, aliquote de 30 ml de O / N E. culture coli OP50 dans le pré pesé tubes de centrifugation. Centrifugeuse à 7,741 xg, 10 ° C, 8 min.
5. Décanter avec soin le surnageant, maintenir le tube inversé avec couvercle et laisser reposer pendant plusieurs minutes. En utilisant une pipette éliminer tout excès de surnageant qui peuvent avoir été recueillies dans le couvercle. Peser le tube et calculer le poids de la pastille.
6. Calculez le volume nécessaire pour obtenir une suspension de 30 g / L et marquer ce volume sur le tube. La date, l'étiquette et placez tubes à -20 ° C pour une utilisation dans les 1-3 mois ou à - 80 ° C en cas de stockage pendant plus de 3 mois.
7. Préparer suspension bactérienne pour les nématodes croissante; permettre culot bactérien à dégeler et ajouter volume requis de milieu complet ^11,12 S dans chaque tube, vortex pour remettre le culot en douceur, le contenu du bassin de tubes différentes pour obtenir le volume requis. Travailler dans des conditions stériles.

2. Préparation des étalons médicament dans une plaque à 96 puits Format

Remarque: Si l'on utilise une bibliothèque de médicaments, de drogues plaques sont fournies à un seulconcentration du composé dans du DMSO. Criblage primaire permettra de tester des composés à une concentration unique. Suivre les instructions pour la préparation de la plaque de la drogue pour les tests de confirmation composé à une gamme de concentrations entre 0-160 uM, sélectionné après une signification statistique à 10 um. Les étapes ci-dessous peuvent être adaptées pour tester d'autres concentrations.

ATTENTION! Suivez les précautions nécessaires pour la manipulation des médicaments (généralement un masque facial, des lunettes de sécurité, gants sont requis).

1. Préparez la plaque de drogue avec les normes de dépistage de confirmation de travail: Peser la quantité requise du composé dans le tube de 1,7 ml à centrifuger stérile et préparer le composé 16 mM dans du DMSO (c.-à-100x concentré par rapport à la concentration supérieure souhaitée pour l'exposition).
2. Série diluer 16 mM stock 1: 2 dans le DMSO pour obtenir 8, 4, 2, 1, 0,5 et 0,25 mm (normes des conditions stériles). Ceux-ci sont concentrées 100x et seront diluées jusqu'à des concentrations finales de 0 (véhicule seulement),2,5, 5, 10, 20, 40, 80 et 160 uM (% de DMSO à 1) au cours de l'exposition au médicament.
3. Dans une hotte à flux laminaire, placez 20-50 pi par puits de normes de composés dans une colonne d'une plaque de 96 puits, par exemple la position de la plaque A1: 16 mm, B1: 8 mm, C1: 4 mm, D1: 2 mm, E1: 1 mM, F1: 0,5 mM, G1: la drogue 0,25 mm et H1: DMSO. Utilisez différentes colonnes pour la série de dilution de différents médicaments.
4. Véhicule Aliquoter dans les puits de la colonne 12 dans la plaque de médicament.
   NOTE: Ce sera de faciliter le test de contrôle du véhicule vers le bas des colonnes, en plus de l'essai le long de la rangée H, veiller à ce que véhicule est testé dans des positions représentant de toute la plaque.
   REMARQUE: Chaque plaque de la drogue pour le dépistage de confirmation détient série de dilution pour un maximum de 11 médicaments différents à tester ainsi que le contrôle du véhicule.
5. Étiquette et plaque d'étanchéité, couvrir d'un papier et le lieu à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire.

3. Expériences de nématodes

NOTE: Effectuer toutes les étapes uelon des conditions stériles, aseptiques et avec des matériaux et des réactifs de pré stérilisé. Maintenir C. elegans souches régulièrement sur ​​des plaques NGM avec E. coli OP50. ¹² timings suggérés pour les différentes étapes du protocole sont fournis dans le tableau 1.

1. Jour 1 tâche: mettre en place une culture liquide de la souche de biocapteur pour la synchronisation ultérieure.
   1. Prenez nématodes d'une plaque de NGM 6 cm (avec beaucoup de jeunes larves où la nourriture vient à exécuter) dans 2 ml S complète et transférer au ballon avec 30 g / L E. coli OP50 en S complet (volume total de 30 ml dans 250 ml de capacité, une fiole conique en verre). Incuber 3 jours à 20 ° C, 160 tours par minute.
2. Jour 4 tâche (prévoir environ 30-35 min): la culture de l'eau de Javel pour récolter des œufs et de synchroniser population de vers. Effectuer toutes les étapes de centrifugation pendant 1 min, 600 x g.
   1. Préparer une solution d'eau de Javel juste avant utilisation: à chaque 16 ml de 0,156 M KOH / NaOH ajouter 4 ml eau de Javel.
   2. Verser 2 x 14 mlla culture du ver en tubes de 15 ml de centrifugation coniques. Autoriser les vers à déposent par gravité (3 min). Retirez et jetez liquides nématodes ci-dessus établis. Ajouter 5 ml de solution d'eau de Javel pour chaque tube et commencer à minuterie. Combiner des volumes en un seul tube.
   3. Inversez le tube doucement pendant 2 min, vérifier sous stéréoscope pour la rupture de vers et de la libération des ovules en suspension. Quand la plupart des œufs sont libérés ou à un temps maximum de 2 minutes dans la solution de blanchiment, la centrifugeuse.
   4. Retirer le surnageant avec précaution. Laver 1x culot avec 14 ml S complète et centrifugeuse.
   5. Rejeter le surnageant, ajouter la solution d'eau de Javel de 10 ml et démarrer la minuterie (cette deuxième étape de blanchiment assure que la plupart des carcasses de ver se désintègrent et ne sont plus considérés sous stéréoscope). Après un temps maximum en solution d'eau de Javel de 2 min, centrifugeuse.
   6. Laver culot 3x S complète, décanter doucement surnageant et remettre le culot dans 14 ml S complets après chaque centrifugation. Après lavage final, granulés remettre en suspension d'oeuf dans 14 ml S cemplissez.
   7. Transférer le volume d'un ballon en verre conique. Incuber 18-24 heures à 20 ° C, 160 rpm.
      NOTE: Récolté œufs éclosent O / N et d'arrêter le développement au premier stade larvaire (L1) en raison du manque de nourriture, d'où ils seront tous au même stade de la croissance.
3. Jour 5 tâche: mettre en place des cultures de ver synchronisés pour les dosages de médicaments.
   NOTE: Worms en suspension dans le milieu de la famine ont tendance à adhérer aux surfaces plastiques hydrophobes tels que des conseils et des tubes pipette. 0,01% de Tween-20 est un agent tensio-actif utilisé ici pour rendre les surfaces en plastique plus hydrophile et permettre une plus grande précision dans le comptage (0,01% de Triton-X100 peut également être utilisé). Lorsque les nématodes sont dans le milieu supplémenté bactérienne, ils ne ont tendance à coller au plastique.
   1. Déterminer le nombre de L1 éclos dans son flacon, garder ballon sur la plateforme (160 rpm) secouant.
      1. Prenez 3x 100 échantillons ul du flacon (utiliser une pointe propre à chaque fois) dans 1,7 ml microtubes séparés avec 900 ul de liquide moyen 0,01% de Tween-20.
         REMARQUE: Aspire 100 pi d'échantillon dans la pointe propre qu'une seule fois. Ensuite, lors de la distribution, une pipette de haut en bas à quelques reprises dans le milieu entre complété à libérer tous les vers qui adhèrent à la pointe.
      2. Comptez le nombre de nématodes dans 4X 10 gouttelettes ul de chaque tube de dilution triple. Calculer valeur moyenne et d'estimer le nombre de vers présents dans le flacon de verre conique.
   2. Calculer le volume de éclos suspension de nématodes nécessaire pour mettre en place une culture ml 2 x 20 avec 10 nématodes par 10 pi. Augmenter le volume calculé de 10% pour tenir compte des pertes de nématode ultérieur au cours des étapes de centrifugation.
   3. Décanter le volume nécessaire en 2 x 15 ml tubes de centrifugation (pré-pesé). Peser tubes pour obtenir le volume réel distribué, vortex doucement et ajuster au volume cible en éliminant les excès de volume avec une pipette de 5 ml (seulement la pointe stérile doit entrer dans le tube).
   4. Maquillage volume à 14 ml avec S frais complets d'étéh nématodes. Centrifugeuse (1 min, 600 g). Retirez et jetez surnageant avec soin de ne pas perturber le culot de nématodes.
   5. Ajouter 5 ml de S avec 30 g / L E. coli OP50 aux nématodes culot. Transférer les 5 ml dans chaque tube à un flacon en verre contenant 15 ml conique S complets avec 30 g / L E. coli OP50. Notez nématodes de temps ont d'abord été fournis avec de la nourriture.
   6. Secouer doucement flacon (160 rpm), prendre 9 x 10 pi de gouttelettes sur des lames microscopiques (conseils utilisent fraîches à chaque fois) pour compter les nématodes et confirment moyenne d'environ 10 (± 2) par 10 pi.
   7. Placez flacons de nématodes à secouer incubateur à 20 ° C, 160 rpm pendant 42-44 h.
4. Jour 7 tâche: transfert nématodes plaques à 96 puits et initier l'exposition au médicament.
   1. Mélanger les cultures de nématodes dans un seul flacon, garder remuant doucement ballon et placer 3 x 4 ml de culture de nématodes dans une cuvette de 60 ml stérile. Placez creux sur une plateforme agitation (160 rpm).
   2. Utiliser 8 channel pipette pour partie aliquote de 25 ul nématodes en suspension par puits de 96 plaques de microtitration bien noir avec un fond plat transparent (pour prendre deux lectures de luminescence et de fluorescence, ou plaques blanches pour la luminescence seulement). Couvrir avec le couvercle de la plaque et mettre de côté.
      1. Après mise en place de tous les 2 plaques, placer encore 2 x 2,5 ml nématodes dans auge pour remplacer le volume perdu (garder un «volume mort» en creux d'environ 7 ml).
      2. Mettre en place 13/14 plaques avec des nématodes. 11 plaques de nématodes seront nécessaires pour tester deux plaques de drogue de 96 puits. La plaque de nématode 12 ^ème sera chargé exclusivement de véhicule comme témoin. ^La 13 ème plaque sera utilisée pour établir la fluorescence de fond au jour 8 (voir ci-dessous). Une plaque supplémentaire peut être préparé pour être utilisé devraient erreurs se produire pendant la configuration.
   3. Aliquoter 74 pi de S complets à chaque plaque et bien lieu dans une chambre humide (voir la liste des matériaux) dans un incubateur à agitation (20 ° C, 160 rpm) until prêt à des composés d'essai aliquote au moment présélectionné développement (par exemple, 45 h 30 min après le repas fourni). [Volume par puits est maintenant 99 pi].
   4. Dégeler plaque (s) du médicament à l'essai.
   5. Utilisez la pipette multicanal de mettre en place des plaques de nématodes à la drogue, en changeant à chaque fois des conseils. Laisser 5 minutes par plaque de 96 puits pour l'aliquotage drogue.
      1. Prendre 1 pi de 1 ^{ère colonne} de la plaque de drogue et d'ajouter des colonnes 1-5 d'une plaque contenant les nématodes; répéter de ² ème colonne dans la plaque de la drogue dans les colonnes 8-12 de la plaque contenant les nématodes. Ajouter 1 pi de véhicule à colonnes 6 et 7 de la plaque de nématode.
         NOTE: Le volume total par puits dans la plaque de nématode est 100 ul résultant en une dilution de 1: 100 de composé / véhicule.
      2. Répéter l'opération en ajoutant 1 ul de la / 4 ^ème colonne ³ e de la plaque de médicament à colonnes 5.1 / 12.8 de la seconde plaque de nématodes; ajouter véhicule à colonnes 6 et 7 de la plaque de nématode.
      3. Continuer à tester restants colonnes de la plaque de la drogue. Mise en place d'au moins une plaque de nématode, le véhicule étant dans tous les puits en échantillonnant de colonne 12 de la plaque de médicament. La place plaques arrière dans des chambres humides en secouant incubateur (20 ° C, 160 rpm) pendant 20-22 heures (voir la note pour la journée 8).
   6. Partiel préparer le tampon de luminescence pour le lendemain: ajouter du DMSO et 10% de Triton-X-100 pour le volume requis de S complet pour obtenir 1% de DMSO et 0,15% de Triton X-100. Autoriser 5 ml par plaque de lecture pour la luminescence, plus 1 ml pour l'amorçage injecteur de luminomètre.
5. Jour 8 tâche: Lire paramètres expérimentaux - fluorescence et bioluminescence. (GFP lectures de fluorescence sont recommandés comme un moyen pour normaliser les données de bioluminescence).
   REMARQUE: But de lire extrémités par 66-67 heures après la nourriture fournie aux nématodes dans le but de prévenir la production de descendance significative dans les conditions expérimentales décrites.
   1. Mettre en place la plaque à utiliser comme témoin de fond pour les lectures de la GFP. Combine ainsi le contenu du ¹³ ème plaque dans un tube de 15 ml. Permettre aux nématodes à régler (2-3 min). Utiliser le surnageant de charger une microplaque (noir avec fond transparent) avec 100 suspension bactérienne par puits.
      1. Observez plaque de commande de fond sous le microscope notant puits où les nématodes peuvent être vus. Exclure de l'estimation de fond utilisé dans l'analyse ultérieure des données.
   2. Lire la fluorescence de chaque plaque de 96 puits, y compris le contrôle de fond. (Réglages: optique de bas de la plaque; filtres 485/20 excitation; 528/20 émission.)
   3. Préparer le tampon de lecture de luminescence: ajouter luciférine (20 mM) pour la pièce préparée tampon (à partir du jour précédent), pour obtenir un tampon de luminescence avec 1% de DMSO (1x), 0,15% de Triton-X100 (3x) et 0,3 mM de luciférine (3x ). Premier luminomètre injecteur 6x avec 150 ul de tampon de luminescence.
      1. Une étape précédente suppose% de DMSO comme véhicule au cours de l'exposition au médicament. Lorsque le véhicule est de l'eau, ajuster la concentration de DMSO dans du tampon de luminescence à 3% (soit 3 x).
   4. Travailler avec une plaque à la fois. Distribuer 50 pi de tampon de luminescence par puits. (150 volumes ul finale dans bien; 3x dilution du tampon de la luminescence: 1% de DMSO, 0,05% de Triton-X100 et 0,1 mM concentrations luciférine finales.) De place immédiatement sur la plate-forme secouer et commencer à minuterie.
      1. Après 3 min sur la plateforme (160 rpm) secouant, lisez la luminescence (1 s par la mesure).

Analyse des données 4.

1. Soustraire moyenne GFP lecture de fond à partir des résultats de fluorescence. Divisez la bioluminescence par la lecture de la GFP respective.
   1. Quand une valeur élevée de la GFP est détectée pour les nématodes exposés à un composé, mesurer la fluorescence du composé en soi pour rendre compte de tout composé de fluorescence. Si supérieur à la moyenne, l'utiliser comme arrière-plan à la place.
2. Bioluminescence Express, une bioluminescence GFP normalisénd données de fluorescence de la GFP en tant que pourcentage de la valeur moyenne pour le contrôle du véhicule dans chaque plaque.
3. Tracer des valeurs moyennes et les barres d'erreur pour chaque concentration.
4. Test de signification statistique en utilisant 2-analyse de variance (Anova) avec des effets de «concentration», «Expérience» et leur interaction (chaque point de données se réfère à un seul puits), et utiliser le test de Dunnett comme test post-hoc (vs . le contrôle du véhicule).
   NOTE: Si l '«expérience» ou les termes "d'interaction" sont importants, d'autres expériences peuvent être nécessaires pour confirmer la réponse. Où pas de variabilité entre les expériences est d'une observation de parcelles de données, une ANOVA à un facteur peut être effectuée sur des données regroupées provenant expériences indépendantes.
   1. Pour l'analyse statistique de la plaque (s) uniquement avec le véhicule, sélectionner tous les puits dans les colonnes 6 -7 et tous les puits de la rangée H comme groupe de contrôle (ce sont les positions systématiquement affectés à véhicule pendant les essais en enclos).

Résultats

Les résultats représentatifs pour illustrer la méthode ont été obtenus pour la roténone (figure 1), le paraquat (figure 2), l'oxaloacétate (figure 3), et 4 des composés qui ont été captés comme inhibiteurs de luciole luciférase pendant le criblage d'une bibliothèque de médicament ¹³ (Figure 4). L'exposition au médicament a été lancé au stade L4 dans tous les cas, mais les expériences d'exposition du paraquat avaient commencé à 41 heures après la nourriture d'abord fourni aux nématodes comparativement à 45-46 heures pour les autres composés. Le protocole permet une certaine souplesse dans le choix du temps pour l'ouverture de l'exposition au médicament et la durée d'exposition. Cependant, à des fins de dépistage, de définir les heures doivent être respectées une fois sélectionné, pour la reproductibilité entre les expériences. Endpoints doivent être mesurés par 66-67 h temps de développement afin d'éviter une vaste ponte et l'éclosion de la progéniture dans les puits. Lignes directrices pour les timings sont fournis dans Tmesure 1.

La roténone, un complexe mitochondrial I inhibiteur, réduit bioluminescence après que les deux relativement courtes (2 heures) et des expositions plus longues (24 h) à une gamme de concentrations (Figure 1). Dans ce cas, aucune mesure de GFP ont été prises, mais le nombre de répétitions techniques utilisées (n = 6) est suffisante pour égaliser les différences dans le nombre de vers entre les puits ^3. L'exposition de 24 h est une fenêtre de temps pendant laquelle les nématodes se développent, et le développement plus lent en raison de l'inhibition complexe I était censé contribuer à la baisse de la bioluminescence. Cela a été confirmé par l'observation visuelle sous stéréoscope avec un retard de développement vu, en particulier à des concentrations de 20 um et ci-dessus; En outre, certains létalité a été remarqué à partir de 40 pm (observations qualitatives pas quantifiés). Aucune létalité a été observée après une exposition de 2 heures, mais les effets sur les mouvements du ver ont été vus. Une forte baisse de la bioluminescence par rapport aux témoins OCCURRED à la plus faible concentration de roténone testés 2,5 um, pour lesquels les effets ne sont pas facilement détectées par l'observation visuelle rapide à 2 h de l'exposition. Cette baisse de la bioluminescence est compatible avec ATP cellulaire réduite. L'inhibition maximale a été obtenue avec la plus faible concentration de la roténone utilisé (2,5 uM) indiquant que toutes les expériences ultérieures ciblant spécifiquement la roténone doivent être effectuées entre 0 et 5 uM de [la gamme de concentration de 0 à 160 uM a été choisi dans le cadre d'une comparaison avec d'autres médicaments initialement identifiés comme ayant des effets significatifs à 10 um (à être publiés ailleurs)].

L'herbicide paraquat affecte la fonction mitochondriale par augmentation d'espèces réactives de l'oxygène. Ici, nous démontrons son effet sur ​​la bioluminescence de C. elegans souche PE254 après une exposition à une gamme de concentrations pour 24 heures (Figure 2). Comme la souche porte un luc :: fusion GFP, fluorescence de la GFP était also mesurée en tant que moyen de normalisation. Paraquat a diminué de ^6,9 bioluminescence, fluorescence de la GFP et la bioluminescence normalisée de manière significative. Le test post-hoc Dunnet a indiqué que les concentrations de paraquat avec des différences significatives en matière de contrôle du véhicule étaient 4 et 8 mm pour la bioluminescence et bioluminescence normalisée, ainsi que 2 mm pour bioluminescence normalisée. La seule concentration réduisant de manière significative la fluorescence de la GFP était de 8 mM, une concentration à laquelle des effets de la croissance et le ver morts occasionnels ont été observés (observations qualitatives). La diminution de la bioluminescence (bioluminescence et normalisé) était supérieure à celle de fluorescence, conformément à la diminution de la fonction et les effets sur la production d'ATP mitochondrial.

L'oxaloacétate intermédiaire du cycle de l'acide citrique testé sur C. elegans souche PE254 à une concentration unique de 8 mm, a conduit à une augmentation de la bioluminescence (Figure 3). Pas une fluorescence GFPnce mesures ont été obtenus ou l'observation visuelle supplémentaire effectuées; Cependant, une telle réponse à une concentration unique mériterait davantage l'exposition de confirmation à une gamme de concentrations, et des observations plus détaillées sur les effets. Une amélioration de la bioluminescence par ce composé est pas surprenant que cela peut supposer de conduire à une plus grande activité du cycle de l'acide citrique, avec finalement une plus grande production d'ATP (néanmoins, il serait souhaitable de contrôler les éventuels effets sur les niveaux de luciférase en évaluant fluorescence de la GFP dans des expériences ultérieures). Les ensembles de données d'oxaloacétate présentés révéler l'étendue de la variabilité de la réponse observée dans les expériences à base de luciférase. Dans notre expérience, cette variabilité est une caractéristique du système de test particulier pour les conditions d'exposition, moins attentatoires.

La luciférase de luciole composés inhibiteurs DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 et DDD00023047 ont été testés in vitro en regardant les effets sur le PUrified enzyme et in vivo en utilisant le C. elegans luc: GFP exprimant souche. Il n'y avait aucune preuve que des composés testés a causé la mort de nématodes dans les conditions d'exposition. Tous les 4 composés affectés de l'activité luciférase in vitro aux concentrations testées 2 et 100 uM 25 (figure 4A). DDD00001434 tué l'activité de la luciférase purifiée presque complètement, ce qui a fourni une justification crédible pour la forte baisse de la bioluminescence in vivo (figure 4B). Bien que, in vitro et in vivo ne sont pas directement comparables, la réponse à DDD00023047 était similaire dans les deux essais. DDD0001477 et DDD00000635 provoqué une diminution plus importante in vivo que in vitro. Ces composés ont été fournis pour les vers de terre vivants 22 heures avant le substrat de luciférine, et les résultats peuvent refléter qu'ils ne se déplacent pas facilement à partir du site actif de la luciférase lorsque luciférine est devenu available. Alternativement, DDD0001477 et DDD00000635 peuvent avoir un effet supplémentaire sur les niveaux ATP cellulaire. Ce devrait être évalué par des moyens qui ne comportent pas la luciférase de luciole. De la note était la forte amélioration de signal de la GFP dans des vers vivants exposés à aggraver DDD00000635. Cette question sera discutée ci-dessous.

Figure 1. Le complexe mitochondrial I inhibiteur de la roténone a diminué le statut énergétique de C. elegans bioluminescence tel que mesuré par la souche PE254. synchronisé de la scène vers L4 (45-46 h après l'alimentation fournie aux larves L1) exposée à 0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 et 160 uM de la roténone dans DMSO 1% pour 2 h (court) ou 24 h (exposition longue) des lectures antérieures de bioluminescence respectivement à 48 et 69 h de développement du ver après la nourriture disponible. Bioluminescence (unité relative de lumière parts, RLU) ont été exprimées en pourcentage du véhicule (1% DMSO) des valeurs. Les barres d'erreur représentent SEM de répétitions techniques à chaque concentration de roténone (n = 6). Toutes les concentrations testées ont donné lieu à une différence statistiquement significative par rapport au contrôle du véhicule (p <0,001).

Figure 2. Le paraquat oxydatif de stress a diminué le statut énergétique de C. elegans souche PE254 d'une manière dépendant de la concentration (mesuré par bioluminescence). des vers à étages synchronisée L4 (pour plus de commodité dans ce cas à 41 heures après l'alimentation fournie aux larves L1) ont été exposés à 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4 ou 8 paraquat mM pendant 24 heures. Fluorescence de la GFP (Unité des unités relatives de fluorescence, RFU) a été utilisé pour normaliser les données de bioluminescence (unité RLU), les deux extrémités obtenus à 65 le développement des RH. Les données sont exprimées en pourcentage du contrôle (1% de DMSO). Les barres d'erreur représentent SEM de répétitions techniques(n = 5 pour des concentrations différentes; n = 18 pour les témoins). Une ANOVA à un facteur: *** p <0,001 par rapport au contrôle du véhicule.

Figure 3. Le cycle de l'acide citrique oxaloacétate intermédiaire (8 mM) a amélioré la bioluminescence de C. elegans souche PE254. les vers de la scène synchronisée L4 (45-46 heures après la nourriture fournie aux larves L1) ont été exposés à fraîchement préparé mM oxaloacétate 8 pendant 18 h ± 30 min. Bioluminescence (unité AVC) a été lue à un temps de développement de 63,5 h ± 1 heure et a été exprimée en pourcentage du contrôle du véhicule (ddH _{2 O).} Différentes colonnes représentent différents ensembles de données de 8 réplicats technique alloués aux différentes plaques à 96 puits à l'intérieur de la même expérience. Les barres d'erreur représentent SEM de répétitions techniques (n = 8). 2-Way ANOVA avec 'set' et 'concentration' en tant que facteurs: ̵6; Set 'p> 0,05, «concentration» p <0,001 et terme d'interaction p> 0,05.

UN

B

Figure 4. Test des réponses aux 4 composés de la découverte de médicaments bibliothèque Dundee composé ¹³ (C1: DDD00001434, C2: DDD0001477, C3: DDD00000635 et C4: DDD00023047) avec une activité inhibitrice connue sur la luciférase de luciole luminescence. (A) Effet des composés sur l'activité de la luciférase de luciole purifiée de (mesurée en unités lumineuses, RLU), exprimée en pourcentage de contrôle du véhicule. Le kit de bioluminescence CLSII ATP (Roche, Manheim, Allemagne) a été utilisé conformément aux instructions de la même quantité d'enzyme luciférase aliquotée aux puits (blanc 96-well Les plaques de microtitration). ATP a été fourni à une concentration finale de 10 uM et 1 pl de composé (concentration finale indiquée) ou du DMSO (1%) a été ajouté. Signal de luminescence a été intégrée pendant 10 sec. Les barres d'erreur représentent SEM de répétitions techniques (n = 4). Analyse: L'analyse de variance; * p <0,05 ou *** p <0,001 par rapport au contrôle du véhicule. Les différences entre 25 et 100 uM très importantes pour C1 (DDD00001434; p <0,001) et significative pour C2 et C3 (respectivement DDD0001477 et DDD00000635; p <0,05). (B) dans des mesures in vivo de la bioluminescence, la bioluminescence normalisées par rapport à la fluorescence de la GFP et fluorescence GFP de C. elegans souche PE254 à 67 h temps de développement après une exposition à des composés d'essai pendant 22 heures. Les barres d'erreur représentent SEM de répétitions techniques (n = 8). L'analyse statistique (Une façon-analyse de la variance) réalisé sur les données regroupées de 3 ensembles de données (3 xn = 8). * p <0,05 ou *** p <0,001 par rapport au contrôle du véhicule respectif. DifférenCES entre 25 et 100 um seulement statistiquement significative (p <0,05) pour la bioluminescence normalisée après une exposition à C4 (DDD00023047).

Moment de la journée	Jour 1	Jour 2	Jour 3	Jour 4	Jour 5	Jour 6	Jour 7	Jour 8
9-10								Etape 5
10-11								Etape 5
11-12							Étape 4	Etape 5
12-13							Étape 4
13-14
14-15
15-16
16-17	Étape 1				Etape 3
17-18
18-19				Étape 2

Tableau 1. Aperçu des étapes du protocole à effectuer chaque jour des expériences de nématodes (article 3) et a suggéré timings.

Discussion

L'organisme modèle C. elegans fournit un système expérimental puissant. Il est facile de culture et de produit abondante descendance génétiquement identique à un cycle de vie de 3,5 jours de l'œuf à reproduire adultes (via stades larvaires juvéniles L1 à L4). En raison de sa petite taille, il peut être facilement cultivées dans des plaques à 96 puits, ce qui facilite le dépistage de composé. Nous présentons un protocole de dépistage phénotypique basé sur les souches de C. elegans qui agissent comme des capteurs in vivo de niveaux d'énergie. ¹⁴ Le protocole est applicable à tout laboratoire, bien que d'un luminomètre de plaque de 96 puits et une enceinte stérile est nécessaire. Il est important pour éviter la contamination dans des essais en utilisant une bonne technique de laboratoire. Si l'on travaille à la main, le nombre maximal de plaques de nématodes est réalisable par 13 expérience permettant l'essai de 2 x 96 puits des plaques de drogues et comprenant deux plaques de véhicules. Les résultats représentatifs sont présentés pour le complexe mitochondrial I inhibiteur rotenone, le paraquat générateur de superoxyde, le cycle de l'acide citrique et l'oxaloacétate intermédiaire de quatre composés ayant une activité inhibitrice connue luciférase de luciole. Les deux premiers composés ont entraîné une diminution de la bioluminescence comme prévu tandis oxaloacétate conduit à une amélioration, susceptible d'entraîner une plus grande génération de l'ATP. Les ensembles de données d'oxaloacétate montrent également la variabilité intrinsèque dans des expériences sur la base de la luciférase de luciole comme reporter. Un minimum de trois expériences indépendantes sont conseillé de vérifier la robustesse des réponses à des composés inconnus.

L'inhibition de l'activité de la luciférase de luciole a été identifiée à l'aide d'un dosage in vitro en utilisant un kit commercial. ³ L'un des composés a donné lieu à une augmentation substantielle de la fluorescence de la GFP en accord avec l'inhibiteur augmentant les niveaux de GFP-étiqueté luciférase de luciole par liaison à l'enzyme luciférase Active site, et de la rendre plus stable. ¹⁵ Dans certains cas,(pas dans ce cas particulier), cela peut conduire à des niveaux accrus de bioluminescence lorsque l'inhibiteur est déplacée par un excès de substrat. ¹⁵ Il est donc important de ne pas interpréter les résultats à tort à partir de composés qui interagissent avec l'enzyme de luciole que les niveaux d'ATP diminué ou augmenté / fonction mitochondriale. Changements dans signal de luminescence corrélation assez souvent avec des mesures supplémentaires de la santé telles que le mouvement, le développement et la croissance. A titre d'exemple, un composé est un inhibiteur de la luciférase suspect si une baisse spectaculaire de signal de bioluminescence est détecté, mais les vers sont indifférenciables des contrôles par l'observation microscopique. Une augmentation de la fluorescence de la GFP, par pas expliqué croissance ou d'un composé auto-fluorescence, peut également désigner un inhibiteur. Un certain nombre d'inhibiteurs de la luciférase ¹⁵ sont connus et ont été conclu PubChem. Par conséquent, dans le premier cas, il est de bonne pratique pour consulter des informations sur les inhibiteurs de la luciférase détenues par PubChem; suivie de tles effets intéres- de composés dans des dosages in vitro avec l'enzyme purifiée ³ et / ou la confirmation d'effets sur la fonction mitochondriale par des moyens supplémentaires. ^16,17

Des mesures de fluorescence de la GFP permettent la détection de niveaux de luciférase de luciole (et la détection potentielle de certains inhibiteurs de l'enzyme luciférase tel que discuté ci-dessus) faire un dossier solide pour mesurer ce critère aux côtés de bioluminescence si possible. La normalisation des lectures de bioluminescence à la GFP est également un moyen pour comptabiliser les variations du nombre de vis sans fin entre les puits (même si cela peut également être réalisé par de multiples répétitions inclusion techniques). Pour une plus grande sensibilité, il est important de soustraire la fluorescence de fond à partir de lectures. Le protocole évalue la contribution de la suspension bactérienne à la fluorescence de fond, cependant nématode autofluorescence ne sont pas comptabilisés (une limitation de l'essai en cours, particulièrement critique pour toute stu vieillissementmatrices étant donné que les nématodes autofluorescence augmente avec l'âge). Autofluorescence des composés d'essai devrait également être évaluée en parallèle. GFP normalisation semble indispensable où les chercheurs souhaitent adapter le protocole de comparer piscines ATP cellulaires dans différents mutants génétiques ou après taire des gènes différents, afin de contrôler d'éventuelles différences de contrainte au niveau de l'expression du transgène de bioluminescence.

Les paramètres critiques au sein du protocole comprennent le stade de développement auquel l'exposition est initiée, la durée d'exposition, et l'obtention d'un nombre similaire de nématodes dans différents puits. L'exposition peut commencer à tout stade de développement des nématodes, toutefois stade L3 ou plus est préférable. Partir de ce stade, les nématodes dépendent de la phosphorylation oxydative pour le développement à l'âge adulte, comme en témoigne une augmentation très significative de la teneur de l'ADNmt, consommation d'oxygène et les niveaux d'ATP. ^18,19,20 Le présent protocole initie exposure au stade L4. La raison de l'aliquotage nématodes à plaques à 96 puits seulement à ce stade (plutôt que quand ils ont d'abord été fournis avec de la nourriture au stade L1), est que, bien que les plaques sont placées dans des chambres humides pour minimiser l'évaporation, un degré d'évaporation se produit encore dans notre incubateur agitateur, vu que de très petites gouttelettes se forment sur les couvercles (cela peut ne pas être un problème avec les autres incubateurs serrant). En aliquotant nématodes à plaques juste avant ajout de normes de drogue, la concentration réelle de la drogue est pas affectée par une faible variation de volume due à l'évaporation. Chargement d'une plaque de nématodes uniquement avec le véhicule est utile pour vérifier que les nématodes étaient réparties uniformément entre les puits. Toute différence significative n'a été trouvée pour le véhicule ne serait plaque indicative de mauvaise technique dans la distribution des nématodes aux puits.

La durée d'exposition est un facteur important à considérer. Si les effets sur l'état de l'énergie indépendamment de la croissance sont d'intérêt, la proprotocole peut être modifié pour accueillir des expositions plus courtes (de réponses quasi immédiates, par exemple, 2 h). D'autre part, l'entrée de composés en C. tissus elegans peut prendre un certain temps. Par exemple 12-24 h sont nécessaires pour atteindre des concentrations maximales internes du resvératrol et 5-fluoro-2'-désoxyuridine (FUDR). ²¹ Par conséquent, une exposition plus longue (18 à 24 h) peut être justifié de maximiser les niveaux d'exposition. Le temps d'exposition doit être limitée à des moments qui ne permettent pas des niveaux significatifs de la reproduction de prendre place dans le puits. Nous recommandons que le temps total de développement de nématodes est maintenu sous 66-67 heures. Bien que pratique, les nématodes sont gravides d'ici là et ont lancé egglaying. Néanmoins, nous avons trouvé des lectures de bioluminescence à partir de préparations d'œuf comme négligeable (non représenté). Le entraîné l'expression du transgène sur-5 promoteur est d'abord détecté que deux à deux heures et demie après la fécondation au stade 100 de la cellule ^{22 et le} ccoquille hitinous est susceptible de limiter l'entrée de la luciférine. D'autres ont trouvé que les œufs embryonnés ne contribuent pas de façon significative au métabolisme des adultes gravides. ²³ Cependant, des conditions permettant la production de la progéniture significative sont à éviter. Si l'on préfère, l'échelle de temps expérimentale peut être décalée en arrière: nous avons déjà initié l'exposition à une toxine de l'environnement à la fin L3 stade larvaire (36 h) et réalisé bioluminescence et GFP mesures à 55 h ² milieux Alternativement, génétiques qui sont conditionnellement stérile. peut être utilisé pour prévenir la production de la descendance, comme par exemple le fer-15 (b16) II; fem-1 (HC17) IV double mutant qui peut être maintenue à 15 ° C, mais est stérile à 25 ° C. ²⁴ L'utilisation de FUdR pour induire la stérilité est déconseillé car cela peut en soi affecter le métabolisme des nématodes. ²⁵ Le test pourrait également être effectuée dans des souches avec cuticules plus perméables tels que partielle perte de fonction bus-8 mutants qui sont multirésistante sensible en raison d'augmenter la perméabilité des médicaments. ²⁶ Cette faciliteront expositions plus courtes et les concentrations de composés inférieurs. Les conditions pour l'ajout de luciférine de ces nématodes peuvent aussi avoir besoin de réglage soit 1% de DMSO et 0,05% de Triton-X100 dans le tampon de luminescence ne peuvent être nécessaires pour améliorer la disponibilité de la luciférine.

Le protocole utilise 1% de DMSO comme véhicule pour la livraison de composé. Bien que non létale, cette concentration de DMSO a des effets biologiques comme nous l'avons décrit dans une publication antérieure. ³ La plupart des bibliothèques de médicaments disponibles sont préparées dans 100% de DMSO, à des concentrations qui seront appropriés pour des dosages à base de cellules après dilution de véhicule à 0,1%. Des concentrations plus élevées de composés sont nécessaires pour obtenir des réponses en C. elegans en comparaison avec les cellules humaines, de telle sorte qu'il est souvent impossible de réaliser des dosages à moins de 1% de DMSO. Encore une fois, l'utilisation de souches aveccuticules plus perméables peuvent conduire à l'essai avec des concentrations plus faibles de véhicules. Les concentrations de DMSO supérieure à 1% ne sont pas recommandées.

Un temps de jeu incubation avec luciférine avant lectures doit être respecté. Comme indiqué précédemment, la luminescence atteint ses niveaux maximaux dans la deuxième minute après l'ajout de luciférine, en restant relativement stable pendant les 5 premières minutes, suivie d'une diminution lente et progressive de la luminescence cours des 30 prochaines min ^1. Kinetic réponses à un produit chimique particulier peuvent être effectuées au cours de cette phase initiale de 30 minutes après la distribution initiale de luciférine.

Le protocole implique une étape suivante de famine collecte des œufs pour réaliser la synchronisation de la population de nématodes. Nous recommandons synchronisation des populations de nématodes de test depuis différents stades de développement différents dans les niveaux d'ATP cellulaire et peuvent réagir différemment aux composés d'essai. En effectuant la famine dans S complètemoyen par opposition à M9, les nématodes à couver sont munis d'une source de carbone (éthanol), de sorte que les larves ne se développent pas, mais ne sont pas complètement affamés. ^27,28 Il a également été montré que arrêté L1 de sont amorcées de réponse rapide à l'alimentation et L1 taux de croissance normal est atteint dans les 3 heures après le repas est disponible. ²⁹ Cependant, la possibilité que ce l'étape d'inanition peut modifier le métabolisme de C. elegans ne peut pas être exclue. ³⁰ Pour cette raison, la longueur de la famine ne doit pas dépasser 24 heures (18 heures est suffisante pour la synchronisation). Certains laboratoires peuvent avoir la possibilité d'utiliser un Copas Biosorter pour la synchronisation d'âge contournant l'étape de la famine tout à fait. D'autres laboratoires peuvent avoir une préférence pour élargir la population de nématodes sur un milieu solide (plaques NGM avec OP50) avant le blanchiment (étape 3.1) et cela va bien fonctionner aussi. Nous utilisons moyen S lors de l'exposition composé comme un moyen standard pour nématode culture, uter autres médias peuvent être choisis, par exemple support K ou EPA modérément l'eau dure sont souvent utilisés pour les études écotoxicologiques. ^31,32

Le protocole fournit un moyen de dépister et d'identifier des candidats pour des tests supplémentaires en termes d'effets sur la fonction mitochondriale. À l'étape de criblage primaire, il est probable que certains composés auront été interrompue en raison d'une concentration unique en cours de test, par conséquent écrans de médicaments ne doivent pas être considérées comme exhaustives. Résultats peuvent être validés par l'utilisation de techniques pour évaluer les différents aspects de la fonction mitochondriale à la consommation d'oxygène par exemple, C. elegans souches de GFP exprimant mitochondries, les taches sur le potentiel de membrane mitochondriale et / ou mesures ROS. ^16,33,34 la plus grande importance de la méthodologie est d'avoir un moyen de dépistage grand nombre de composés et / ou des conditions au niveau de organismal multicellulaire, et, surtout, pour être en mesure de profiter de ee traçabilité génétique de C. elegans pour étudier les mécanismes d'action. La technique peut aider à accélérer et à trouver de nouvelles voies à la découverte de composés et des cibles intéressantes. Il est prévu que la combinaison du capteur avec antécédents génétiques associés à la maladie humaine pour le criblage de chimiothèques dans un contexte pertinent de la maladie aura beaucoup à offrir.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Orion II Microplate Luminometer	Berthold Detection Systems		with injector and the Simplicity 4.2 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement
FLx800 fluorimeter	Biotek		with Gen5 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement
Ks 130 basic shaking platform	Ika	#0002980000
Innova 4349	New Brunswick Scientific		Refrigerated incubator shaker
Eppendorf centrifuge 5804R	Eppendorf		with eppendorf rotor A-4-44  (for 50/15 ml tubes)
Stripette, Costar	Corning	#4489	Serological pipette
Cellstar 50 ml tubes	Greiner bio-one	#227661
Cellstar 15 ml tubes	Greiner bio-one	#188261
Cellstar 60 mm tissue culture plates	Greiner bio-one	#628160
Superfrost Microscope slides	VWR	#631-0909
Sterile spatula	Corning	#3007; #3004	for weighing out chemicals
0.22 mM Millex GP filters	Millipore	#SLGP033RS
Axygen eppendorf tubes 1.5 ml	Fisher Scientific	#MCT-150-R
Corning 96 well assay plate	VWR	#3603	Black plate clear bottom with lid
Nunc 96 well assay plate	Fisher Scientific	#236105	White plate with lid
Reservoir reagent 60 ml	Thermo Scientific Finnpipette	#9510027	used as trough for nematodes in protocol section 4.4.1
Storage box/damp chamber	Roche Diagnostics	#10 800 058 001	174 x 101 x 56.6 mm, used as a damp chamber with wet paper towels; 2x 96-well plates with lids can fit into one, the lower sitting on top of a microplate lid
Bleach: Sodium hypochlorite solution 4-4.99% Chlorine content	Sigma Aldrich	#239305	Store in aliquots at 4 °C,  seal with Parafilm to prevent loss of chlorine and cover in foil
D-Luciferin, potassium salt	Biotium Inc	# 10101-2	Molecular Probes can also be used as supplier; prepare a 20 mM stock in ddH2O, keep at -20 °C in aliquots
[header]
Tween 20	Sigma Aldrich	# P9416
DMSO	CalBiochem	#317275	Purity 99.99%
Triton X100	Alfa Aesar	#A16046	Diltute to 10% in ddH2O
Nystatin	CalBiochem	#475914
C. elegans bioluminescent strains	Author's own laboratory	PE254, PE255	contain integrated arrays feIs4 and feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] respectively on chromossome V and X; select for homogeneous and strong expression of luc::GFP by fluorescence microscopy (e.g. pick 15 worms) every now and then.
E. coli OP50	CGC
General chemicals	Sigma Aldrich/Fisher Scientific