La entrega de proteínas, péptidos o impermeable a las células pequeñas moléculas en células vivas por incubación con el reactivo endosomolítico dfTAT

Resumen

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

Resumen

Estrategias de prestación macromoleculares normalmente utilizan la vía endocítica como una vía de entrada celular. Sin embargo, el atrapamiento endosomal limita severamente la eficiencia con la que las macromoléculas penetrar en el espacio citosólico de células. Recientemente, hemos eludido este problema mediante la identificación del reactivo dfTAT, un dímero enlace disulfuro del péptido TAT etiquetado con la tetrametilrodamina fluoróforo. Hemos generado un dímero marcado con fluorescencia del péptido de penetración celular (CPP) TAT prototípico, dfTAT, que penetra en las células vivas y alcanza el espacio citosólico de células con una eficiencia particularmente alta. La entrega citosólica de dfTAT se logra en varias líneas celulares, incluyendo células primarias. Por otra parte, la entrega no afecta notablemente la viabilidad celular, la proliferación o la expresión génica. dfTAT puede entregar moléculas pequeñas, péptidos, anticuerpos, enzimas biológicamente activa y un factor de transcripción. En este informe se describen los protocolos involucrados en DFTASíntesis de T y la entrega celular. El manuscrito describe cómo controlar la cantidad de proteína entregada al espacio citosólico de las células mediante la variación de la cantidad de proteína administrada extracelularmente. Finalmente, se discuten las limitaciones actuales de esta nueva tecnología y pasos involucrados en la validación de la entrega. Los protocolos descritos deben ser extremadamente útil para ensayos basados ​​en células, así como para la manipulación ex vivo y la reprogramación de las células.

Introducción

La entrega de proteínas, péptidos o pequeñas moléculas impermeables a las células en células vivas es a menudo deseable en muchas aplicaciones biológicas o biotecnológicas (de imagen celular, ensayos funcionales, la reprogramación celular, etc.) ^{A 1-4.} Ya se han reportado muchos enfoques de entrega, incluyendo la microinyección, electroporación, o el uso de agentes de portador (por ejemplo., Péptidos penetran en las células, tales como TAT, lípidos) ^5-7. Cada técnica tiene normalmente ventajas y desventajas específicas que podrían hacer que estos enfoques adecuados para ciertas aplicaciones, pero no para otros. Problemas comunes incluyen la eficiencia de entrega de pobres y / o la falta de control de la cantidad de material que se entrega ^8,9, toxicidad o efectos fisiológicos deletéreos ^10,11, la falta de control temporal, entrega en pocas células, pero no en toda una población (por ejemplo., microinyección) ^12, y la conjugación química compleja o de formulación de planes de ^11.

s = "jove_content"> Recientemente, hemos desarrollado una estrategia de entrega novela que evita estas limitaciones. Esta estrategia se basa en un péptido llamado dfTAT (dímero TAT fluorescente) ^13. dfTAT se deriva a partir del péptido de penetración celular bien conocido (CPP) TAT. dfTAT contiene dos copias disulfuro unido de TAT etiquetados con el tetrametilrodamina fluoróforo. A pesar de sus similitudes, TAT y dfTAT difieren significativamente en la actividad. TAT típicamente se internaliza en las células por endocitosis. Sin embargo, esto CPP permanece atrapado en su mayoría dentro de los endosomas (esto por lo general conduce a una distribución puntiforme del péptido dentro de las células cuando se examina por microscopía de fluorescencia). Como TAT, dfTAT se endocitosis eficientemente por las células. Sin embargo, dfTAT no se queda atrapado dentro de endosomas. En su lugar, media la fuga de endosomal de una manera que es extremadamente eficiente. La actividad endosomolítica de dfTAT puede entonces ser explotado para entregar macromoléculas mediante un ensayo de incubación simple.

ntent "> La comprensión actual del proceso de entrega es como sigue. dfTAT induce macropinocytosis. Como resultado, las células incubadas con dfTAT ocupan proteínas solubles, péptidos, o pequeñas moléculas (moléculas de interés, MOI) presentes en los medios de comunicación por el fluido de fase endocitosis (ver Figura 1). Las interacciones entre dfTAT y MOI no son necesarios, siempre y cuando tanto el tráfico entidades juntos dentro de la vía endocítica. Como dfTAT alcanza un cierto umbral dentro de la luz de los orgánulos endocíticas, expresa su actividad fuga de endosomal (los detalles moleculares siendo para ser totalmente caracterizado). El contenido del lumen de los orgánulos que gotean, y por lo tanto la MOI, se libera en las células. Por tanto, este enfoque es muy conveniente, ya que no se requieren de conjugación o formulación esquemas con MOI. Además, debido a dfTAT es no modificar directamente una MOI, también no debe interferir con la función de las MOI una vez que se consigue el suministro intracelular. Además, la concentración dedfTAT utiliza entrega es independiente de la de MOI en medios de comunicación. Por ejemplo, la concentración dfTAT puede mantenerse constante entre los diferentes experimentos para garantizar la eficiencia reproducibles en fugas endosomal. En contraste, la concentración de MOI en los medios se puede cambiar gradualmente para lograr los niveles deseados de MOI entregado en el citosol.

La alta eficacia de fuga endosomal logrado con dfTAT es notablemente inocuos para muchas de las células ensayadas hasta la fecha. Esto es una sorpresa porque orgánulos endocíticas son componente importante de las células y uno esperaría que la fuga dramática mediada por dfTAT iría acompañado de las respuestas celulares deletéreos. Sin embargo, las células tratadas proliferan a la misma velocidad que las células no tratadas y no muestran cambios significativos en su transcriptoma. Por otra parte, la entrega se puede repetir dentro de minutos con eficiencias de entrega reproducibles, lo que indica que las células pueden o bien tolerar o recuperarse de el proceso de entrega sin perdersu capacidad para la endocitosis o fugas endosomal. Respuestas celulares sutiles pueden tener lugar durante el parto dfTAT y los detalles moleculares de lo que podrían ser permanecen estas respuestas para ser explorado. Sin embargo, mediante la combinación de alta eficiencia, conveniencia de protocolos, y la falta de toxicidad, este enfoque entrega debe demostrar inmediatamente útil en muchas aplicaciones basadas en células. Los protocolos presentados en este documento están dirigidas a hacer esta tecnología al alcance de la comunidad científica.

Protocolo

1. SPPS: CK (TMR) TATG (fTAT) Síntesis

Nota: dfTAT se produce en dos etapas: la síntesis del monómero fTAT por síntesis de péptidos en fase sólida seguida de dimerización disulfuro de bonos para formar dfTAT.

1. Swell 500 mg de resina MBHA de amida de Rink en dimetilformamida (DMF) en un recipiente de 50 ml SPPS estándar para 1 hr.
2. Realizar desprotección de Fmoc mediante la incubación de la resina protegida con Fmoc en una solución de piperidina al 20% (20% de piperidina en DMF, 10 ml (0,30 mmol). Llevar a cabo etapas de desprotección dos veces (1 x 5 min y 1 x 15 min) con una etapa de lavado usando DMF (la etapa de lavado incluye enjuagar la resina varias veces con un volumen total de aproximadamente 150 ml de DMF y eliminar el disolvente por filtración al vacío) entre reacciones.
3. Sintetizar CK (TMR) RKKRRQRRRG (fTAT) en la resina MBHA de amida pista. Utiliza el siguiente Fmoc aminoácidos protegidos: Fmoc-Lys (MTT) -OH (sólo en el extremo N-terminal), Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc- Gln (Trt) -OH, Fmoc-Cys y (Trt) -OH. Llevar a cabo la reacción utilizando N ₂ (20 PSI) para agitar la reacción. Realizar todas las reacciones a temperatura ambiente.
   1. Realizar cada reacción de acoplamiento de aminoácidos durante 4 horas. Para cada acoplamiento, utilice el aminoácido protegido con Fmoc (1,2 mmol), N, N, N ', N' -tetrametil- O- (benzotriazol-1 H-1 il) uronio (HBTU) (0,44 g, 1,1 mmol ), y diisopropiletilamina (DIEA) (0,51 ml, 3,0 mmol) disuelto en DMF. Después del acoplamiento 4 hr, lavar la resina con DMF y llevar a cabo la etapa de desprotección Fmoc como se describe en el paso 1.2.
   2. Repita hasta que la cadena peptídica lineal de fTAT: fue sintetizado (cadena peptídica lineal CKRKKRRQRRRG sin TMR).
   3. A continuación, lavar la resina a fondo usando primero DMF y después de que con diclorometano (DCM). Enjuagar la resina varias veces con un volumen total de aproximadamente 150 ml de DMF o DCM y eliminar el disolvente por filtración al vacío.
   4. Use MALDI-TOF para confirmar que el péptido obtenido tiene el peso molecular correcto.
      1. Hacer una mezcla matriz mediante la adición de 1 mg de la matriz a una solución compuesta por 50 l de 0,01% TFA en solución de agua y 50 l de acetonitrilo.
      2. Para confirmar masa cadena de péptido lineal, utilizar el ácido α-ciano-4-hidroxicinámico. Ejecutar un HPLC analítico del péptido en bruto y recoger 50 l desde la parte superior del pico puro.
      3. Para preparar la muestra a la placa en la placa de MALDI: Añadir 8 l de péptido a 2 l de la solución de la matriz y el lugar en la placa de MALDI secar al aire o en una placa de calor 37 ° C.
         Nota: La arginina es conocido por ser un ácido difícil de pareja en SPPS amino. Acoplamiento exitoso se establece mediante la realización de una prueba de Kaiser ¹⁴ (prueba por ejemplo, ninhidrina). Esta prueba permite la detección de aminas libres que no hayan quedado desacoplada en la resina. En caso de que se detecte un color azul (indicativo de la presencia de aminas libres), de acoplamiento steps se repiten.
4. Para CK (-NH-TMR) TATG (fTAT), escindir el grupo protector MTT en el grupo amino de Lys en la CK (-NH-MTT) TATG con una solución compuesta de ácido 1% trifluoroacético (TFA) y 2% triisopropilsilano (TIS) en DCM.
   1. Como la eliminación de grupo protector MTT daría lugar a la aparición de un color amarillo, se incuba la resina con 20 ml de la solución anterior durante 5 minutos, repetir esto hasta que no se observa ningún color amarillo. Lavar la resina con DCM y DMF en el medio. Además desde TIS es un limpiador que captar el MTT, una vez que no aparece ningún color amarillo en la solución en presencia de MTT.
   2. Añadir una solución adicional con 1% de TFA en DCM (sin TIS) a la resina para asegurar que no más MTT se retira y la solución permanece clara.
5. Disolver los tres componentes: carboxitetrametilrodamina (TMR), HBTU y DIEA (4, 3.9 y 10 la equivalencia con respecto a la cantidad de resina (en mg)) en DMF y añadir esta mezclaa la resina y llevar a cabo la reacción de O / N utilizando _N2 seco para proporcionar agitación.
6. Siguiendo Fmoc-desprotección y conjugación de aminoácidos, lavar la resina con DCM y deje que se seque. Para la escisión completa del péptido de la resina, se añade una solución que contiene 92,5% de TFA, 2,5% H ₂ O, 2,5%, TIS y 2,5% de etanoditiol (EDT) (volumen total = 4 ml) a la peptidil-resina para 3 hr a RT para lograr la desprotección global y escisión de la resina.
   1. Precipitar los productos peptídicos bruto usando éter etílico anhidro frío (Et ₂ O) mediante el drenaje de la solución de la etapa 1.6 en 40 ml de Et ₂ O, girar esto abajo a 4 ° C y 4.000 xg durante 20 - 25 min. Repita este paso para permitir el lavado del precipitado con anhidro frío _Et2O
   2. Resuspender el precipitado en agua (5 ml o hasta que se haya disuelto completamente precipitado) y se liofiliza. Entonces resuspender los productos obtenidos en 0,1% TFA acuoso / acetonitrilo.
7. Realizar el análisis por HPLC con una columna analítica C18 (5 m, 4 x 150 mm) para analizar cada péptido. Utilice una velocidad de flujo de 1 ml / min, y detección a 214 nm y 550 nm.
8. Realizar HPLC semi-preparativa en una columna C18 10 x 250 mm para la purificación de péptidos. Utilice una velocidad de flujo de 4 ml / min, y detección a 214 nm y 550 nm. Para todas las corridas, utilizar gradientes lineales de 0,1% TFA acuosa (disolvente A) y 90% de acetonitrilo, 9,9% de agua, y 0,1% de TFA (disolvente B).
9. Confirmar la identidad correcta de los péptidos por MALDI-TOF de acuerdo con el protocolo del fabricante: fTAT, masa esperada: 2,041.17, masa observada: 2.040,66. DEAC-K9, que se espera de masas: 1,412.97, observó masa: 1,415.59. Utilice una matriz de ácido ciano-4-hidroxicinámico α- para el MALDI-TOF.

2. Oxidación de reacción: dfTAT Generación

1. Airear salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4 durante 1 hora (al menos 5 ml para la reacción a continuación).
2. Disolver fTAT (0,3 mg, 1,5 x 10 ^-4 mmol) en aerado PBS pH 7,4 (5 ml). Asegúrese de que el pH está entre 7.0 - 7.5 después de la adición del péptido. Si no añadir hidróxido de sodio (1 M, en pequeños incrementos 1 - 5 l) para llevar el pH de nuevo hasta 7,4.
3. Nota: El oxígeno disuelto en PBS actúa para oxidar los grupos tiol en fTAT y formar un enlace disulfuro.
4. Inclinar la cabeza de la reacción de O / N para permitir que reaccione hasta la finalización (rendimiento 100% basado en el análisis HPLC). Se purifica el producto mediante HPLC de fase inversa y analizar mediante espectrometría de masas (MALDI-TOF) como en el paso 1.9. Masa esperado: 4,080.34, observó masa: 4,084.21.
5. Liofilizar pura dfTAT (0,71 x 10 ^-4 mmol) y resuspender en 200 l de agua (concentración pura dfTAT = 356,3 M).

3. Medir dfTAT Concentración

1. Resuspender una alícuota de la dfTAT purificada (típicamente 1 l dependiendo de la cantidad de péptido purificado) en un 149 l de 50 mM solución de TCEP.
2. Nota: En este paso dfTAT se reduce a su monomer contraparte fTAT para eliminar la absorbancia de enfriamiento que se produce debido a la proximidad del fluoróforo TMR en dfTAT (ε el coeficiente de extinción de TMR en dfTAT se reduce en comparación con el ε de TMR en fTAT reducida).
3. Permitir que la muestra reaccione durante aproximadamente 20 min (HPLC analítica se puede utilizar para confirmar la formación de fTAT).
4. Añadir toda la solución a la cubeta de cuarzo y se mide la absorbancia a 556 nm.
5. Usando la ley de Beer (A = εcl: ε = 91500 M ^-1 cm ^-1) para calcular la concentración de fTAT, determine la concentración de dfTAT y dividir [fTAT] por dos.

4. Experimentos de entrega celulares

1. Seed las células (HeLa, HDF, etc.) En un plato en una confluencia del 80 - 90% (por ejemplo, 8 pocillos o de 24 pocillos plato). Cultivan las células en un medio apropiado (por ejemplo, DMEM suplementado con 10% de FBS y Pen / Strep) hasta 80 - 90% de confluencia en un 37 ° Cambiente humidificado contiene 5% de CO _2.
2. Se lavan las células tres veces (3X) con PBS (mediante la adición de 200 l de PBS y luego extraerla tres veces).
3. Haga una concentración de trabajo 5 M de dfTAT diluyendo un stock de dfTAT (en agua) en la NRL-15 medios de comunicación (para un 8 y plato el volumen total debe ser de 200 l). Una concentración de 5 mM dfTAT conduce a la entrega eficiente (alto nivel de entrega citosólica en más de 90% de las células presentes en un plato) en la mayoría de tipos de células ensayadas hasta la fecha (Figura 3). Sin embargo, las concentraciones inferiores o superiores pueden ser más adecuados para tipos de células con una propensión alta o baja para la penetración.
   NOTA SOBRE MEDIOS: NRL-15 se utiliza para la entrega de dfTAT ya que no contiene cisteína, que podría reducir el enlace disulfuro en dfTAT. Sin embargo, nuestros datos indican que tanto regulares L-15 (con cisteína) y DMEM puede ser utilizado como los medios de entrega. L-15 contiene el aminoácido cisteína reducir pero presumab cisteínaly se oxida en los medios para formar la cistina (DMEM se formula con cistina). por lo tanto, dfTAT permanece intacto en estos medios y la entrega trabaja en la misma eficacia que la obtenida con nrL15.
4. Se incuban las células con dfTAT (5 M) con o sin carga (por ejemplo., EGFP (10 mM)) y mantener a 37 ° C durante 1 h (tiempo de incubación puede ser reducida pero dfTAT típicamente requiere aproximadamente 30 a 45 min para inducir la fuga de endosomal ).
5. Lavar las células con heparina (1 mg / ml) en L-15 (se recomiendan 3 lavados) para eliminar dfTAT unido a la membrana plasmática de las células.
6. Se incuban las células con tinción nuclear impermeable a las células, por ejemplo., Sytox Azul, Sytox Green (2 M en NRL-15), para determinar si la membrana plasmática de las células se ve comprometida (células muertas se tiñeron mientras que las células vivas no) de acuerdo con protocolo del fabricante.
7. Celdas de imagen utilizando un microscopio de fluorescencia (inmersión en aceite 100X u objetivo 20X). Imagen dfTAT utilizando un filtro de RFP (Ex =560 ± 20 nm / Em = 630 ± 35 nm).
   Nota: la entrega exitosa conduce a una fluorescencia difusa de dfTAT toda la célula (la evaluación de la entrega de proteína o péptido de interés dependerá de la aplicación). La tinción de nucleolos por fTAT (el producto reducido de dfTAT a la entrada citosólica) se puede utilizar como una indicación de que la fluorescencia detectada es intracelular. fTAT degradará dentro de pocas horas. En este punto, la fluorescencia de los fragmentos de degradación aparecerá como puntiforme. Esto no se debe confundir la distribución puntiforme que también se ve si dfTAT permanece sin éxito atrapado dentro de endosomas (esto puede suceder si dfTAT está presente en muy baja de una concentración).

5. Controling Concentración de MOI Entregado

1. Identificar la concentración "entrega óptima" necesario para lograr eficientes liberación citosólica de dfTAT en el tipo celular utilizado. Realizar microscopía de fluorescencia en células incubadas con increasinconcentraciones g de dfTAT. La concentración óptima dfTAT se define como la concentración mínima que conduce a despejar citosólica "difundir" TMR de fluorescencia en aproximadamente 100% de las células en un cultivo.
2. Vary la concentración de MOI utilizada en el protocolo de co-incubación mientras se mantiene la concentración de dfTAT constante (por ejemplo, utilizando la concentración de la entrega óptima de dfTAT). Cambiar el tiempo de incubación a menos de 1 hr también podría ser una opción para variar la cantidad de MOI entregado.

Resultados

Para evaluar la diferencia entre fTAT y dfTAT, células HeLa se incuban durante 1 h con cada péptido para determinar la diferencia en su localización celular. La internalización de los dos CPP de se evaluó mediante microscopía de fluorescencia. Figura 2 muestra que fTAT (20 mM) se localiza en una distribución punteada. Esta distribución es coherente con el péptido restante atrapado dentro de los endosomas. Por el contrario, la señal de fluorescencia de dfTAT (5 M) muestra una distribución homo...

Discusión

Las células utilizadas para la entrega dfTAT no debe ser demasiado confluentes (> 90% de confluencia), ya que esto podría afectar a la eficiencia en la entrega. Las células también deben ser saludables: las células muertas en el cultivo pueden liberar fragmentos apoptóticos con la que dfTAT puede interactuar (por ejemplo, el ADN de núcleos degradados). Esto a su vez puede interferir con la eficacia del suministro y la calidad de la imagen. Las células se deben lavar a fondo para eliminar FBS antes de...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin	Sigma	CAS 9041-08-1
SYTOX Blue	Invitrogen	S11348
SYTOX Green	Invitrogen	S7020
nrL15 L-15 (–) cysteine	Hyclone		Special order
Fmoc-protected Amino acids	Novabiochem
dfTAT			Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu)
Biosafety Cabinet
Inverted epifluorescence microscope	Olympus	model IXB1	equipped with a heating stage maintained at 37 °C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging).
37 °C humidified, 5% CO2 incubator
Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis