Entrega de proteínas, peptídeos ou célula-impermeável Pequenas moléculas em células vivas por incubação com o Endosomolytic Reagente dfTAT

Resumo

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

Resumo

Estratégias de entrega macromoleculares tipicamente utilizar a via endocítica como uma via de entrada celular. No entanto, endossomal aprisionamento limita severamente a eficiência com a qual macromoléculas penetrar no espaço citosólico de células. Recentemente, nós contornado este problema ao identificar o reagente dfTAT, um dímero de ligações dissulfureto da TAT péptido marcado com o fluoróforo tetrametilrodamina. Geramos um dímero marcado por fluorescência do péptido TAT prototípico de penetração celular (CPP), dfTAT, que penetra as células vivas e atinge o espaço citosólico de células em particular com uma alta eficiência. Entrega citosólica de dfTAT é conseguida em várias linhas de células, incluindo células primárias. Além disso, a entrega não tem impacto sobre a viabilidade das células visivelmente, a proliferação ou a expressão do gene. dfTAT pode entregar pequenas moléculas, péptidos, anticorpos, enzimas biologicamente activas e um factor de transcrição. Neste relatório, nós descrevemos os protocolos envolvidos na dfTAT síntese e administração celular. O manuscrito descreve como controlar a quantidade da proteína entregue ao espaço citosólico de células, variando a quantidade de proteína administrada extracelularmente. Finalmente, são discutidas as atuais limitações desta nova tecnologia e etapas envolvidas na validação de entrega. Os protocolos descritos devem ser extremamente útil para ensaios baseados em células bem como para a manipulação ex vivo e reprogramação das células.

Introdução

A administração de proteínas, péptidos ou pequenas moléculas celulares impermeável em células vivas é muitas vezes desejável em muitas aplicações biológicas ou biotecnológicos (imagiologia celular, ensaios funcionais, de reprogramação celular, etc.) ^1-4. Muitas abordagens de entrega já foram relatados, incluindo microinjecção, electroporação, ou a utilização de agentes veiculares (por exemplo., Péptidos de penetração de células, tais como tat, lípidos) ^5-7. Cada técnica tipicamente tem prós e contras específicos que podem fazer essas abordagens adequadas para certas aplicações, mas não para outros. Problemas comuns envolvem a eficiência de entrega pobres e / ou falta de controle de quanto material é fornecido ^8,9, toxicidade ou impacto fisiológico deletério ^10,11, a falta de controle temporal, entrega em algumas células, mas não em toda a população (por exemplo., microinjecção) ^12, e complexo de conjugação química ou formulação esquemas ^11.

s = "jove_content"> Recentemente, temos desenvolvido uma estratégia de entrega de romance que contorna essas limitações. Esta estratégia baseia-se em um peptídeo chamado dfTAT (dímero TAT fluorescente) ^13. dfTAT é derivado a partir do bem conhecido péptido célula-penetrante (CPP) TAT. dfTAT contém duas cópias dissulfureto ligado de TAT marcado com o fluoróforo tetrametilrodamina. Apesar de suas semelhanças, TAT e dfTAT diferem significativamente em atividade. TAT é tipicamente internalizado nas células por endocitose. Este CPP permanece no entanto principalmente preso dentro endosomes (isto geralmente levam a uma distribuição pontuada do peptídeo no interior das células, quando examinado por microscopia de fluorescência). Como TAT, dfTAT é eficientemente endocitose pelas células. No entanto, dfTAT não fica preso dentro endosomes. Em vez disso, ela medeia endossomal vazamento de uma maneira que é extremamente eficiente. A actividade de dfTAT endosomolytic pode então ser explorada para entregar macromoléculas através de um ensaio de incubação simples.

ntent "> O entendimento actual do processo de entrega é como se segue. dfTAT induz macropinocitose. Como resultado, as células incubadas com dfTAT tomar-se as proteínas solúveis, péptidos ou pequenas moléculas (moléculas de interesse, MOI) presentes nos meios de comunicação por fluido-fase endocitose (ver Figura 1). As interacções entre dfTAT e MOI não são necessários, desde que o tráfego de entidades, em conjunto dentro da via endocítica. Como dfTAT atinge um certo limite dentro do lúmen de organelos endocíticas, que expressa a sua actividade vazamento endossomal (os detalhes moleculares continuam a ser completamente caracterizados). O conteúdo do lúmen dos organelos gotejantes, e, por conseguinte, a MOI, é então libertado para dentro das células. Esta abordagem é, por conseguinte, muito conveniente como não há de conjugação ou formulação regimes com MOI são requeridas. Além disso, porque dfTAT é não modificar directamente uma MOI, que também não deve interferir com a função MOIs uma vez entrega intracelular é alcançada. Além disso, a concentração dedfTAT usados ​​entrega é independente da do MOI na mídia. Por exemplo, a concentração dfTAT pode ser mantida constante entre diferentes experiências para garantir a eficiência reprodutíveis no vazamento endossomal. Em contraste, a concentração de MOI em meios pode ser gradualmente mudada para atingir os níveis desejados de MOI entregue no citosol.

A alta eficiência de fuga endossomal conseguido com dfTAT é notavelmente inócuo para muitas das células testados até à data. Esta é uma surpresa porque são organelos endocíticas componente importante das células e seria de esperar que o vazamento dramática mediada por dfTAT seria acompanhada por respostas celulares nocivos. No entanto, as células tratadas proliferam na mesma taxa como células não tratadas e não exibem qualquer alteração significativa no seu transcriptoma. Além disso, a entrega pode ser repetido dentro de minutos, com uma eficiência de entrega reprodutíveis, o que indica que as células podem tolerar ou recuperar do processo de entrega, sem perdera sua capacidade para a endocitose ou vazamento endossomal. Respostas celulares sutis, podem ocorrer durante o parto dfTAT e os detalhes moleculares de que essas respostas possam ser ainda precisam ser exploradas. No entanto, através da combinação de alta eficiência, conveniência de protocolos, e falta de toxicidade, esta abordagem de entrega deve provar imediatamente útil em muitas aplicações baseadas em células. Os protocolos aqui apresentadas visam tornar esta tecnologia acessível para a comunidade de pesquisa.

Protocolo

1. SPPS: CK (TMR) TATG (fTAT) Síntese

Nota: dfTAT é produzida em duas etapas: a síntese do monómero fTAT por síntese de péptidos em fase sólida, seguido por dimerização de dissulfureto para formar dfTAT ligação.

1. Ondas 500 mg de resina MBHA-Amida Rink em dimetilformamida (DMF) em 50 ml de uma embarcação SPPS padrão durante 1 h.
2. Realizar Fmoc desprotecção através da incubação da resina protegido com Fmoc numa solução de piperidina a 20% (20% de piperidina em DMF, 10 ml (0,30 mmol). Levar a cabo passos de desprotecção duas vezes (1 x 5 minutos e 1 x 15 min), com um passo de lavagem utilizando DMF (o passo de lavagem inclui a lavagem da resina várias vezes com um volume total de aproximadamente 150 ml de DMF e a remoção do solvente por filtração sob vácuo) em entre reacções.
3. Sintetizar CK (TMR) RKKRRQRRRG (fTAT) na resina MBHA rink amida. Usar o seguinte aminoácidos protegidos com Fmoc: Fmoc-Lys (Mtt) -OH (apenas no terminal N), Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc- Gln (Trt) -OH, Fmoc-Cys e (Trt) -OH. Efectua-se a reacção utilizando N ₂ (20 psi) a agitar a reacção. Executar todas as reacções no RT.
   1. Levar a cabo cada uma das reacções de acoplamento de aminoácidos, durante 4 h. Para cada acoplamento, utilizar o aminoácido protegido com Fmoc (1,2 mmol), N, N, N ', N' -Tetramethyl- O- (1H-benzotriazol-1-il) urónio hexafluorofosfato (HBTU) (0,44 g, 1,1 mmol ), e diisopropiletilamina (DIEA) (0,51 ml, 3,0 mmol) dissolvido em DMF. A seguir ao acoplamento de 4 h, lavar a resina com DMF e realizar o passo de desprotecção de Fmoc como descrito no passo 1.2.
   2. Repita até a cadeia peptídica linear de fTAT (cadeia peptídica linear: CKRKKRRQRRRG não TMR) foi sintetizado.
   3. Em seguida, lave resina, cuidadosamente, com primeiro DMF e seguindo que com diclorometano (DCM). Lavar a resina várias vezes com um volume total de aproximadamente 150 ml de DMF ou DCM e remover o solvente por filtração sob vácuo.
   4. VCSE MALDI-TOF para confirmar que o péptido obtido tem o peso molecular correcto.
      1. Adicione uma mistura matriz por adição de 1 mg de matriz a uma solução composta por 50 ul de TFA a 0,01% em solução de água e 50 ul de acetonitrilo.
      2. Para confirmar massa cadeia de péptido linear, utilizar ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico. Executar uma HPLC analítica do péptido bruto e recolher 50 ul a partir do topo do pico puro.
      3. Para preparar a amostra para a chapa na placa de MALDI: Adicionar 8 ul de péptido a 2 ul de solução de matriz e o lugar sobre a placa de MALDI para o ar seco ou numa coluna C de calor de placas 37 °.
         Nota: A arginina é conhecido por ser um ácido difícil par SPPS amino. Acoplamento bem sucedido é estabelecida através da realização de um teste de Kaiser ¹⁴ (por exemplo, teste, teste da ninidrina). Este ensaio permite a detecção de aminas livres que ainda possam estar desacoplado na resina. No caso de uma coloração azul detectado (indicativo da presença de aminas livres), de acoplamento sPTE são repetidos.
4. Para CK (-NH-TMR) TATG (fTAT), clivar o grupo protector para o grupo Mtt -amino de Lys na CK (-NH-MTT) TATG com uma solução composta por 1% de ácido trifluoroacético (TFA) e triisopropilsilano 2% (TIS) em DCM.
   1. Como a remoção do grupo protector de MTT iria resultar no aparecimento de uma cor amarela, incubar a resina com 20 ml da solução acima durante 5 min, repetir este processo até não se observar a cor amarela. Lava-se a resina com DCM e DMF no meio. Além disso, uma vez TIS é um necrófago que limpam o MTT, uma vez que nenhuma cor amarela aparece na solução na presença de MTT.
   2. Adicionar uma solução adicional com 1% de TFA em DCM (sem TIS) à resina para assegurar que nenhum mais MTT é removido e a solução permanece límpida.
5. Dissolver as três componentes: carboxitetrametilrodamina (TMR), HBTU, e DIEA (4, 3,9 e 10 equivalência em relação à quantidade de resina (em mg)) em DMF e adicione essa misturapara a resina e realizar a reacção de O / N usando _N2 seco para proporcionar agitação.
6. Após desprotecção de Fmoc-aminoácido e de conjugação, lavar a resina com DCM e deixar secar. Por clivagem completa do péptido da resina, adicionar uma solução contendo 92,5% de TFA, _2,5% de H2O, 2,5%, TIS, e 2,5% de etanoditiol (EDT) (volume total = 4 ml) para a peptidil-resina durante 3 horas à temperatura ambiente para alcançar a desprotecção global e a clivagem a partir da resina.
   1. Precipitar o produto peptídeo bruto usando éter etílico anidro frio _(Et2O) por drenagem da solução a partir do passo 1.6 em 40 mL de _Et2O, esta rodada para baixo a 4 ° C e 4000 g durante 20 - 25 min. Repetir esta etapa para permitir a lavagem do precipitado com anidro frio _Et2O
   2. Ressuspender os precipitados em água (5 ml ou até precipitado é completamente dissolvido) e liofilizar. Em seguida ressuspender os produtos obtidos em 0,1% de TFA aquoso / acetonitrilo.
7. Realizar a análise por HPLC com uma coluna analítica C18 (5 uM, 4 x 150 mm) para analisar cada péptido. Usar uma taxa de fluxo de 1 mL / min, e detecção a 214 nm e 550 nm.
8. Realizar HPLC semi-preparativa numa coluna C18 de 10 x 250 mm para a purificação de péptidos. Utilize uma taxa de fluxo de 4 ml / min, e detecção a 214 nm e 550 nm. Para todas as corridas, utilizar gradientes lineares de 0,1% de TFA aquoso (solvente A) e 90% de acetonitrilo, 9,9% de água, e 0,1% de TFA (solvente B).
9. Confirmar a identidade correta dos peptídeos por MALDI-TOF de acordo com o protocolo do fabricante: fTAT, massa esperada: 2,041.17, massa observada: 2.040,66. DEAC-K9, massa esperada: 1,412.97, observou massa: 1,415.59. Usar uma matriz α- ácido ciano-4-hidroxicinâmico para a MALDI-TOF.

2. reacção de oxidação: Geração dfTAT

1. Arejar salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4, durante 1 hora (a menos de 5 ml para a reacção abaixo).
2. Dissolver fTAT (0,3 mg, 1,5 x 10 ^-4 mmol) em aerATED PBS pH 7,4 (5 ml). Certifique-se de que o pH é entre 7,0 - 7,5, após a adição do péptido. Se não adiciona-se hidróxido de sódio (1 M, em incrementos pequenos 1 - 5 ul) para levar o pH para trás até 7,4.
3. Nota: O oxigénio dissolvido em PBS age para oxidar os grupos tiol em fTAT e formar uma ligação dissulfureto.
4. Nutar a reacção S / N para permitir que ele reaja até à conclusão (rendimento 100% com base na análise por HPLC). Purifica-se o produto usando HPLC de fase reversa e análise por espectrometria de massa (MALDI-TOF) tal como no passo 1.9. Massa esperada: 4,080.34, observou massa: 4,084.21.
5. Liofilizar puro dfTAT (0,71 x10 ^-4 mmol) e ressuspender em 200 mL de água (concentração pura dfTAT = 356,3 M).

3. Medindo dfTAT Concentração

1. Ressuspender numa alíquota da dfTAT purificada (tipicamente 1 ul, dependendo da quantidade de péptido purificado) em 149 ul de uma solução 50 mM de TCEP.
2. Nota: Nesta etapa dfTAT é reduzido ao seu monomer homólogo fTAT para eliminar a absorção de têmpera que ocorre devido à proximidade do fluoróforo TMR em dfTAT (ε o coeficiente de extinção de TMR em dfTAT é reduzido em comparação com o ε da TMR em redução fTAT).
3. Deixar a amostra reagir durante aproximadamente 20 min (HPLC analítica pode ser usado para confirmar a formação de fTAT).
4. Adicionar toda a solução para a cuvete de quartzo e medir a absorvância a 556 nm.
5. Usando a lei de Beer (A = εcl: ε = 91.500 ^{M-1 cm-1)} para calcular a concentração de fTAT, determinar a concentração de dfTAT, e dividir [fTAT] por dois.

4. Experimentos administração celular

1. Semente as células (HeLa, HDF, etc.) Em um prato de cada confluência de 80 - 90% (por exemplo, de 8 poços ou 24 poços prato). Cultivar células em um meio apropriado (por exemplo, DMEM suplementado com FBS a 10% e Pen / Strep) até 80 - 90% de confluência em uma temperatura de 37 ° Catmosfera humidificada contendo 5% de CO _2.
2. Lavam-se as células três vezes (3x) com PBS (através da adição de 200 ul de PBS e, em seguida, removendo-o três vezes).
3. Adicione uma concentração de trabalho de 5 uM dfTAT por diluição de um stock de dfTAT (em água) em NRL-15 media (por um prato 8 bem o volume total deve ser de 200 uL). Uma concentração de 5 uM dfTAT leva a entrega eficaz (nível elevado de entrega citosólico em mais de 90% das células presentes num prato) na maioria dos tipos celulares testados até à data (Figura 3). No entanto, concentrações mais altas ou mais baixas podem ser mais adequadas para os tipos de células com uma propensão elevada ou baixa para a penetração.
   NOTA sobre Media: NRL-15 é usado para a entrega de dfTAT uma vez que não contêm cisteína que poderia reduzir a ligação di-sulfito em dfTAT. No entanto, os nossos dados indicam que tanto normal G-15 (com cisteína) e DMEM podem ser utilizados como os meios de entrega. G-15 contém o aminoácido cisteína mas reduzindo presumab cisteínaly oxida na mídia para formar cistina (DMEM é formulado com cistina). Por conseguinte, permanece intacta dfTAT nestes meios de entrega e funciona com a mesma eficiência que o obtido com nrL15.
4. Incubar as células com dfTAT (5 ^ M) com ou sem carga (por exemplo., EGFP (10 uM)) e manter a 37 ° C durante 1 h (tempo de incubação pode ser reduzido, mas dfTAT tipicamente requer cerca de 30 a 45 min para induzir fuga de endossomal ).
5. Lavar as células com heparina (1 mg / ml) em L-15 (3 lavagens são recomendados) para remover dfTAT ligado à membrana plasmática das células.
6. Incubar as células com células-impermeável corante nuclear, por exemplo., Sytox azul, Sytox verde (2 uM em NRL-15), para determinar se a membrana do plasma de células está comprometida (células mortas serão coradas enquanto que as células vivas não vai) de acordo com a o protocolo do fabricante.
7. Células de imagem utilizando um microscópio de fluorescência (imersão em óleo de 100X ou objetiva 20X). DfTAT imagem utilizando um filtro de RFP (Ex =560 ± 20 nm / Em = 630 ± 35 nm).
   Nota: a entrega bem sucedida leva a uma fluorescência difusa dfTAT de toda a célula (avaliação da entrega da proteína ou do péptido de interesse vai depender da aplicação). A coloração dos nucléolos por fTAT (o produto reduzido a partir da entrada de dfTAT citosólica) pode ser utilizada como uma indicação de que a fluorescência é detectada intracelular. fTAT irá degradar dentro de poucas horas. Neste ponto, a fluorescência dos fragmentos de degradação aparece como ponteada. Isso não deve ser confundido com a distribuição pontuada que também é visto se dfTAT permanece sem sucesso preso dentro endosomes (isso pode acontecer se dfTAT está presente em muito baixo de uma concentração).

5. Controling Concentração de MOI Proferido

1. Identificar a concentração de "entrega ideal" necessária para conseguir uma libertação eficaz do citosólica dfTAT no tipo de células utilizado. Realizar a microscopia de fluorescência de células incubadas com increasinconcentrações g de dfTAT. A concentração óptima dfTAT é definida como a concentração mínima que leva para limpar citosólica "difusa" TMR fluorescência em aproximadamente 100% das células em cultura.
2. Variar a concentração de MOI utilizado no protocolo de co-incubação, mantendo constante a concentração de dfTAT (por exemplo, usando entrega concentração óptima de dfTAT). Alterando o tempo de incubação para menos do que 1 hora pode também ser uma opção para variar a quantidade de MOI entregue.

Resultados

Para avaliar a diferença entre fTAT e dfTAT, células HeLa são incubadas durante 1 hora com cada um dos péptidos para determinar a diferença na sua localização celular. A internalização dos dois CPP foi avaliada por meio de microscopia de fluorescência. A Figura 2 mostra que fTAT (20 uM) localiza em uma distribuição pontuada. Esta distribuição é consistente com o restante péptido retido no interior de endossomas. Em contraste, o sinal de fluorescência de dfTAT (5 uM) exibe uma distribui?...

Discussão

As células utilizadas para entrega dfTAT não deve ser excessivamente confluente (> 90% de confluência) pois isso pode afetar a eficiência de entrega. As células devem também ser saudável: células mortas na cultura podem libertar fragmentos apoptóticos com as quais pode interagir dfTAT (por exemplo, ADN de núcleos degradados). Este por sua vez, pode interferir com a eficiência de entrega e a qualidade de imagem. As células devem ser lavadas cuidadosamente para remover FBS antes de adicionar dfTAT....

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin	Sigma	CAS 9041-08-1
SYTOX Blue	Invitrogen	S11348
SYTOX Green	Invitrogen	S7020
nrL15 L-15 (–) cysteine	Hyclone		Special order
Fmoc-protected Amino acids	Novabiochem
dfTAT			Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu)
Biosafety Cabinet
Inverted epifluorescence microscope	Olympus	model IXB1	equipped with a heating stage maintained at 37 °C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging).
37 °C humidified, 5% CO2 incubator
Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis