Consegna di proteine, peptidi o cella-impermeabile piccole molecole in cellule vive mediante incubazione con il reagente Endosomolytic dfTAT

Riepilogo

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

Abstract

Strategie di consegna macromolecolari in genere utilizzano il percorso endocitica come una via di ingresso cellulare. Tuttavia, endosomal intrappolamento limita fortemente l'efficienza con cui macromolecole penetrare il locale citosolico di cellule. Recentemente, abbiamo aggirato il problema individuando il reagente dfTAT, un dimero legame disolfuro della TAT peptide marcato con il fluoroforo tetrametilrodamina. Abbiamo generato un dimero fluorescente della cellula-penetrante peptide (CPP) TAT prototipo, dfTAT, che penetra cellule vive e raggiunge lo spazio citosolico di cellule con una particolarmente alta efficienza. Consegna citosolico di dfTAT è raggiunto in linee cellulari multiple, comprese le cellule primarie. Inoltre, la consegna non influisce notevolmente la vitalità cellulare, la proliferazione e l'espressione genica. dfTAT in grado di fornire piccole molecole, peptidi, anticorpi, enzimi biologicamente attivi e un fattore di trascrizione. In questo rapporto, si descrivono i protocolli coinvolti nella DFTASintesi T e consegna cellulare. Il manoscritto descrive come controllare la quantità di proteine ​​consegnato allo spazio citosolico di cellule variando la quantità di proteina somministrata extracellulare. Infine, gli attuali limiti di questa nuova tecnologia e passaggi necessari per la validazione di consegna sono discussi. I protocolli descritti devono essere estremamente utili per saggi cellulari e per la manipolazione ex vivo e riprogrammazione delle cellule.

Introduzione

La consegna di proteine, peptidi o piccole molecole cellulari impermeabili in cellule vive è spesso desiderabile in molte applicazioni biologiche o biotecnologiche (di imaging cellulare, test funzionali, riprogrammazione cellulare, ecc.) ^1-4. Molti approcci di consegna sono già stati segnalati, tra cui la microiniezione, elettroporazione, o l'uso di agenti portanti (ad es., Peptidi cellule penetrante, come TAT, lipidi) ^5-7. Ogni tecnica ha tipicamente pro e contro specifici che potrebbero rendere questi approcci adeguati per determinate applicazioni, ma non per gli altri. Problemi comuni riguardano l'efficienza di consegna poveri e / o la mancanza di controllo di quanto materiale viene consegnato ^8,9, tossicità o impatto fisiologico deleterio ^10,11, la mancanza di controllo temporale, consegna in poche cellule, ma non in un intero popolo (ad es., microiniezione) ^12, e complessi coniugazione chimica o formulazione regimi ^11.

s = "jove_content"> Di recente, abbiamo sviluppato una strategia di consegna romanzo che elude queste limitazioni. Questa strategia si basa su un peptide chiamato dfTAT (dimero TAT fluorescente) ^13. dfTAT deriva dal peptide ben sanno cellule penetrante (CPP) TAT. dfTAT contiene due copie disolfuro incollato di TAT etichettati con il tetrametilrodamina fluoroforo. Nonostante le loro somiglianze, TAT e dfTAT differiscono in modo significativo in attività. TAT è tipicamente internalizzato nelle cellule per endocitosi. Questo CPP rimane tuttavia per lo più intrappolato dentro endosomi (questo di solito porta ad una distribuzione puntiformi del peptide all'interno delle cellule, se esaminato al microscopio a fluorescenza). Come TAT, dfTAT è efficacemente endocitato dalle cellule. Tuttavia, dfTAT non rimane intrappolato all'interno endosomi. Invece, essa media perdite endosomal in un modo che è estremamente efficiente. L'attività di endosomolytic dfTAT può essere sfruttata per fornire macromolecole da un semplice saggio di incubazione.

S copi "> L'attuale comprensione del processo di consegna è il seguente. dfTAT induce macropinocitosi. Di conseguenza, le cellule incubate con dfTAT occupano proteine ​​solubili, peptidi, o piccole molecole (molecole di interesse, MOI) presenti in media da parte di fase fluida endocitosi (vedi Figura 1). Interazioni tra dfTAT e MOI non sono necessari fino a quando sia il traffico entità insieme all'interno del percorso endocitico. Come dfTAT raggiunge una determinata soglia all'interno del lume di organelli endocitiche, esprime la sua attività perdite endosomal (i dettagli molecolari restano essere pienamente caratterizzato). Il contenuto del lume di organelli dispersioni, e quindi il MOI, viene poi rilasciato nelle cellule. Questo approccio è quindi molto conveniente come non sono richieste coniugazione o formulazione regimi con MOI. Inoltre, perché dfTAT è Non modificare direttamente una MOI, non dovrebbe interferire con la funzione MOI volta consegna intracellulare è raggiunto. Inoltre, la concentrazione didfTAT utilizzato consegna è indipendente da quello del MOI in media. Ad esempio, la concentrazione dfTAT può essere mantenuta costante tra i diversi esperimenti per garantire l'efficienza riproducibili in perdite endosomal. Al contrario, la concentrazione di MOI nei media può essere gradualmente modificata per raggiungere livelli desiderati di MOI consegnato nel citoplasma.

L'alta efficienza di dispersione endosomal realizzato con dfTAT è notevolmente innocuo a molte delle cellule esaminate fino ad oggi. Si tratta di una sorpresa perché organelli endocytic sono componente importante delle cellule e ci si aspetterebbe che la perdita drammatica mediata da dfTAT sarebbe stato accompagnato da risposte cellulari deleteri. Eppure, cellule trattate proliferano alla stessa velocità come cellule non trattate e non visualizzano i cambiamenti significativi nella loro trascrittoma. Inoltre, la consegna può essere ripetuto in pochi minuti con l'efficienza di consegna riproducibili, indicando che le cellule possono sia tollerare o recuperare dal processo di consegna, senza perderela loro capacità di endocitosi o perdite endosomal. Risposte cellulari sottili potrebbero aver luogo durante la consegna dfTAT e i dettagli molecolari di ciò che queste risposte potrebbero essere ancora essere esplorate. Tuttavia, combinando ad alta efficienza, la convenienza di protocolli, e la mancanza di tossicità, questo approccio consegna risulti immediatamente utili in molte applicazioni basati su celle. I protocolli qui presentati hanno lo scopo di rendere questa tecnologia accessibile alla comunità di ricerca.

Protocollo

1. SPPS: CK (TMR) TATG (fTAT) Sintesi

Nota: dfTAT viene prodotta in due fasi: sintesi del monomero da fTAT solida sintesi del peptide fase seguita da disolfuro dimerizzazione legame per formare dfTAT.

1. Swell 500 mg di pista di ammide resina MBHA in dimetilformammide (DMF) in una da 50 ml SPPS nave standard per 1 ora.
2. Eseguire Fmoc deprotezione incubando resina protetto Fmoc in una soluzione di piperidina 20% (20% piperidina in DMF, 10 ml (0.30 mmoli). Eseguire i punti deprotezione doppio (1 x 5 min e 1 x 15 min) con una fase di lavaggio usando DMF (la fase di lavaggio comprende risciacquo resina più volte con un volume totale di circa 150 ml di DMF e allontanando il solvente per filtrazione sotto vuoto) in tra le reazioni.
3. Sintetizzare CK (TMR) RKKRRQRRRG (fTAT) sulla pista di ammide di resina MBHA. Utilizzare il seguente Fmoc protetta aminoacidi: Fmoc-Lys (MTT) -OH (solo su N-terminale), Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc- solln (Trt) -OH, e Fmoc-Cys (Trt) -OH. Effettuare la reazione con N ₂ (20 PSI) per agitare la reazione. Eseguire tutte le reazioni a temperatura ambiente.
   1. Eseguire ogni aminoacido reazione di accoppiamento per 4 ore. Per ogni accoppiamento, utilizzare il Fmoc protetta aminoacido (1,2 mmol), N, N, N ', N' -Tetramethyl- O- (1 H -benzotriazol-1-il) uronium esafluorofosfato (HBTU) (0,44 g, 1,1 mmol ) e diisopropiletilammina (DIEA) (0,51 ml, 3,0 mmoli) sciolto in DMF. Dopo l'accoppiamento 4 ore, lavare la resina con DMF e eseguire la fase di deprotezione Fmoc come descritto al punto 1.2.
   2. Ripetere fino a quando la catena peptide lineare di fTAT: è stato sintetizzato (catena peptidica lineare CKRKKRRQRRRG senza TMR).
   3. Lavare quindi accuratamente utilizzando resina primo DMF e dopo che con diclorometano (DCM). Risciacquare la resina più volte con un volume totale di circa 150 ml di DMF o DCM e rimuovere il solvente sotto vuoto per filtrazione.
   4. Use MALDI-TOF per confermare che il peptide ottenuta ha il peso molecolare corretto.
      1. Fare un mix matrice aggiungendo 1 mg di matrice per una soluzione composta da 50 ml di 0,01% TFA in soluzione acqua e 50 ml di acetonitrile.
      2. Per confermare massa catena peptide lineare, utilizzare l'acido α-ciano-4-idrossicinnamico. Eseguire un HPLC analitica del peptide grezzo e raccogliere 50 microlitri dalla sommità del picco puro.
      3. Per preparare il campione per placcare sulla piastra MALDI: Aggiungere 8 ml di peptide 2 microlitri della soluzione di matrice e posto sulla piastra MALDI asciugare all'aria o su una piastra di calore 37 ° C.
         Nota: Arginina è noto per essere un acido difficile coppia SPPS amino. Accoppiamento di successo è stabilita eseguendo un test Kaiser ¹⁴ (test ad esempio, ninidrina). Questo test consente la rilevazione di ammine libere che potrebbero rimanere sganciato sulla resina. Nel caso venga rilevato un colore blu (indicativo della presenza di ammine libere), accoppiamento steps si ripetono.
4. Per CK (-NH-TMR) TATG (fTAT), unirà il gruppo protettore Mtt il gruppo ammino di Lys su CK (-NH-MTT) TATG con una soluzione composta di acido 1% trifluoroacetico (TFA) e il 2% triisopropylsilane (TIS) in DCM.
   1. Poiché la rimozione del gruppo protettivo MTT determinerebbe la comparsa di un colore giallo, incubare la resina con 20 ml della soluzione di cui sopra per 5 min, ripetere questo fino è osservato nessun colore giallo. Lavare la resina con DCM e DMF in mezzo. Inoltre poiché TIS è uno scavenger che pulire la MTT, una volta nessun colore giallo appare nella soluzione in presenza di MTT.
   2. Aggiungere una soluzione supplementare con 1% TFA in DCM (senza TIS) alla resina per assicurare più MTT viene rimosso e la soluzione rimane chiaro.
5. Sciogliere i tre componenti: Carboxytetramethylrhodamine (TMR), HBTU, e DIEA (4, 3,9 e 10 equivalenza rispetto alla quantità di resina (in mg)) in DMF e aggiungere questa miscelaalla resina ed effettuare la reazione O / N con N ₂ a secco per fornire agitazione.
6. A seguito di Fmoc-deprotezione e aminoacidi coniugazione, lavare la resina con DCM e lasciarlo asciugare. Per una completa scissione del peptide dalla resina, aggiungere una soluzione contenente 92,5% TFA, 2,5% H ₂ O, 2,5%, TIS, e 2,5% etanditiolo (EDT) (volume totale = 4 ml) alla peptidil-resina per 3 ora a RT per ottenere deprotezione globale e clivaggio dalla resina.
   1. Precipitare il prodotto grezzo mediante peptide fredda etere etilico anidro (Et _{2 O)} drenando la soluzione dal punto 1.6 in 40 ml di Et ₂ O, girare questo giù a 4 ° C e 4.000 xg per 20 - 25 min. Ripetere questo passaggio per permettere il lavaggio del precipitato con anidro freddo Et ₂ O.
   2. Risospendere i precipitati in acqua (5 ml o fino a quando precipitato è completamente disciolto) e liofilizzato. Poi risospendere i prodotti ottenuti in 0.1% acquoso TFA / acetonitrile.
7. Effettuare analisi HPLC con una colonna analitica C18 (5 micron, 4 x 150 mm) per analizzare ogni peptide. Utilizzare una portata di 1 ml / min, e la rilevazione a 214 nm e 550 nm.
8. Eseguire HPLC semi-preparativa su una C18 10 x 250 mm di colonna per la purificazione dei peptidi. Utilizzare una velocità di flusso di 4 ml / min, e la rilevazione a 214 nm e 550 nm. Per tutte le corse, utilizzare gradienti lineari di 0,1% TFA acquoso (solvente A) e 90% acetonitrile, 9,9% di acqua, e 0,1% TFA (solvente B).
9. Confermare la corretta identità dei peptidi mediante MALDI-TOF secondo il protocollo del produttore: fTAT, di massa previsto: 2,041.17, massa osservato: 2.040,66. DEAC-K9, di massa previsto: 1,412.97, ha osservato di massa: 1,415.59. Utilizzare una matrice di acido ciano-4-idrossicinnamico α- per la MALDI-TOF.

2. Ossidazione Reazione: dfTAT Generation

1. Aerare tampone fosfato salino (PBS) pH 7,4 per 1 ora (almeno 5 ml per la reazione di seguito).
2. Sciogliere fTAT (0,3 mg, 1,5 x 10 ^-4 mmol) in aerated PBS pH 7,4 (5 ml). Assicurarsi che il pH è compreso tra 7.0 - 7.5 dopo l'aggiunta del peptide. Se non aggiungere idrossido di sodio (1 M, in piccoli incrementi 1 - 5 ml) per portare il pH a 7,4 backup.
3. Nota: ossigeno disciolto in PBS agisce per ossidare i gruppi tiolo su fTAT e formare un legame disolfuro.
4. Nutate la reazione O / N per lasciare agire fino al completamento (100% resa sulla base dell'analisi HPLC). Purificare il prodotto mediante HPLC in fase inversa e analizzare mediante spettrometria di massa (MALDI-TOF) come al punto 1.9. Massa prevista: 4,080.34, ha osservato di massa: 4,084.21.
5. Lyophilize puro dfTAT (0,71 mmol x10 ^-4) e risospendere in 200 ml di acqua (concentrazione puro dfTAT = 356,3 micron).

3. Misurare dfTAT Concentrazione

1. Risospendere una aliquota della purificato dfTAT (tipicamente 1 ml a seconda della quantità di peptide purificato) in 149 ml di 50 mM soluzione TCEP.
2. Nota: In questo passaggio dfTAT è ridotto alla sua monomer controparte fTAT per eliminare la tempra assorbanza che si verifica a causa della vicinanza del fluoroforo TMR in dfTAT (il ε coefficiente di estinzione del TMR in dfTAT è ridotto rispetto al ε di TMR in riduzione fTAT).
3. Lasciare il campione reagire per circa 20 min (HPLC analitica può essere utilizzato per confermare la formazione di fTAT).
4. Aggiungere tutta la soluzione nella cuvetta di quarzo e misurare l'assorbanza a 556 nm.
5. Utilizzando la legge di Beer (A = εcl: ε = 91.500 M ^-1 cm ^-1) per calcolare la concentrazione di fTAT, determinare la concentrazione di dfTAT, e dividere [fTAT] per due.

4. cellulari Esperimenti di consegna

1. Seme le cellule (HeLa, HDF, ecc.) In un piatto in un confluenza di 80-90% (ad esempio, ben 8 o 24 pozzetti piatto). Crescere le cellule in un mezzo appropriato (ad esempio, DMEM supplementato con 10% FBS e Pen / Strep) sino a 80 - 90% di confluenza in un 37 ° Catmosfera umidificata contenente il 5% di CO _2.
2. Lavare le cellule tre volte (3x) con PBS (aggiungendo 200 ml di PBS e quindi rimuovendo tre volte).
3. Fare un 5 micron concentrazione di lavoro di dfTAT diluendo uno stock di dfTAT (in acqua) in NRL-15 supporti (per un 8 pozzo piatto il volume totale dovrebbe essere di 200 ml). Una concentrazione di 5 mM dfTAT conduce consegna efficiente (elevato livello di consegna citosolico in più del 90% di cellule presenti in un piatto) nella maggior parte dei tipi cellulari testate finora (figura 3). Tuttavia, concentrazioni inferiori o superiori possono essere più adeguato per tipi di cellule con una propensione alto o basso per la penetrazione.
   NOTA SULLA MEDIA: NRL-15 viene utilizzato per la consegna di dfTAT in quanto non contiene cisteina, che potrebbe ridurre il legame disolfuro di dfTAT. Tuttavia, i nostri dati indicano che sia regolare L-15 (con cisteina) e DMEM può essere utilizzato come dispositivo di consegna. L-15 contiene la riduzione cisteina ma presumab cisteinaly ossida nei media per formare cistina (DMEM è formulato con cistina). dfTAT rimane quindi intatto in questi mezzi e consegna lavora la stessa efficienza di quella ottenuta con nrL15.
4. Incubare le cellule con dfTAT (5 mM) con o senza carico (ad es., EGFP (10 pM)) e mantenerlo a 37 ° C per 1 ora (tempo di incubazione può essere ridotto ma dfTAT genere richiede circa 30 a 45 minuti per indurre perdite endosomiale ).
5. Lavare le cellule con eparina (1 mg / ml) in L-15 (3 lavaggi sono raccomandati) per rimuovere dfTAT legato alla membrana plasmatica delle cellule.
6. Incubare le cellule con macchia di nuclei di cellule-impermeabili, ad es., Sytox Blu, Sytox Verde (2 micron di NRL-15), per determinare se la membrana plasmatica delle cellule è compromessa (cellule morte saranno colorate mentre le cellule vive non) secondo protocollo del produttore.
7. Celle di immagine usando un microscopio a fluorescenza (100X immersione in olio o obiettivo 20X). Immagine dfTAT utilizzando un filtro RFP (Ex =560 ± 20 nm / Em = 630 ± 35 nm).
   Nota: Il raggiungimento conduce ad una fluorescenza diffusa dfTAT tutta la cella (valutare la fornitura di proteina o peptide di interesse dipenderà dall'applicazione). La colorazione dei nucleoli da fTAT (il prodotto ridotto dfTAT all'entrata citosolico) può essere usato come indicazione che la fluorescenza intracellulare è rilevato. fTAT si degrada entro poche ore. A questo punto, la fluorescenza dei frammenti di degradazione apparirà come puntata. Questo non deve essere confuso per la distribuzione puntiforme che si vede anche se dfTAT rimane senza successo, intrappolato dentro endosomi (questo può accadere se dfTAT è presente troppo bassa di una concentrazione).

5. Controling Concentrazione di MOI Consegnato

1. Identificare la concentrazione "consegna ottimale" necessaria per ottenere efficiente rilascio citosolico della dfTAT nel tipo cellulare utilizzato. Eseguire microscopia a fluorescenza su cellule incubate con increasing concentrazioni di dfTAT. La concentrazione ottimale dfTAT è definita come la concentrazione minima che porta a respingere citosolico "diffuse" TMR fluorescence in circa il 100% delle cellule in una coltura.
2. Variare la concentrazione di MOI utilizzato in co-incubazione protocollo mantenendo costante la concentrazione di dfTAT (ad esempio, utilizzando la concentrazione ottimale di consegna dfTAT). Modifica del tempo di incubazione a meno di 1 ora può essere anche una possibilità di variare la quantità di MOI consegnato.

Risultati

Per valutare la differenza tra fTAT e dfTAT, cellule HeLa sono incubate per 1 ora con ogni peptide per determinare la differenza nella loro localizzazione cellulare. L'internalizzazione dei due CPP del è stata valutata utilizzando la microscopia a fluorescenza. La figura 2 mostra che fTAT (20 micron) localizza in una distribuzione puntata. Questa distribuzione è coerente con il peptide rimanendo intrappolata all'interno endosomi. Al contrario, il segnale di fluorescenza di dfTAT (5 mM) mostra ...

Discussione

Le cellule utilizzate per la consegna dfTAT non dovrebbe essere eccessivamente confluenti (> 90% di confluenza), poiché questo potrebbe influenzare l'efficienza di consegna. Le cellule dovrebbero anche essere in buona salute: le cellule morte nella cultura possono rilasciare frammenti apoptotici con cui dfTAT può interagire (ad esempio, il DNA dai nuclei degradate). Questo a sua volta può interferire con efficienza di consegna e la qualità delle immagini. Le cellule devono essere lavati accuratamente...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin	Sigma	CAS 9041-08-1
SYTOX Blue	Invitrogen	S11348
SYTOX Green	Invitrogen	S7020
nrL15 L-15 (–) cysteine	Hyclone		Special order
Fmoc-protected Amino acids	Novabiochem
dfTAT			Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu)
Biosafety Cabinet
Inverted epifluorescence microscope	Olympus	model IXB1	equipped with a heating stage maintained at 37 °C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging).
37 °C humidified, 5% CO2 incubator
Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis