Endosomolytic 시약 dfTAT와 배양 라이브 세포에 단백질, 펩타이드 또는 세포 투과성 작은 ​​분자의 배달

요약

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

초록

고분자 배달 전략은 일반적으로 세포 항목의 경로로 세포 내 이입 경로를 사용합니다. 하지만, 엔도 좀 포획 심각 세포 세포질 공간에 침투 고분자의 효율성을 제한한다. 최근에는 시약 dfTAT, 형광 물질로 표지 된 테트라 메틸 TAT 펩타이드의 이황화 결합의 이량 체를 식별하여이 문제를 회피하고있다. 우리는 생균을 관통하고, 특히 고효율로 세포의 세포질 공간에 도달 원형 세포 투과 펩티드 (CPP) TAT, dfTAT의 형광 표지 된 이량 체를 생성 하였다. dfTAT의 시토 졸 전달은 일차 세포를 포함한 여러 세포주에서 얻어진다. 또한, 배달 띄게 세포 생존, 증식 또는 유전자 발현에 영향을주지 않는다. dfTAT는 소분자, 펩티드, 항체, 효소 및 생물학적 활성 전사 인자를 전달할 수있다. 이 보고서에서 우리는 DFTA에 포함 된 프로토콜을 설명T 합성 및 세포 배달. 원고는 세포 외로 투여 된 단백질의 양을 변화시켜 세포의 세포질 공간으로 전달 단백질의 양을 제어하는​​ 방법을 설명합니다. 마지막으로,이 새로운 기술 및 배달 검증에 관련된 단계의 현재 제한이 논의된다. 설명 된 프로토콜은 세포 기반 분석법뿐만 아니라 세포의 생체 외 조작 및 리 프로그래밍에 매우 유용 할 것이다.

서문

생균에 단백질, 펩타이드 또는 세포 투과성 작은 분자의 전달은 많은 생물 또는 생물 공학적 응용 (셀룰러 이미징 기능 분석, 세포 리 프로그래밍, 등.) ^1-4에 종종 바람직하다. 다수의 전달 방법은 이미 미세 주입, 전기 천공, 또는 운반 제의 사용을 포함하여,보고되고있다 (예., 예컨대 TAT 같은 세포 투과 펩티드, 지질) ^5-7. 각 기술은 일반적으로 특정 응용 프로그램에 대한 아니라 다른 사람에 대한 이러한 접근 방식이 적절 할 수있는 특정 장단점이 있습니다. 일반적인 문제는 소수의 세포가 아니라 전체 인구 및 / 또는 부족 ^8,9 전달 얼마나 많은 물질의 제어, 독성 또는 해로운 생리 학적 영향 ^{10, 11,} 시간 제어의 부족, 배달의 가난한 전달 효율을 (포함 예 :., 마이크로 인젝션) ⁽¹²⁾ 및 복소 공액 또는 화학적 제제 스킴 ^11.

S = "jove_content은"> 최근에, 우리는 이러한 한계를 우회하는 새로운 배달 전략을 개발했다. 이 전략은 dfTAT라는 펩타이드 (이량 체 형광 TAT) ^(13)에 의존한다. dfTAT는 잘 알고 세포 침투 펩타이드 (CPP) TAT에서 파생됩니다. dfTAT는 형광의 테트라 메틸 표지 TAT의 두 이황화 결합 사본이 포함되어 있습니다. 그들의 유사성에도 불구하고, TAT와 dfTAT 활동에 유의 한 차이. TAT는 일반적으로 엔도 시토 시스에 의해 세포로 내재화된다. 이 CPP 그러나 대부분 (형광 현미경으로 관찰 할 때 일반적으로 세포 내부의 펩타이드의 반점이 분포지도) 엔도 좀 안에 갇혀 상태를 유지합니다. TAT처럼 dfTAT 효율적으로 세포에 의해 endocytosed된다. 그러나 dfTAT는 엔도 좀 안에 갇혀 유지하지 않습니다. 대신에, 그것은 매우 효율적 방식으로 엔도 좀 누설을 매개한다. dfTAT의 endosomolytic 활동은 단순한 배양 분석에 의해 고분자를 제공하기 위해 이용 될 수있다.

다음 ntent "> 전달 프로세스의 현재의 이해이다. dfTAT가 macropinocytosis를 유도한다. 따라서, dfTAT 배양 세포는 액체 상으로 배지에서 본 가용성 단백질, 펩타이드, 또는 작은 분자 (관심 분자 MOI) 차지 엔도 시토 시스는 (도 1 참조). dfTAT 및 MOI 사이의 상호 작용이 함께 세포 내 이입 경로 내의 두 엔티티 트래픽 것이면 불필요하다. dfTAT가 이입 소기관의 루멘 내에서 특정 임계 값에 도달 할 때, 그것은 그것의 엔도 좀 누설 활동 (분자량 상세 표현 dfTAT이기 때문에,이 방식 또한. 따라서 MOI와의 접합이나 배합 방식이 필요하지 않다로 매우 편리하다.). 완전히 특성화 될 누설 소기관의 루멘의 내용을 유지하며, 따라서 MOI 후 세포 내로 방출 세포 내 전달이 달성되면 직접 수정하지 MOI, 또한 MOIs 기능을 방해해서는 안된다. 또한, 농도를dfTAT 배달 미디어에서 MOI의 독립적 인 사용. 예를 들어, dfTAT 농도는 엔도 좀 누설 재현성 효율을 보장하기 위해 여러 실험과 일정하게 유지할 수있다. 대조적으로, 미디어 MOI의 농도는 점차 MOI가 시토 졸 전달의 원하는 레벨을 달성하기 위해 변경 될 수있다.

dfTAT 달성 높은 엔도 좀 누설 효율은 현재까지 테스트 한 세포의 많은 현저하게 무해하다. 세포 내 이입 세포 소기관이 세포의 중요한 구성 요소이며, 하나 dfTAT에 의해 매개 극적인 누설이 해로운 세포 반응을 동반 할 것이라고 기대하기 때문 놀라운 일이다. 그러나, 처리 된 세포는 비 처리 세포와 동일한 속도로 증식 및 그들의 사체에 상당한 변화를 표시하지 않는다. 또한, 배달 세포 손실없이 전달 프로세스에서 용납 또는 복구 할 수 있음을 나타내는 하나 재현성 전달 효율을 가진 분 내에서 반복 될 수있다엔도 시토 시스 또는 엔도 좀 누설에 대한 자신의 능력. 미묘한 세포 반응은 dfTAT 제공 및 이러한 응답이 탐험 남아있을 수 있습니다 무엇의 분자 세부 동안 자리를 차지할 수 있습니다. 그러나, 높은 효율, 프로토콜의 편의 및 독성 부족을 결합하여, 이러한 전송 방식은 다수의 세포 - 기반 애플리케이션에 즉시 유용한다. 여기에 제시된 프로토콜은 연구 커뮤니티에이 기술이 액세스 할 수 있도록 목표로하고 있습니다.

프로토콜

1. SPPS : CK (TMR) TATG (fTAT) 합성

주 : dfTAT는 두 단계로 생성된다 : dfTAT을 형성하는 디설파이드 결합 이량이어서 고상 펩티드 합성에 의해 모노머의 합성을 fTAT.

1. 1 시간 동안 50 ml의 표준 SPPS 용기에서 디메틸 포름 아미드 (DMF)에 링크 아미드 MBHA 수지 500 mg의 팽창.
2. . 20 % 피 페리 딘 용액 (DMF 중 20 % 피 페리 딘 10 ㎖ (0.30 밀리몰)에서의 Fmoc 보호 된 수지를 배양함으로써 및 Fmoc 탈 보호를 수행하여 (1 X 5 분 및 세정 공정으로 1 × 15 분)을 사용하여 두 번 탈 보호 단계를 수행 DMF는 (세정 공정은 DMF 약 150 ml의 총 부피로 수지를 여러 번 세척하고, 진공 여과에 의해 용매를 제거하는 단계를 포함) 사이의 반응.
3. 링크 아미드 MBHA 수지에 CK (TMR) RKKRRQRRRG (fTAT)를 합성. 사용의 Fmoc 아미노산 보호 다음의 Fmoc-리스 (MTT) -OH (만​​ N- 말단에)의 Fmoc-리스 (BOC)를 -OH,의 Fmoc-의 Gly-OH,의 Fmoc, 인수 (PBF) -OH,의 Fmoc- GLN (Trt가) -OH, Fmoc 등-개의 Cys (Trt가) -OH. 반응물을 교반하는 N ₂ (20 PSI)을 사용하여 반응을 수행한다. 실온에서 모든 반응을 수행합니다.
   1. 4 시간에 대한 각각의 아미노산의 커플 링 반응을 수행한다. 각각의 커플 링에 대해,의 Fmoc 아미노산 (1.2 밀리몰), N, N, N ', N'테트라 메틸 -O- (벤조 트리아 졸 1 H -1- ​​일) 우로 늄 헥사 플루오로 포스페이트 (HBTU) (0.44 g, 1.1 밀리몰 보호 사용 DMF에 용해) 및 디 이소 프로필 에틸 아민 (DIEA) (0.51 ㎖, 3.0 밀리몰). 4 시간 커플 링 후, DMF로 수지를 세척하고, 단계 1.2에 기재된대로의 Fmoc 탈 보호 단계를 수행한다.
   2. (: CKRKKRRQRRRG없는 TMR 선형 펩타이드 체인)를 합성 하였다 fTAT의 선형 펩타이드 체인이 될 때까지 반복합니다.
   3. 그리고 철저하게 처음으로 DMF를 사용하고, 디클로로 메탄 (DCM)와 그 다음의 수지를 씻는다. DMF 또는 DCM 약 150 ml의 총 부피로 수지를 여러 번 헹구고, 진공 여과에 의해 용매를 제거한다.
   4. 유SE MALDI-TOF 수득 펩티드 정확한 분자량을 지니는 것으로 확인되었다.
      1. 수용액을 0.01 % TFA의 50 μL 아세토 니트릴 50 μL로 이루어지는 용액에 매트릭스 1mg을 첨가하여 혼합 행렬을 만든다.
      2. 선형 펩티드 사슬 질량을 확인하기 위해, α - 시아 노 -4- 히드 록 시신 남산을 사용한다. 원유 펩타이드의 분석 HPLC를 실행하고 순수한 피크의 정상에서 50 μl를 수집합니다.
      3. MALDI 접시에 플레이트에 샘플을 준비하려면 다음 건조 또는 37 ° C의 열 접시에 방영하는 MALDI 접시에 매트릭스 솔루션과 장소 2 μL에 펩티드의 8 μl를 추가합니다.
         참고 : 아르기닌은 SPPS 부부 어려운 아미노산으로 알려져있다. 성공적인 결합 카이저 테스트 ⁽¹⁴⁾ (예를 들어 닌히 드린 시험)을 수행함으로써 성립된다. 이 테스트는 수지에 남아있을 비결 유리 아민의 검출을 허용한다. 경우 청색 (유리 아민의 존재를 나타내는) 검출되고, 결합의TEPS는 반복된다.
4. CK를 들어 (-NH-TMR) TATG (fTAT), 1 % 트리 플루오로 아세트산 (TFA) 및 2 % 트리 이소 프로필 실란으로 이루어지는 용액 CK에 라이신의 아미노 그룹에 (-NH-MTT) TATG을 MTT 보호기를 절단 DCM에서 (TIS).
   1. MTT 보호기의 제거는 황색의 외관 초래로서, 5 분 동안 상기 용액 20 mL를 수지 부화에는 황색이 관찰되지 않을 때까지 이것을 반복한다. 사이에서 DCM 및 DMF로 수지를 씻으십시오. TIS는 MTT를 청소할 것 폐품이 또한 있기 때문에, 한 번 더 옐로우 색상은 MTT의 존재 용액에 표시되지 않습니다.
   2. MTT를 더 이상 보장되지하는 수지에 DCM 중 1 % TFA (NO TIS)와 추가 용액을 첨가하여 제거하고, 맑은 용액이 남아있다.
5. 의 DMF (() 밀리그램에서 수지의 양에 대하여 4, 3.9, 10 등가) Carboxytetramethylrhodamine (TMR), HBTU 및 DIEA이 혼합물을 추가 세 가지 구성 요소를 녹여수지에 첨가하고, 반응을 실시 O / N는 교반을 제공하기 위해 건조 N _2를 사용.
6. 의 Fmoc 탈 보호 및 아미노산 결합 후, DCM으로 수지를 세척하고 건조 할 수 있습니다. 수지로부터 펩티드의 완전한 분해를 위해, 92.5 % TFA, 2.5 %를 함유하는 용액을 첨가 H ₂ O, 2.5 %, TIS 및 3 펩 티딜 - 수지에 2.5 %의 에탄 디티 올 (EDT) (전체 부피 = 4 mL) 중 실온에서 시간은 수지에서 세계 탈과 분열을 달성했다.
   1. 잇 ₂ O 40 ml의에 단계 1.6에서 솔루션을 배출하여 추운 무수 에틸 에테르 (ET ₂ O)를 사용하여 원유 펩타이드 제품을 침전, 4 ° C에서이 스핀 다운 20 4,000 XG - 25 분. 감기 무수 잇 ₂ O와 침전물의 세척을 할 수 있도록이 단계를 반복합니다
   2. 물 (5 ㎖ 또는 침전이 완전히 용해 될 때까지) 및 동결 건조를 침전물을 재현 탁. 이어서 0.1 % 수성 TFA / 아세토 니트릴에서 얻은 제품을 재현 탁.
<리> 분석 C18 컬럼 (5 μm의, 4 × 150mm) 각각의 펩타이드를 분석하여 HPLC 분석을 수행합니다. 214 nm 내지 550 nm에서 유량 1 ㎖ / 분의 속도 및 검출을 사용한다.
7. 펩타이드 정제를위한 C18 10 × 250mm 컬럼에 반 예비 HPLC를 수행합니다. 214 nm 내지 550 nm에서 유량 4 ml / 분의 속도 및 검출을 사용한다. 모든 실행을위한 0.1 % 수성 TFA (용매 A)와 90 % 아세토 니트릴, 9.9 % 물, 0.1 % TFA (용매 B)의 선형 구배를 사용한다.
8. fTAT 예상 질량 : 2,041.17, 관찰 물질 : 2040.66 제조사의 프로토콜에 따라 MALDI-TOF에 의해 펩타이드의 정확한 신원을 확인합니다. 대량 예상 DEAC-K9 : 1,415.59 : 1,412.97을, 질량을 관찰했다. MALDI-TOF에 대한 α- 시아 노 -4- 히드 록 산 행렬을 사용합니다.

2. 산화 반응 : dfTAT 세대

1. 1 시간 (아래의 반응에 대해 적어도 5 ㎖) 인산염 완충 식염수 (PBS)를 pH 7.4의 통기.
2. AER에 fTAT (0.3 ㎎, 1.5 × ^10-4 밀리몰) 용해ated PBS pH 7.4의 (5 mL)을 첨가 하였다. 펩타이드를 첨가 한 후 7.5 - pH가 7.0 사이에 있는지 확인합니다. 수산화 나트륨을 추가 할 경우 (작은 단위로 1 M을, 1-5 μL)를 다시 7.4까지 pH를 가지고 있습니다.
3. 주 : PBS에 용해 된 산소가 fTAT에 티올 그룹을 산화시키고 이황화 결합을 형성하는 역할을한다.
4. 반응을 Nutate O / N은 ​​완료 (HPLC 분석에 기초하여 수율 100 %)까지 반응 할 수있다. 역상 HPLC를 사용하여 생성물을 정제하여 단계 1.9에서와 같이, 질량 스펙트럼 (MALDI-TOF)에 의해 분석한다. 예상 질량 : 4,084.21 : 4,080.34을, 질량을 관찰했다.
5. 200 μL 물에 동결 건조 순수 dfTAT (0.71 X10 ^-4 mmol)을 재현 탁 (농도 순수한 dfTAT = 356.3 μM).

3. dfTAT 농도를 측정

1. TCEP 50 mM의 용액 149 μL에 dfTAT 정제 (정제 된 펩타이드의 양에 따라 전형적으로 1 μL)의 분취 량을 재현 탁.
2. 참고 :이 단계에서 dfTAT이 모로 감소nomer 대응 fTAT 인해 dfTAT에서 TMR의 형광의 근접 (dfTAT에서 TMR의 흡광 계수 ε가 감소 fTAT에서 TMR의 ε에 비해 감소)에 발생하는 흡수 담금질을 제거합니다.
3. 샘플을 약 20 분 동안 반응하도록 허용 (HPLC 분석은 fTAT의 형성을 확인하기 위해 사용될 수있다).
4. 석영 큐벳에 모든 솔루션을 추가하고 556 nm에서 흡광도를 측정한다.
5. 맥주의 법칙을 사용하여 (= εcl : ε = 91,500 M ^-1 cm ^-1), fTAT의 농도를 계산 dfTAT의 농도를 결정하고, 2로 [fTAT] 분할합니다.

4. 셀룰러 배달 실험

1. 90 % (예를 들면,도 8 또는 24 웰 접시) - (80)의 포화 상태로 접시에 세포 (. 헬라, HDF, 등) 시드. 37 ° C에서 90 % 컨 플루 - 적절한 배지에서 세포를 성장 80까지 (예를 들어, DMEM은 10 % FBS 및 펜 / 스트렙토 보충)5 % CO _2를 함유하는 가습 분위기.
2. (그 세 번 제거한 다음 PBS 200 μl를 첨가함으로써) 세포를 PBS로 3 회 (3 회) 세척 하였다.
3. (8 잘 전체 볼륨이 200 μL해야 요리) NRL-15 미디어 (물) dfTAT의 주식을 희석하여 dfTAT의 5 μm의 작업 농도를 확인합니다. 5 μm의 dfTAT의 농도는 효율적인 배달 날짜 (그림 3)에 테스트 대부분의 세포 유형에 (접시에 존재하는 세포의 90 % 이상에서 세포질 전달의 높은 수준)에 연결됩니다. 그러나 낮거나 높은 농도의 침투에 대한 높은 또는 낮은 성향을 가진 세포 유형에 더 적합 할 수 있습니다.
   용지에 대한 참고 :이 dfTAT의 이황화 결합을 감소시킬 수 시스테인을 포함하지 않기 때문에 NRL-15은 dfTAT의 전달에 사용됩니다. 그러나, 우리의 데이타는 모두 정규 L-15 (시스테인)과 DMEM는 전달 매체로서 이용 될 수 있음을 나타낸다. L-15은 감소 아미노산 시스테인 있지만, 시스테인을 포함 presumabLY는 (DMEM은 시스테인과 배합) 시스틴을 형성하는 배지에서 산화. dfTAT 따라서 이러한 미디어에 그대로 남아 및 배달 nrL15 얻은 것과 동일한 효율로 작동합니다.
4. 또는화물없이 dfTAT (5 μM) (예., EGFP (10 μM))과 함께 세포를 인큐베이션하고 (배양 시간이 감소 될 수 있지만 dfTAT 전형적 엔도 좀 누출을 유도하는 약 30-45 분을 필요로 1 시간 동안 37 ℃에서 유지 ).
5. (3 세척을 권장) 세포의 세포막에 결합 dfTAT을 제거하기 위해 L-15에 헤파린 (1 ㎎ / ㎖)로 세포를 씻으십시오.
6. 에 따른 세포 투과성 핵 염색으로 세포를 인큐베이션 예., SYTOX 블루, SYTOX 그린 (NRL-15의 2 μM)을, 세포의 세포막이 손상되는지 여부를 결정하기 위해 (생균은 것은 아니지만 사균은 염색한다) 제조 업체의 프로토콜입니다.
7. 형광 현미경 (100X 오일 침지 또는 20X 대물 렌즈)를 사용하여 화상 세포. RFP 필터를 사용하여 이미지 dfTAT (예 =560 ± 20 nm의 / 엠 = 630 ± 35 ㎚).
   주 : 성공적인 배달 셀에 걸쳐 dfTAT의 확산 형광 (응용 프로그램에 따라 다릅니다 단백질 또는 관심의 펩타이드의 전달을 평가)에 연결됩니다. fTAT (세포질 엔트리 dfTAT시의 환원 생성물) 핵소체 의해 염색이 검출 형광 세포가 있다는 표시로서 사용될 수있다. fTAT는 몇 시간 내에 저하됩니다. 이 시점에서, 분해 단편의 형광 반점으로 나타나는 것이다. 이 dfTAT가 실패 (dfTAT는 농도가 너무 낮은에있을 경우이 발생할 수 있습니다) 엔도 좀 안에 갇혀 상태를 유지하는 경우도 볼 수있다 반점 배포 혼동하지 마십시오.

배달 MOI 5. 및 관리 농도

1. 사용되는 세포 유형에 dfTAT의 효율적인 세포질 방출을 달성하는 데 필요한 "최적의 전달"농도를 확인합니다. increasin 배양 세포에 형광 현미경을 수행dfTAT g의 농도. 최적 dfTAT 농도 세포질 취소 리드 최소 농도로 정의된다 배양 세포의 약 100 %에 TMR 형광 "확산".
2. (dfTAT의 최적 농도를 제공하여, 예) dfTAT 농도를 일정하게 유지하면서 MOI의 농도가 공동 배양 프로토콜에서 사용되는 변화한다. 1 시간 미만으로 배양 시간을 변경하면 MOI 전달의 양을 변화 옵션 일 수있다.

결과

fTAT dfTAT과의 차이를 평가하기 위해, HeLa 세포들은 세포 지역화의 차이를 결정하기 위해 각각의 펩타이드로 1 시간 동안 배양 하였다. 두개의 CPP의 내재화를 형광 현미경을 사용하여 평가 하였다. fTAT (20 μM)은 점상 분포에 편재 2는 도표. 펩타이드는 엔도 좀 내부에 갇힌 나머지이 분포는 일치한다. 대조적으로, dfTAT (5 μM)의 형광 신호는 세포질 및 핵 걸쳐 균일 분포를 표시한다.?...

토론

사람이 지나치게 합류 안된다 dfTAT 전달을 위해 사용되는 세포 (> 90 % 컨 플루 언시)을 전달 효율에 영향을 미칠 수도있다. 세포는 건강해야한다 : 문화의 죽은 세포는 dfTAT이 (저하 핵에서 예를 들어, DNA)을 상호 작용할 수있는 세포 사멸 조각을 해제 할 수 있습니다. 차례로이 전달 효율과 영상의 품질을 방해 할 수 있습니다. 세포 dfTAT를 추가하기 전에 FBS를 제거하기 위해 철저하게 세척해...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin	Sigma	CAS 9041-08-1
SYTOX Blue	Invitrogen	S11348
SYTOX Green	Invitrogen	S7020
nrL15 L-15 (–) cysteine	Hyclone		Special order
Fmoc-protected Amino acids	Novabiochem
dfTAT			Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu)
Biosafety Cabinet
Inverted epifluorescence microscope	Olympus	model IXB1	equipped with a heating stage maintained at 37 °C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging).
37 °C humidified, 5% CO2 incubator
Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis