Endosomolitik Reaktif dfTAT ile kuluçkaya yatırılması ile Canlı hücreler içine proteinler, peptitler ya da hücre-geçirgen olmayan küçük moleküller teslimi

Özet

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

Özet

Makromoleküler teslim stratejileri genellikle hücresel bir giriş yolu olarak endositik yolu kullanmaktadır. Ancak, endozomal tuzak ciddi hücrelerin sitozolik alan nüfuz makromoleküller hangi ile verimliliği sınırlar. Son zamanlarda, biz reaktif dfTAT, fluorofor tetrametilrodamin etiketli peptid TAT bir disülfit bağ dimer belirleyerek bu sorunu hile var. Bu, canlı hücreleri nüfuz eder ve özellikle yüksek bir verimlilik ile hücrelerin sitosolik alan ulaşır prototip hücre nüfuz peptid (CPP) TAT, dfTAT, bir floresan etiketli dimer yarattı. DfTAT bölgesinin Sitosolik dağıtım birincil hücreler de dahil olmak üzere birden fazla hücre çizgileri elde edilir. Ayrıca, dağıtım belirgin hücre canlılığı, proliferasyonu veya gen ekspresyonunu etkilememektedir. dfTAT küçük moleküller, peptitler, antikorlar, enzimler ve biyolojik olarak aktif bir transkripsiyon faktörünü sağlayabilir. Bu raporda, dfTA katılan protokol tarifT sentezi ve hücresel teslimat. Eser hücre dışı İlaç olarak verilen proteinin miktarının değiştirilmesiyle hücre sitosolik alan teslim proteinin miktarının kontrolü açıklamaktadır. Son olarak, bu yeni teknoloji ve teslimat doğrulayarak katılan adımların güncel sınırlamalar tartışılmıştır. Tarif edilen protokoller, hücre bazlı deneyler hem de hücrelerinin ex vivo, manipülasyon ve yeniden programlama için çok yararlı olacaktır.

Giriş

Canlı hücrelere proteinler, peptitler ya da hücre-geçirgen olmayan küçük molekül iletilmesi pek çok biyolojik veya biyoteknolojik uygulamalar (hücresel görüntüleme işlevsel deneyler, hücre yeniden programlama, vb.) ^1-4 genellikle arzu edilen bir durumdur. Birçok dağıtım yaklaşımlar önce mikroenjeksiyon, elektroporasyon veya taşıyıcı maddelerin kullanımı da dahil olmak üzere, rapor edilmiştir (örn., Örneğin TAT hücre nüfuz peptidler, lipidler) ^5-7. Her teknik genellikle belirli uygulamalar için değil, başkaları için bu yaklaşımlar yeterli hale getirebileceğini belirli artıları ve eksileri vardır. Sık karşılaşılan sorunlar birkaç hücrelerde değil bütün bir halkın ve / veya eksikliği ^8,9 teslim edilir ne kadar malzeme kontrolü, toksisite veya zararlı fizyolojik etkisi ^10,11, zamansal kontrol eksikliği, teslimat kötü teslimat verimliliği (dahil örn., mikroenjeksiyon) ¹² ve karmaşık kimyasal çekimi veya formülasyon şemaları ^11.

s = "jove_content"> Son zamanlarda, biz bu sınırlamaları ortadan bir roman teslim strateji geliştirdik. Bu strateji dfTAT adında bir peptid (dimer floresan TAT) ¹³ dayanır. dfTAT iyi bilinen hücre nüfuz peptid (CPP) TAT türetilmiştir. dfTAT fluorofor tetrametilrodamin ile etiketlenmiş TAT iki disülfür bağlı bir kopyasını içerir. Onların benzerliklere rağmen, TAT ve dfTAT aktivitesinde önemli ölçüde farklıdır. TAT tipik endositoz ile hücre içine yerleştirilebilir. Bu CPP Ancak çoğunlukla (floresan mikroskobu ile incelendiğinde bu genellikle hücrelerin içinde peptid bir noktalı dağılımına yol) endozomlardan içinde sıkışıp kalır. TAT gibi, dfTAT verimli hücreler tarafından endocytosed edilir. Ancak, dfTAT endozomlardan içinde sıkışıp kalmıyor. Bunun yerine, son derece verimli bir şekilde endozomal sızıntı aracılık eder. DfTAT ve endosomolitik aktivitesi daha sonra basit bir kuluçka testi ile makromoleküllerin teslim için kullanılabilir.

şöyle ntent "> dağıtım işleminin mevcut anlayış. dfTAT makropinositoz neden olur. Sonuç olarak, dfTAT kuluçkaya hücreler sıvı faz ortam içinde mevcut olan çözünür protein, peptid, veya küçük molekülleri (ilgili moleküller, MOI) sürebilir endositoz (Şekil 1). dfTAT ve İçişleri arasındaki etkileşimler birlikte endositik yolunun içinde hem de kurumlar trafik sürece gerekli değildir. dfTAT endositik organellerin lümeni içinde belirli bir eşiğe ulaştığında, onun endozomal kaçak aktivitesini (moleküler ayrıntıları ifade dfTAT, çünkü bu yaklaşım Ayrıca. Bu nedenle MOI konjugasyon veya formülasyon düzenleri gerekli olduğu gibi çok uygundur.). tam olarak karakterize olması sızıntılı organellerin lümenin içeriğini kalır ve bu nedenle, İB, daha sonra hücrelerden salınan hücre içi taşıyıcı ulaşıldıktan sonra doğrudan MOI değiştirerek değil, aynı zamanda MOIS işlevine müdahale etmemelidir. Buna ek olarak, konsantrasyondfTAT dağıtım medyada MOI bu bağımsız kullanılır. Örneğin, dfTAT konsantrasyonu endozomal kaçağı tekrarlanabilir verim sağlamak için farklı deneyler arasında sabit tutulabilir. Bunun aksine, ortam içinde MOI konsantrasyonu giderek MOI sitozol içinde teslim istenen seviyelerinin elde edilmesi için değiştirilebilir.

DfTAT ile elde yüksek endozomal kaçak verimliliği bugüne kadar test edilen hücrelerin birçok dikkat çekici zararsız olduğunu. Endositik organelleri hücre önemli bir bileşenidir ve bir dfTAT aracılık dramatik kaçak zararlı hücresel yanıtları eşlik edeceğini beklenir, çünkü bu bir sürpriz oldu. Bununla birlikte, tedavi edilen hücreler, tedavi edilmemiş hücrelere aynı hızda çoğalır ve transcriptome önemli bir değişiklik göstermez. Ayrıca, dağıtım hücreleri kaybetmeden teslim sürecinden tahammül ya kurtarabilirsiniz ya belirten tekrarlanabilir dağıtım verimliliği ile birkaç dakika içinde tekrar edilebilirendositoz veya endozomal sızıntı onların kapasitesi. Ince hücresel yanıtları dfTAT teslimat ve bu yanıtların keşfedilmeyi beklemektedir ne olabileceğini moleküler ayrıntıları sırasında yer alabilir. Ancak, yüksek verim, protokollerin kolaylık ve toksisite eksikliği birleştirerek, bu teslim yaklaşımı birçok hücre tabanlı uygulamalarda hemen kullanışlı ispatlamak zorundadır. Burada sunulan protokolleri araştırma topluluğuna bu teknoloji erişilebilir hale getirmeyi amaçlamaktadır.

Protokol

1. SPPS: CK (TMR) TATG (fTAT) sentezi

Not: dfTAT iki aşamada üretilir: dfTAT oluşturmak için disülfid bağı dimerizasyonu, katı faz peptid sentezi ile, monomer fTAT sentezini.

1. 1 saat süre ile standart bir 50 ml SPPS kabı içinde dimetilformamid (DMF) içinde Rink Amide MBHA reçinesinin 500 mg kabarma.
2. .% 20'lik bir piperidin çözeltisi (DMF içinde% 20 piperidin, 10 ml (0.30 mmol) Fmoc korumalı reçine inkübe edilerek Fmoc korumasının kaldırılması gerçekleştir (1 x 5 dakika ve yıkama aşaması ile birlikte 1 x 15 dak) ile iki kez koruma kaldırma adımları tekrarlayın DMF (yıkama aşaması DMF, yaklaşık 150 ml'lik bir toplam hacim reçineye birden çok kez durulama ve vakumla süzme ile çözücünün çıkarılması dahil olmak üzere) reaksiyonları arasında.
3. Alani amid MBHA reçinesi üzerinde CK (TMR) RKKRRQRRRG (fTAT) sentez. Kullanım Fmoc korumalı amino asitleri aşağıdaki gibidir: Fmoc-Lys (Mtt) -OH (sadece N terminaline), Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc- Gln (Trt) -OH, Fmoc-Cys ve (Trt) -OH. Reaksiyonu kışkırtmak N ₂ (20 PSI) ile reaksiyonu yürütmek. Oda sıcaklığında bütün reaksiyonlar gerçekleştirin.
   1. 4 saat süre ile, her bir amino asit birleştirme reaksiyonunu yürütmek. Her bir bağlantı için, Fmoc korumalı amino asit (1.2 mmol), N, N, N ', N' tetrametilsiklopentadienil O- (1H-benzotriazol-1-il) üronyum hekzaflorofosfat (HBTU) (0.44 g, 1.1 mmol korumalı kullanımı DMF içinde çözülmüş), ve diizopropiletilamin (DIEA) (0.51 mi, 3.0 mmol) eklenmiştir. 4 saat Kenetleme yapıldıktan sonra DMF ile reçinenin yıkanması ve aşama 1.2'de tarif edildiği gibi Fmoc korumasının kaldırılması adımı gerçekleştirmek.
   2. (: CKRKKRRQRRRG no TMR Lineer peptid zinciri) sentezlendi fTAT doğrusal peptit zinciri kadar tekrarlayın.
   3. Daha sonra iyice birinci DMF kullanılarak ve diklorometan (DCM) ile takip eden reçine yıkayın. DMF veya DCM, yaklaşık 150 ml'lik bir toplam hacim reçineye birden çok kez yıkayın ve vakum süzme ile ayrılması için kullanılabilir.
   4. Use MALDI-TOF Elde edilen peptid, doğru moleküler ağırlığa sahip olduğu teyit etmek için.
      1. Su çözeltisi içinde% 0.01 TFA, 50 ul asetonitril, 50 ul oluşan bir çözeltiye matris 1 mg ekleyerek bir matris karışımı yapın.
      2. Lineer peptit zinciri kütlesi teyit etmek için, α-siyano-4-hidroksisinamik asit kullanın. Ham peptid analitik HPLC çalıştırın ve saf tepe üstünden 50 ul toplamak.
      3. MALDI plaka plaka numunesinin hazırlanması için: Kuru veya 37 ° C ısıya plaka üzerinde yayınlamak için MALDI plaka üzerinde matris solüsyon ve yer 2 ul peptidin 8 ul ekleyin.
         Not: Arginin SPPS'si çiftin zor olan bir amino asit olduğu bilinmektedir. Başarılı birleştirme Kaiser testi ¹⁴ (örneğin, ninhidrin testi) yapılarak oluşturulur. Bu test reçine Kuplajsız kalabilir serbest aminlerin tespiti için izin verir. Durumda, sabit bir mavi renk (serbest aminler varlığının göstergesidir) tespit edilir, birleştirme sTeps'in tekrar edilir.
4. CK için (= NH-TMR) TATG (fTAT),% 1 trifluoroasetik asit (TFA) ve% 2 triizopropilsilan oluşan bir çözelti ile CK Lys-amino grubunda (-NH-Mtt) TATG Mtt koruma grubunun yanlması DCM (TBS).
   1. MTT koruma grubunun çıkarılması, sarı bir rengin ortaya çıkması ile sonuçlanabilir ki gibi, 5 dakika boyunca, yukarıda çözeltisi 20 ml reçine inkübe sarı renk elde edilinceye kadar, bu tekrarlayın. Arasında, DCM ve DMF reçine yıkanır. TIS MTT temizlemek olan bir çöpçü Ayrıca, çünkü bir kez sarı renkli MTT mevcudiyetinde çözelti içinde görüntülenir.
   2. Daha MTT sağlamak için reçineye, DCM içinde% 1 TFA (herhangi bir TBS) ile ilave bir solüsyonu ilave çıkarılır ve çözelti, açık kalır.
5. DMF (() mg reçine miktarına göre 4, 3.9 ve 10 denklik) Carboxytetramethylrhodamine (TMR), HBTU ve DIEA ve bu karışımı ekleyin: üç bileşeni çözülürreçine ve reaksiyon O yürütmek / N karıştırma sağlamak için kuru N ₂ kullanarak.
6. Fmoc-korumasının giderilmesinden ve amino asit Konjügasyondan sonra DCM ile reçinenin yıkanması ve kurutun. Peptidin reçineden komple klevajından için, 92.5% TFA,% 2.5 ihtiva eden bir çözelti ilave _H2O,% 2.5, TIS, ve 3 peptidil-reçineye% 2.5 etanditiol (EDT) (toplam hacim = 4 mi) oda sıcaklığında saat reçineden genel koruma açma ve klevajını elde etmek mümkündü.
   1. Et _{2 O} 40 ml adım 1.6 çözeltinin boşaltılması soğuk susuz etil eter (Et ₂ O) kullanılarak ham peptid ürünü Çökelti, 4 ° C'de, bu aşağı doğru döner ve 20 için 4000 xg - 25 dak. Soğuk susuz Et ₂ O. ile çökelti yıkama izin vermek için bu adımı tekrarlayın
   2. Su (5 ml ya da çökelti tamamen eriyene kadar) ve liyofilize çökeltilerin yeniden süspanse edin. Daha sonra% 0.1 sulu TFA / asetonitril içinde elde edilen ürünler yeniden süspanse edin.
7. analitik C18 kolonu (5 um, 4 x 150 mm) her peptid analiz HPLC analizi yapın. 214 nm ve 550 nm 'de bir akış 1 ml / dakika hızını ve algılama kullanın.
8. Peptit saflaştırılması için bir C18, 10 x 250 mm sütun üzerinde, yarı-preparatif HPLC gerçekleştirin. 214 nm ve 550 nm 'de bir akış 4 ml / dk'lık bir oranı ve algılama kullanın. Tüm işlemler için,% 0.1 sulu TFA (solvent A) ve% 90 asetonitril,% 9.9 su ve% 0.1 TFA (solvent B) doğrusal gradyanlar kullanımı.
9. FTAT, beklenen kütle: 2,041.17, gözlemlenen kütle: 2040.66, üreticinin protokolüne uygun olarak MALDI-TOF ile peptidlerin, doğru kimliğini teyit edin. Kütle beklenen DEAC-K9: 1,415.59: 1,412.97, kütle görülmüştür. MALDI-TOF için α- siyano-4-hidroksisinamik asit matris kullanın.

2. Oksidasyon reaksiyonu: dfTAT Üretimi

1. 1 saat (aşağıdaki reaksiyon için, en az 5 mi), fosfat tamponlu salin (PBS) pH 7.4 havalandırın.
2. AER bölgesindeki fTAT (0.3 mg, 1.5 x 10 ^-4 mmol) çözülürated PBS pH 7.4 (5 mi). Peptidin ilavesinden sonra 7.5 - pH 7.0 arasında olduğundan emin olun. Sodyum hidroksit ilave değilse (küçük artışlarla 1 M, 1-5 ul) geri 7.4 kadar pH değeri getirmek için.
3. Not: PBS içinde çözülmüş oksijen fTAT tiol grupları oksitleyerek, bir disülfid bağ oluşturmak üzere hareket eder.
4. Reaksiyon O Nutate / N tamamlanmadan (HPLC analizine göre% 100 verim) kadar reaksiyona girmesine izin vermek. Ters faz HPLC ile ürünün saflaştırmak ve adım 1.9 olarak kütle spektrometrisi (MALDI-TOF) ile analiz edilmiştir. Beklenen kütle: 4,084.21: 4,080.34, kütle görülmüştür.
5. 200 ul su içinde Lyophilize saf dfTAT (0.71 x 10 ^-4 mmol) ve tekrar süspansiyon (konsantrasyon saf dfTAT = 356,3 uM).

3. dfTAT Konsantrasyon ölçüm

1. 50 mM TCEP solüsyon 149 ul saflaştırılmış dfTAT (saflaştırılmış peptid miktarına bağlı olarak, tipik olarak 1 ul), bir kısım yeniden süspanse edin.
2. Not: Bu adımda dfTAT kendi mo indirgenirnomer muadili fTAT nedeniyle dfTAT bölgesindeki TMR fluorofor yakın bir yerde (in dfTAT TMR ekstinksiyon katsayısı ε indirgenmiş fTAT bölgesindeki TMR nin s kıyasla azaltılır) oluşur absorbans su verme ortadan kaldırmak için.
3. Örnek yaklaşık 20 dakika boyunca reaksiyona girmesine izin verir (analitik HPLC fTAT oluşumu teyit etmek için kullanılabilir).
4. Kuvars küvetine tüm çözüm ekleyin ve 556 nm'de absorbansı ölçün.
5. Beer Kanunu Kullanma (A = εcl: ε = 91500 M ^-1 cm ^-1), fTAT konsantrasyonunu hesaplamak dfTAT konsantrasyonunu belirlemek ve iki tarafından [fTAT] bölmek için.

4. Hücresel Gönderme Deneyler

1. % 90 (örn 8-kuyu veya 24 kuyu çanak) - 80 konfluansa bir tabak hücreler (. HeLa, HDF, vs.) Tohum. Bir 37 ° C% 90 konfluent - uygun bir ortam içinde hücreler büyümek 80 kadar (örneğin, DMEM,% 10 FBS ve Pen / Strep ile takviye edilmiş)% 5 _CO2 içeren nemlendirilmiş atmosfer.
2. (Üç kez çıkarılması daha sonra PBS içinde 200 ul ilave edilerek) hücreler üç kere PBS ile (3X) yıkayın.
3. (8 de toplam hacim 200 ul olmalıdır çanak için) NRL-15 ortamı (su içinde) dfTAT bir stok seyreltilmesiyle dfTAT bir 5 uM çalışma konsantrasyonu yapın. 5 uM dfTAT bir konsantrasyon olarak etkili taşınmasında, tarih (Şekil 3) test edilen pek çok hücre tipinde (bir tabak içinde bulunan hücrelerin% 90'ından fazlası sitozolik teslimat yüksek düzeyde) neden olur. Bununla birlikte, daha düşük ya da daha yüksek konsantrasyonlarda nüfuz etmesi için yüksek ya da düşük eğilimi olan hücre türleri için daha uygun olabilir.
   MEDYA Not: dfTAT disülfid bağı azaltabilecek sistein içermediği NRL-15 dfTAT verilmesi için kullanılır. Ancak, veri hem normal L-15 (sistein ile) ve DMEM dağıtım ortamı olarak kullanılabileceğini göstermektedir. L-15 indirgeme amino asit sistein, ancak sistein presumab içerirly (DMEM sistin ile formüle edilmiştir) sistin oluşturulması için medya okside. dfTAT dolayısıyla bu ortam içinde bozulmadan kalır ve dağıtım nrL15 ile elde edilen ile aynı etkinlikte çalışır.
4. Ya da yük olmadan dfTAT (5 uM) (örn.,, EGFP (10 uM)) kuluçkaya bırakılır ve (kuluçkalama süresi azaltılabilir, ancak dfTAT tipik olarak endozomal sızıntı uyarılması için yaklaşık 30 ila 45 dakika gerektiren 1 saat süre ile 37 ° C 'de devam ).
5. (3 yıkama tavsiye edilir), hücrelerin plazma zarına bağlanmış dfTAT kaldırmak için L-15 heparin (1 mg / ml) ile hücrelerin yıkayın.
6. Uygun cep geçirmeyen Nükleer soya, kuluçkaya bırakılır, örneğin., Sytox Mavi, Sytox Yeşil (NRL, 15-2 uM), hücrelerin plazma zarı tehlikeye olup olmadığını belirlemek için (canlı hücreler olmaz ise ölü hücreler boyanmış olacaktır) Üreticinin protokolü.
7. Bir floresan mikroskop (100X immersiyon yağı veya 20X objektif) kullanarak görüntü hücreleri. Bir RFP filtre kullanarak Görüntü dfTAT (Ex =560 ± 20 nm / Em = 630 ± 35 nm).
   Not: başarılı dağıtım hücre boyunca dfTAT yayılmış bir floresan (uygulamaya bağlı olacaktır proteinin veya ilgili peptidin teslim değerlendirilmesi) yol açar. FTAT (sitosolik girişi üzerine dfTAT azaltılmış ürünü) ile nukleoli boyanması tespit floresans hücre içi olduğuna dair bir gösterge olarak kullanılabilir. fTAT birkaç saat içinde düşer. Bu noktada, parçalanma fragmanları floresan punktat olarak görünür. Bu dfTAT başarısız (dfTAT bir konsantrasyon çok düşük de varsa bu olur) endozomlardan içinde sıkışıp kalırsa da görülür noktasal dağıtımı için karışık olmamalıdır.

Teslim İçişleri Bakanlığı 5. denetimden geçmiş Konsantrasyon

1. Kullanılan hücre tipinde dfTAT verimli sitozolik serbest ulaşmak için gerekli "optimal dağıtım" konsantrasyonunu belirleyin. Increasin ile kuluçkaya hücreler üzerinde floresan mikroskobu gerçekleştirindfTAT g konsantrasyonları. Optimal dfTAT konsantrasyonu sitosolik temizlemek için neden minimum konsantrasyon olarak tanımlanan bir kültür içindeki hücrelerin yaklaşık% 100 TMR floresan "yaygın".
2. (DfTAT optimal dağıtım konsantrasyonu kullanılarak, örneğin) dfTAT sabiti konsantrasyonunu tutarken İçişleri Bakanlığı konsantrasyon eş kuluçka protokolünde kullanılan Vary. Az 1 saat inkübasyon süresi değiştirilmesi İçişleri Bakanlığı teslim miktarını değiştirmek için bir seçenek olabilir.

Sonuçlar

FTAT ve dfTAT arasındaki farkı değerlendirmek için, HeLa hücreleri, hücresel lokalizasyon farkını belirlemek için her peptit ile 1 saat süre ile inkübe edilir. İki CPP en içselleştirilmesi floresan mikroskopi kullanılarak değerlendirildi. FTAT (20 mcM) bir noktasal dağılımı lokalize 2 gösterileri Şekil. Peptid endozomlardan içinde sıkışan kalan bu dağılım tutarlıdır. Bunun aksine, dfTAT (5 uM) floresans sinyali sitosol ve nükleus içinde homojen bir dağ?...

Tartışmalar

Çünkü bu aşırı konfluent olmamalıdır dfTAT teslimat için kullanılan hücreler (>% 90 konflüans) verme etkinliğini etkileyebilir. Hücreler de sağlıklı olması gerekir: kültürdeki ölü hücreler dfTAT (bozulmuş çekirdekten örneğin DNA) etkileşim hangi ile apoptotik parçaları serbest bırakabilirsiniz. Bu da bu uygulama randımanına ve görüntüleme kalitesini engelleyebilir. Hücreler dfTAT eklemeden önce FBS kaldırmak için iyice yıkanmalıdır. FBS içinde BSA bulunan dfTAT ba?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin	Sigma	CAS 9041-08-1
SYTOX Blue	Invitrogen	S11348
SYTOX Green	Invitrogen	S7020
nrL15 L-15 (–) cysteine	Hyclone		Special order
Fmoc-protected Amino acids	Novabiochem
dfTAT			Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu)
Biosafety Cabinet
Inverted epifluorescence microscope	Olympus	model IXB1	equipped with a heating stage maintained at 37 °C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging).
37 °C humidified, 5% CO2 incubator
Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis