Monitoreo de la homeostasis del calcio del retículo endoplasmático Usando una<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferasa SERCaMP

Resumen

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Resumen

El retículo endoplasmático (ER) contiene el mayor nivel de calcio intracelular, con concentraciones aproximadamente 5000 veces mayor que los niveles citoplasmáticos. El control estricto sobre el calcio ER es imprescindible para el plegamiento de proteínas, la modificación y la trata. Las perturbaciones a ER de calcio pueden dar lugar a la activación de la respuesta de la proteína desplegada, un mecanismo de respuesta de estrés ER de tres patas, y contribuir a la patogénesis de una variedad de enfermedades. La capacidad de monitorear alteraciones de calcio ER durante el inicio de la enfermedad y la progresión es importante en principio, pero difícil en la práctica. Los métodos actualmente disponibles para el monitoreo de calcio ER, tales como tintes y proteínas fluorescentes dependientes de calcio, han proporcionado información sobre la dinámica del calcio ER en las células, sin embargo estas herramientas no son muy adecuados para estudios in vivo. Nuestro laboratorio ha demostrado que una modificación en el carboxi-terminal de la luciferasa Gaussia confiere la secreción del reportero en respuesta aEl agotamiento de calcio ER. Los métodos para utilizar una luciferasa basado, proteína de monitoreo de calcio ER secretada (SERCaMP) para in vitro e in aplicaciones in vivo se describen en el presente documento. Este vídeo destaca inyecciones hepáticas, la manipulación farmacológica de Gluc-SERCaMP, extracción de sangre y el procesamiento y los parámetros de ensayo para el control longitudinal de calcio ER.

Introducción

Las funciones en muchas capacidades celulares incluyendo plegamiento de proteínas, la secreción de proteínas, homeostasis de los lípidos, y de señalización intracelular ¹ retículo endoplasmático (ER). Central a la función normal ER es mantener las concentraciones de calcio luminal a ~ 5.000 veces mayores que se encuentran en el citoplasma ^2-4. Este proceso intensivo de energía está regulado por la ATPasa de calcio Sarco / retículo endoplásmico (SERCA), una bomba que mueve iones de calcio en la sala de emergencias. Flujo de calcio desde el ER está mediada principalmente por la rianodina (RyR) e inositol trifosfato (IP3R) receptores. Debido a que muchos procesos ER son dependientes de calcio, lo que altera la tienda puede conducir a estrés ER y la muerte celular eventual.

ER desregulación de calcio se ha observado en enfermedades como la cardiopatía, la diabetes, el Alzheimer y el Parkinson ^5. Debido a la naturaleza progresiva de estas enfermedades, ha sido un reto para delinear la causa-efecto relación entre patogénesis y alteraciones en la tienda de calcio ER. Varias tecnologías han permitido importantes avances en nuestra comprensión de la dinámica del calcio ER, incluyendo colorantes e indicadores de calcio codificados genéticamente (Gecis). Baja afinidad colorantes de calcio, que aumentan en la fluorescencia cuando se une a Ca ^2+, se pueden cargar en las células para examinar compartimentos subcelulares con altas concentraciones de calcio ^6. Gecis, tales como D1ER y el receptor permite la monitorización de las fluctuaciones de calcio con un control más preciso de la localización subcelular ^7-9. Recientemente, otra clase de Gecis llama indicadores de proteínas de orgánulos atrapado en calcio de medición (CEPIA) se han descrito ^10. Un tercer enfoque que combina la genética y la química pequeña molécula es-esterasa específica colorante de carga (TED), que utiliza una carboxilesterasa codificado genéticamente (dirigido a la ER) con un colorante de calcio a base de éster ^11.

Mientras que el AFORenfoques ementioned tienen fortalezas y debilidades inherentes, pueden proporcionar información valiosa sobre la dinámica del calcio ER a través de mediciones agudos de fluorescencia. Ellos son, sin embargo, no es óptimo para los estudios longitudinales a menudo necesarias para investigar la progresión de la enfermedad. Con el objetivo de diseñar un método para controlar la dinámica del calcio durante períodos prolongados de tiempo, hemos identificado y desarrollado una modificación de proteínas para crear las proteínas secretadas calcio ER monitoreo ^(SERCaMPs) 12.

SERCaMP sortea varias limitaciones asociadas con otras metodologías, proporcionando un método mínimamente invasivo para interrogar en varias ocasiones el almacén de calcio ER. Hemos demostrado anteriormente que la ASARTDL péptido carboxi-terminal (alanina-serina-alanina-arginina-treonina-ácido aspártico-leucina) es suficiente para promover la retención de ER; Sin embargo, bajo condiciones que causan disminuciones en calcio ER, la secuencia del péptido ya no es capaz de retener localizatio ERn y la proteína es secretada ^13. La base de la tecnología SERCaMP es el apéndice de ASARTDL a la carboxi-terminal de una proteína secretada (por ejemplo, luciferasa Gaussia, o gluc) de modo que la secreción es provocada por el agotamiento de calcio ER, creando así un reportero robusta de ER disregulación de calcio ^12. La expresión de Gluc-SERCaMP a través de métodos transgénicos permite fluidos biológicos incluyendo medio de cultivo celular y plasma a analizar los cambios en la actividad gluc como un indicador de la homeostasis del calcio ER. El método tiene aplicaciones para el estudio longitudinal de alteraciones progresivas en la tienda de calcio ER tanto in vitro como in vivo. El siguiente protocolo se escribe como un esquema general para el uso de SERCaMP basado en gluc para estudiar la homeostasis del calcio ER, pero el protocolo puede servir como una guía para SERCaMPs informadores alternativos.

Protocolo

1. Ensayo in vitro: Detectando SERCaMP de lanzamiento de una línea celular estable SH-SY5Y

1. Placa SH-SY5Y-Gluc-ASARTDL (SERCaMP) en placas de cultivo de tejidos tratados en 150.000 células por cm ² de superficie. Para placas de 96 pocillos, por ejemplo, semilla de 50.000 células por pocillo (Figura 1a). Crecer células SH-SY5Y en DMEM (glucosa alta, GlutaMAX, piruvato) + crecimiento bovino 10% de suero + 1x penicilina / estreptomicina.
   1. Células Passage hasta 15 veces (Figura 1B). Número de pases Superior no ha sido probado.
   2. Células Regreso al incubador humidificado a 37 ° C con 5,5% de CO ₂ y se incuba durante la noche.
2. Antes del tratamiento experimental (s), recoger una muestra de línea de base para cada pocillo mediante la transferencia de 5 l de sobrenadante de cultivo a una opaca amurallado placa de 96 pocillos. Antes de recoger, golpear suavemente la placa en todos los lados y agitar para evitar efectos de degradado. Sellar la placa opaca con un adhesivo shoja de Ealing y almacenar a 4 ° C hasta el momento del ensayo enzimático.
   Nota: Secretada Gluc-SERCaMP es muy estable en medio de cultivo celular. Hemos informado anteriormente de aproximadamente el 10.5% de la actividad Gluc se perdió después de una incubación de 72 horas a 37 ° C (se incubaron en SH-SY5Y células) ^12.
3. Tratar a las células como se desee para examinar el agotamiento de calcio ER (por ejemplo, medio ambiente, farmacológico, las manipulaciones genéticas). Evite la exposición prolongada al entorno ambiental (fuera de la incubadora controlada) como los cambios de pH se producirá rápidamente a CO ₂ atmosférico. Añadir HEPES al medio de cultivo a 20 mM, pH ¹⁴ para estabilizar, si se requieren manipulaciones prolongados. Evite la exposición a la luz cuando se utiliza HEPES en medio de cultivo ^15.
   1. Control positivo: tratar las células con 100 nM thapsigargin (Tg) o ácido ciclopiazónico 50 mM (CPA) durante 4-6 hr para los experimentos en células SH-SY5Y. Respuesta máxima en otras líneas celulares puede requerir incubaciones más largas o diferentes concentraciones de compuestos.
   2. Control negativo: medio de cultivo Colecta de las células SH-SY5Y parentales. En nuestra experiencia, la luminiscencia de fondo para este ensayo es inferior al 0,05% de la secreción basal de las células SH-SY5Y-Gluc-SERCaMP estables.
4. Recoger y almacenar muestras de 5 l de medio condicionado en los puntos de tiempo deseados, como se indica en el paso 1.2.
5. Evaluar la actividad enzimática en el medio como se indica en la Sección 5.
6. Examinar gluc intracelular mediante inmunotransferencia o ensayo de luminiscencia.
   1. Para inmunoblot: lisan las células en tampón RIPA modificado que contiene 50 mM Tris (pH 7,4), NaCl 150 mM, 0,25% de desoxicolato de sodio, EDTA 1 mM, 1% de NP40, y los inhibidores de la proteasa. Separar en gel de poliacrilamida-SDS y transferencia a una membrana de 0,20 micras PVDF. Incubar la membrana con anticuerpo Gluc (1: 2000 dilución) durante la noche a 4 ° C. Realizar incubación del anticuerpo y de membrana lavados secundarias según el protocolo definido por el usuario para el reactivo de detección de elección.
   2. Porensayo de luminiscencia (Figura 2): realice los pasos siguientes en el hielo:
      1. Retire todo el medio de los pozos de la placa de cultivo de tejidos y enjuague con 200 l de PBS frío.
      2. Añadir 75 l de tampón de lisis que contiene 50 mM Tris (pH 7,5), NaCl 150 mM, 1% de NP40 y los inhibidores de proteasa a cada pocillo.
      3. Girar la placa en un agitador orbital (120 rpm) a 4 ° C durante 20 min.
      4. Pipeta suavemente el lisado arriba y abajo utilizando una pipeta multicanal, evitando las burbujas de aire. Transfiera 5 l de lisado a una placa opaca y evaluar luminiscencia como se indica en la Sección 5.

2. Ensayo in vitro: transfección transitoria de células inmortalizadas con SERCaMP

Nota: Hemos observado que los procedimientos de transfección transitoria pueden inducir estrés celular y mitigar la posterior respuesta Gluc-SERCaMP. El siguiente enfoque fue desarrollado para minimizar eff transfección eja en SH-SY5Y células. Puede ser necesario Optimización de este procedimiento (incluyendo la elección de reactivo de transfección) para líneas celulares alternativos. Cuando sea posible, se recomienda el uso de líneas celulares estables o métodos de transducción virales descritos en las secciones 1 y 3, respectivamente.

1. Placa SH-SY5Y células en un plato de 100 mm a 4 x 10 ⁶ células. Este plato será suficiente para volver a la semilla aproximadamente 300 pozos (96 formato de placa de) Siguiendo el procedimiento de transfección.
2. Transfectar células con Xfect reactivo usando 20 g de ADN plásmido (que codifica Gluc-SERCaMP) y 6 l de reactivo Xfect. ADN Escala y reactivo Xfect consecuencia para recipientes de cultivo más grandes o más pequeñas.
3. Células Volver a la incubadora durante 48 horas.
4. Tripsinizar las células y sembrar de nuevo a placas de 96 pocillos a 60.000 células por pocillo. Siga los pasos siguientes se describen en la Sección 1.

3. Ensayo in vitro: viral mediada por vector de expresión de Gluc-SERCaMP

tienda "> Nota: viral adeno-asociado (AAV) envases de vectores ¹⁶ y purificación ^{12 y} lentivirus producción ¹³ han sido reportados previamente.

1. Titer Gluc-SERCaMP AAV usando los siguientes cebadores y sondas: cebador directo, 5'-CACGCCCAAGATGAAGAAGT-3 '; cebador inverso, 5'-GAACCCAGGAATCTCAGGAATG-3 '; sonda (5'-6-FAM / 3'-BHQ-1 marcado), 5'-TACGAAGGCGACAAAGAGTCCGC-3 'para la PCR cuantitativa.
   1. Preparar la curva estándar linealizando un plásmido que contiene gluc y purificar el ADN utilizando un spin-columna (por ejemplo Machery-Nagel NucleoSpin Gel y PCR de limpieza). Cuantificar el ADN mediante la separación en un gel de agarosa al lado de una escalera de masas. Preparar diluciones 1:10 de ADN a partir de 100 pg / ml a 10 fg / ml en PBS. Calcular las copias / ml de ADN de plásmido gluc en cada una de las concentraciones con base en el peso molecular del plásmido.
   2. Diluir las poblaciones de AAV en PBS (dilución apropiada dependerá deparámetros de la preparación viral y determinado empíricamente).
   3. Ejecutar la reacción de PCR en un sistema de PCR en tiempo real usando las siguientes condiciones: 95 ° C × 5 min, 94 ° C x 20 seg, y 60 ° C × 1 min durante 41 ciclos. Calcular copias / ml usando la curva estándar.
2. Lentivirus título con un Lenti-X kit de titulación rápida p24. Descongele alícuotas lentiviral en hielo y se diluye la proteína p24 en el control medio SH-SY5Y.
   1. Diluir la lentivirus tal que caerá en la curva estándar (por ejemplo, 1: 20.000 ó 1: 100.000). El factor de dilución requerida variará en función de los parámetros de preparación de lentivirus y debe ser determinado empíricamente. Siga las instrucciones del fabricante para todos los pasos posteriores.
3. Células de la placa a placas de 96 pocillos. Para las células SH-SY5Y, procedimientos de chapado señalados en la Sección 1 se pueden seguir. Para neuronas corticales primarias de rata, las células deben ser aislados y se sembraron en placas recubiertas adecuadamente as descrito previamente ^16. Mantener las neuronas corticales primarias de rata en medio Neurobasal complementado con 1x B27 y 500 mM de L-glutamina. Realizar intercambios medianas y medio cada dos días.
4. Transducir las células con virus. El objetivo de la transducción viral es lograr bajo nivel de expresión, como Gaussia luciferasa proporciona señal robusta.
   1. De transducción de AAV SH-SY5Y células: transducir el día siguiente de chapado. Diluir AAV a 6,0 x 10 ⁷ vg / l en tampón de dilución de AAV (PBS + 0,5 mM _MgCl2). Añadir 5 l de AAV diluido (3,0 x 10 ⁸ vg; MOI de aproximadamente 6000) por pocillo de placa de 96 pocillos (Figura 3A). Utilice lejía al 10% para inactivar los residuos vector viral.
   2. AAV transducción de rata neuronas corticales primarias: transducir 6-8 días después de la siembra. Diluir AAV a 4,0 x 10 ⁶ vg / l en tampón de dilución de AAV. Añadir 5 l de AAV diluido (2,0 x 10 ⁷ vg; MOI de aproximadamente 350) por pocillo dePlaca de 96 pocillos (Figura 3B). El MOI óptima debe determinarse empíricamente para otros tipos de células. Utilice lejía al 10% para inactivar los residuos vector viral.
   3. Lentiviral transducción de las células SH-SY5Y: transducir el día siguiente de chapado. Diluir lentivirus a 20 pg / l p24 (concentración determinada usando el kit de titulación) en solución salina equilibrada de Hank. Añadir 5μl de virus diluido por pocillo (100 pg de p24, equivalente a 1.250.000 partículas lentivirales, o ~ 1250 IDU) de una placa de 96 pocillos que contiene 100 l de volumen. Escala en consecuencia para los formatos más grandes. Utilice lejía al 10% para inactivar los residuos viral.
5. Se recoge una muestra de pre-tratamiento de mediano y comenzar tratamientos experimentales 48 h (SH-SY5Y) o 5-7 días (rata neuronas corticales primarias) después de la transducción.

4. Ensayo In Vivo SERCaMP

Nota: Antes de realizar cualquier procedimiento de animales que asegúrese de obtener la aprobación adecuada a través de su institución. Todocirugías de supervivencia son que hacerse bajo condiciones estériles con anestesia adecuada. Todos los procedimientos descritos a continuación han sido aprobados y están en conformidad con las directrices del NIH ACUC.

1. Instrumentos quirúrgicos autoclave antes del inicio de la cirugía (121 ° C, 30 min esterilización, 20 min de tiempo de secado). Limpie todos los instrumentos en una ultrasonicador inmediatamente después de todos los procedimientos y antes de la esterilización en autoclave. Mantener condiciones estériles durante la cirugía de supervivencia. Para las cirugías que requieren múltiples animales, limpie instrumentos quirúrgicos con 70% de alcohol, ultrasonicate y grano esterilizar entre las ratas. Consulte la Lista de materiales para los instrumentos necesarios.
2. Preparar la rata para la cirugía. Aquí se utiliza macho Sprague-Dawley (de 180-200 g).
   1. Anestesiar ratas utilizando isoflurano gas durante 3 min (4-5% de isoflurano, presentadas en 1000 cc / min) seguido por inyecciones intraperitoneales de xilazina (8 mg / kg) y ketamina (80 mg / kg). Aplicar pomada oftálmica para proteger las córneas se sequen. Bcirugía egin una vez que la rata está profundamente anestesiado, como lo demuestra la falta de reflejo de retirada tras la cola o pellizco pie.
   2. Shave la región de abdomen ligeramente por debajo de las costillas (baja región torácica) a la región abdominal media. Frote el área quirúrgica tres veces, alternando 70% de alcohol y Betadine matorrales. Coloque rata en posición supina en el área quirúrgica estéril con paños quirúrgicos estériles.
3. Diluir AAV-Gluc-SERCaMP a 7,6 x 10 ⁹ VG / ml (concentración final). Mezclar bien invirtiendo el tubo.
   Nota: El rango de concentración viral puede variar (Figura 4).
   1. Pipetear 105 l de AAV diluida en un plato estéril. Utilice una aguja de calibre 30 para recoger el virus en una jeringa.
4. Realizar la cirugía para exponer el hígado e inyectar AAV-Gluc-SERCaMP.
   1. Antes de hacer una incisión en el abdomen, se aplican 0,25% de bupivacaína al área de la incisión. Usando un bisturí, hacer una incisión horizontal debajo de la caja torácica (apmadamente 2-3 cm). Blunt disección para separar el tejido conectivo de la hipodermis.
   2. Cortar el músculo abdominal, exponiendo el lóbulo medial derecho del hígado.
      Nota: lóbulos adicionales se pueden inyectar basado en la aplicación final.
   3. Coloque animal bajo microscopio quirúrgico y ajuste para obtener el lóbulo medial derecho del hígado en el campo de visión. Inyectar virus en el parénquima del lóbulo medial; 3 sitios separados, aproximadamente 33 l por sitio.
      Nota: Deje la aguja en el tejido durante 5-10 segundos después de la inyección para asegurar la entrega de todo el volumen de inyección.
   4. Suturar el músculo abdominal y la piel por separado y añadir Neosporin utilizando algodón aplicador con punta. Coloque rata en una cámara de recuperación hasta que la conciencia se recuperó y la rata es capaz de mantener la posición vertical. No deje de rata (s) sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. Casa por separado hasta que la incisión haya cicatrizado y las suturas se han eliminado (7-14 días).
      Nota: Según el NIH directrices post-quirúrgicas, mantener un registro quirúrgico. Anotar tarjeta de jaula con el procedimiento, la fecha, el identificador de experimento, el peso corporal, y el día de la cirugía. El dolor la angustia, la producción de heces, la actividad, y los alimentos y el consumo de agua / deben ser monitoreado y grabado 3 días posteriores a la cirugía. La analgesia postoperatoria se proporciona mediante la adición de acetaminofeno al agua potable (450 mg / 100 cc) a pesar de que no suelen observar signos de dolor o malestar después de la cirugía.
5. Comienza la recogida de sangre de la cola de 4-7 días después de la inyección. Preparar los tubos de extracción de sangre por medio del etiquetado y pre-pesaje. Añadir 50 l de heparina (1.000 U / ml) a cada tubo.
6. Lugar de rata en la cámara de anestesia con isoflurano durante 3 min (4-5% de isoflurano pronunciado en 1000 cc / min). Retire la rata desde la cámara y el lugar en el cono de la nariz (2-3% de isoflurano pronunciado en 500 cc / min). La recogida de sangre puede comenzar una vez que la rata está profundamente anestesiado, como lo demuestra la falta de reflejo de retirada tras pi colanch.
   1. Con unas tijeras estériles punta cortada de la cola (1-2 mm) y recoger la sangre gota a gota en el tubo de heparina precargada. Recoger la sangre hasta que el volumen alcanza mayor que 2: 1 de sangre a la proporción de heparina (> 100 l de sangre / 50 l de heparina). Los volúmenes de extracción de sangre se pueden ajustar según el diseño experimental. Use un aplicador de algodón húmedo para aplicar polvo astringente a la cola para detener el sangrado.
   2. Tubos de sangre se almacena a 4 ° C si la recogida de muestras posteriores. Limpie las tijeras con la pista de etanol y grano esterilizar entre colecciones.
   3. Pesar los tubos de recogida y ajustar con heparina para obtener 2: 1 ratio (sangre: heparina). Este paso normalizar la cantidad de heparina en cada muestra (Tabla 1).
   4. Tubos centrífuga a 2000 xg durante 5 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante (plasma) a un tubo nuevo y almacenar a -80 ° C hasta el momento de ensayo de luciferasa (artículo 5).
      Nota: El almacenamiento de muestras a 4 ° C hasta 72 hr antes del ensayo enzimático tiene minimal efecto en la luminiscencia (Figura 5A). Hasta 3 ciclos de congelación y descongelación de las muestras de plasma no tienen efecto sobre la luminiscencia (Figura 5B).
7. Administración tapsigargina (control positivo):
   1. Preparar thapsigargin diluyendo en etanol a una concentración final de 2,5 mg / ml. Inyectar thapsigargin a 1 mg / kg ip en el abdomen inferior.
      Nota: tapsigargina aumenta inducida por trombina de las plaquetas de la coagulación ¹⁷ y puede hacer que la recogida de sangre de la cola más difícil.
8. Gaussia ensayo de luciferasa:
   1. Descongele las muestras de plasma en el hielo.
      Nota: Para los estudios longitudinales, deshielo y realizar ensayo de luminiscencia para todas las muestras punto de tiempo en el mismo día (usando la preparación individual de sustrato).
   2. Transferencia de 10 l de plasma a una placa de pared opaca y medir la actividad enzimática como se describe en la sección 5. Run 3/4 técnicos repeticiones de cada muestra de plasma.
9. Euthanasila
   Nota: La ventaja de la tecnología SERCaMP es la capacidad de calcio longitudinalmente monitor de ER. En función de los parámetros experimentales y análisis de punto final, los animales son que ser sacrificados por las medidas apropiadas para punto final de análisis y de conformidad con las directrices institucionales ACUC.

5. La luminiscencia Ensayo

1. Preparar soluciones de coelenterazina (CTZ) de valores mediante la dilución del compuesto en metanol acidificado (30 l de HCl 10 N a 3 ml de metanol) a 20 mM. Preparar alícuotas de un solo uso y se almacena a -80 ° C.
2. Preparar el sustrato a trabajar en el día de ensayo.
   1. Para los ensayos in vitro, diluir coelenterazina a 8 mM en PBS, por ejemplo, añadir 10 l de 20 mM CTZ acciones a 25 ml de PBS (Figura 6A, B).
   2. Para los ensayos in vivo, diluir coelenterazina a 100 mM en PBS, ácido ascórbico 500 mM, NaCl 5 mM.
3. Incubar preparado CTZ durante al menos 30 mina temperatura ambiente antes de comenzar el ensayo.
   Nota: Este paso se incluye a menudo en los ensayos de luciferasa Gaussia ya que hay informes de la decadencia sustrato rápida durante primeros 30 minutos después de preparar. No hemos observado este efecto en nuestro sistema (Figura 6C); Sin embargo, a menudo incluyen la etapa de incubación como hemos encontrado ningún impacto negativo en el ensayo.
4. Utilice un lector de placas que es capaz de monitorizar la bioluminiscencia y equipado con un inyector de sustrato. Prime las líneas con sustrato.
   Nota: El soporte inicial a través de las líneas puede ser propenso a la degradación. Para evitar lecturas artificialmente bajos para los primeros muestras, inyectar 20-30 pozos vacíos (que cargan un plato vacío en el lector) antes de medir las muestras experimentales.
5. Inyectar 100 l de sustrato en el pozo, agitar velocidad media durante 5 segundos, y medir la emisión de luz. Para el lector de placas Biotek Sinergia II, integrar la emisión de luz durante 0,5 seg (muestras in vitro) y 5 segundos (envivo muestras) para el paso de lectura. Optimizar parámetros lector de placas para el rendimiento del ensayo ideal.
   Nota: exposiciones Gaussia luciferasa cinética de flash con la decadencia de la señal rápida (en comparación a brillar cinéticas observadas con otras luciferasas). La cinética de flash de gluc está influenciada por el suero en medio de cultivo celular (Figura 7A), destacando la importancia de controlar para la composición del medio a través de muestras. Debido al rápido decaimiento de la luminiscencia después de añadir sustrato (cinética de flash), el tiempo entre la inyección y leer los pasos deben ser uniformes para todas las muestras. El lector de placas se debe establecer para inyectar sustrato a un pozo, esperar un tiempo fijo (por ejemplo, usamos un paso batido de 5 seg), y leer bien. La adición de sustrato a una placa entera antes de la lectura plantea un reto significativo a menos sustrato puede ser añadido a todos los pocillos al mismo tiempo. Si un inyector no está disponible, el problema puede ser parcialmente eludirse mediante la incubación de la placa durante 10 min entre ADDI sustratoción y medición (evitando así la parte empinada de la curva de caída) (Figura 7B).
6. Repetir la inyección, tiempo de espera, y leer los pasos para cada pozo de la placa.

Resultados

El método Gluc-SERCaMP permite la evaluación de la homeostasis del calcio ER mediante el muestreo de fluidos extracelulares. Varios controles pueden ser incluidas en el diseño experimental para mejorar la interpretación de los resultados. En primer lugar, el uso de un reportero constitutivamente secretada (por ejemplo, gluc sin la ASARTDL C-terminal o "Gluc-No Tag") se puede emplear para evaluar los efectos de los tratamientos experimentales en la vía secretora (secreción celular global) y la ex...

Discusión

Este protocolo pone de relieve la in vitro e in vivo de utilidad Gluc-SERCaMP para supervisar el agotamiento de calcio ER. Aunque la modificación de proteínas para generar SERCaMP parece generalizarse a otras proteínas reportero ^12, elegimos Gaussia luciferasa por su robusta (200-1.000 mayor veces) bioluminiscencia en comparación con otras luciferasas ^18. Demostramos detectable inducida thapsigargin de liberación Gluc-SERCaMP a través de un rango de dosis de 100 veces de vir...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml tubes	Fisher	02-682-550
10% NP-40 solution	Pierce	28324	for intracellular GLuc assays
1 ml luer-lok syringes	Fisher	14-823-30
200 microliter filter tips	Rainin	RT-L200F
3-0 surgical sutures	Fisher	NC9598192
30 G needles	Fisher Scientific	14-821-13A
Adhesive microplate sealing sheets	Thermo	AB-0558
Alcohol prep pads	Fisher	22-246-073
Anesthesia Auto Flow System	E-Z Anesthesia	EZ-AF9000
Animal recovery chamber	Lyon Vet	ICU-912-004
B27 supplement	Life Technologies	17504-044
Betadine solution	Fisher	NC9386574
Bleach	Clorox	n/a
Bovine growth serum	Thermo	SH30541.03
Coelenterazine, Native	Regis Technologies	1-361204-200
Cotton tipped applicators	Puritan	806-WC
Cutting needles 3/8 circle sutures	WPI	501803
Digital ultrasconic cleaner	Fisher Scientific	FS60D
DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvate	Life Technologies	10569-010
DNA mass ladder	Life Technologies	10496-016
Gaussia luciferase (recombinant protein)	Nanolight	321-100
Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC)	New England Biolabs	E8023S	1:2,000 (WB)
Germinator 500	CellPoint Scientific	DS-401
Gluc assay plates (96 well, opaque)	Fisher	07-200-589
Hank's balanced salt solution	Life Technologies	14175-095
Heparin	Allmedtech	63323-276-02
Isoflurane	Butler Schein	29404
Ketamine	Henry Schein	995-2949
Kwik Stop Styptic powder	Butler Schein	5867
L-glutamine	Sigma	G8540
Methanol	Fisher	a452-4
Microfuge 22R Centrifuge	Bekman Colter	368831
Neosporin	Fisher	19-898-143
Neurobasal medium	Life Technologies	21103049
Nikon Stereoscope	Nikon	SMZ745T
Nucleospin Gel and PCR Cleanup	Machery-Nagel	740609
P200 pipet	Rainin	L-200XLS+
p24 Lenti-X rapid titer kit	Clontech	632200
PCR film seal	Fisher	AB0558
Penicillin/streptomycin	Life Technologies	15140-122
Protease inhibitor cocktail	Sigma	P8340
ReFresh Charcoal Filter canister	E-Z Anesthesia	EZ-258
Scalpel blades, #10	Fine Science tools Inc	10010-00
SD rats 150-200 g	Charles River	Rats	rats ordered at 150-200 g.  Surgery 5 days after arrival
Small animal ear tags	National Band and Tag co	1005-1
Sterile surgical drapes	Braintree Scientific	SP-MPS
Synergy 2 plate reader	BioTek	n/a
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems	4304437
Thapsigargin	Sigma	T9033	harmful to human health
Virapower lentiviral packaging mix	Life Technologies	K4975-00
Xfect Transfection reagent	Clontech	631318
Xylazine	Valley Vet	468RX