JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Abstract

Reticulum endoplasmic (ER) מכיל את הרמה הגבוהה ביותר של סידן תוך תאי, עם ריכוזים כ -5,000 פי יותר מרמות cytoplasmic. פיקוח הדוק על סידן ER הכרחי לקיפול חלבונים, שינוי וסחר. הפרעות לסידן ER יכולות לגרום להפעלה של תגובת החלבון מקופלת, מנגנון תגובת לחץ ER שלוש שיניים, ותורמות לפתוגנזה במגוון רחב של מחלות. היכולת לעקוב אחר שינויי סידן ER במהלך התפרצות מחלה והתקדמות חשובה בעיקרון, אך מאתגרת בפועל. שיטות זמינות כעת עבור סידן ER הניטור, כגון צבעי ניאון סידן תלוי וחלבונים, סיפקו תובנה דינמיקת סידן ER בתאים, אולם הכלים אלה אינם מתאימים ללימודים בvivo. המעבדה שלנו הוכיחה ששינוי לcarboxy-הסופית של לוציפראז Gaussia מקנה הפרשת הכתב בתגובה לדלדול סידן ER. השיטות לשימוש בלוציפראז מבוסס, חלבון ניטור סידן מופרש ER (SERCaMP) במבחנה וביישומי vivo מתוארות במסמך זה. וידאו זה מדגיש זריקות כבד, מניפולציה תרופתית של GLuc-SERCaMP, איסוף דם ועיבוד, ופרמטרי assay לניטור אורך של סידן ER.

Introduction

Reticulum endoplasmic (ER) פונקציות רבות יכולות סלולריות כוללים קיפול חלבונים, הפרשת חלבון, שומנים הומאוסטזיס, ואיתות תאית 1. מרכז לתפקוד נורמלי ER הוא שמירת ריכוזי סידן luminal ב ~ 5000 פעמים אלה שנמצאו בציטופלסמה 2-4. תהליך עתיר אנרגיה זה מוסדר על ידי ATPase סידן Sarco / reticulum endoplasmic (SERCA), משאבה שזז יוני סידן לחדר המיון. זרימה של סידן מחדר המיון מתווכת בעיקר על ידי ryanodine (RyR) וקולטני אדנוזין אינוזיטול (IP3R). בגלל תהליכי מיון רבים תלויים בסידן, לשבש את החנות יכולה להוביל ללחץ ER ומוות של תאי סופו של דבר.

ER חוסר ויסות הסידן נצפה במחלות כולל קרדיומיופתיה, סוכרת, אלצהיימר, פרקינסון ושל 5. בשל הפרוגרסיביות של מחלות אלו, זה כבר מאתגר להתוות סיבה והתוצאה מחדשlationship בין פתוגנזה ושינויים בחנות סידן ER. מספר הטכנולוגיות איפשר להתקדמות משמעותית בהבנה של דינמיקת סידן ER, כוללים צבעים ואינדיקטורים מקודדים גנטיים סידן (GECIs) שלנו. צבעים נמוכים זיקת סידן, המגדילים בקרינה כאשר חייב Ca 2 +, ניתן לטעון לתאים לבחון תאי subcellular עם ריכוזים גבוהים של סידן 6. GECIs, כגון D1ER ותופס לאפשר ניטור של תנודות סידן עם שליטה מדויקת יותר של לוקליזציה subcellular 7-9. לאחרונה, סוג אחר של GECIs נקראים אינדיקטורים למדידת סידן בפח אברון חלבון (CEPIA) תוארו 10. גישה שלישית המשלבת גנטיקה וכימיה מולקולה קטנה הוא טעינת צבע הממוקד-אסטראז (TED), אשר מנצל carboxylesterase מקודדים גנטי (ממוקד לחדר המיון) עם צבע סידן מבוסס אסתר 11.

בעוד המגייסיש גישות ementioned נקודות חוזק וחולשה טבועים, הם יכולים לספק תובנה חשובה דינמיקת סידן ER באמצעות מדידות של הקרינה אקוטיות. הם, לעומת זאת, לא אופטימליים למחקרים ארוכי טווח לעתים קרובות נדרשו לחקור את התקדמות מחלה. במטרה להמציא שיטה לעקוב אחר דינמיקת סידן על פני תקופות זמן ארוכות, זיהינו ופיתחנו שינוי חלבון ליצירת חלבוני סידן מופרש ER ניטור (SERCaMPs) 12.

SERCaMP עוקף כמה מגבלות הקשורות לשיטות אחרות, על ידי מתן גישה פולשנית לחקור חנות סידן ER שוב ושוב. אנחנו הוכחנו בעבר כי ASARTDL carboxy מסוף פפטיד (אלאנין-סרין-אלאנין-ארגינין-תראונין-אספרטית חומצה-לאוצין) מספיק כדי לקדם את שימור ER; עם זאת, בתנאים שגורמים לירידות בסידן ER, רצף הפפטיד הוא כבר לא מסוגל לשמור על localizatio ERn והחלבון מופרש 13. בסיס טכנולוגית SERCaMP הוא התוספת של ASARTDL לcarboxy-הסופית של חלבון מופרש (לוציפראז למשל Gaussia, או GLuc) כך שההפרשה מופעלת על ידי דלדול סידן ER, ובכך ליצור כתב חזק של חוסר ויסות הסידן ER 12. הביטוי של GLuc-SERCaMP באמצעות שיטות מהונדסים מאפשר נוזלים ביולוגיים כוללים תרבית תאים בינוני ופלזמה להיות מנותח לשינויים בפעילות GLuc כאינדיקטור של הומאוסטזיס סידן ER. יש שיטת בקשות למחקר האורך של שינויים הדרגתיים בחנות סידן ER הן במבחנה in vivo. הפרוטוקול הבא נכתב כמתווה כללית לשימוש SERCaMP מבוסס GLuc ללמוד הומאוסטזיס סידן ER, אבל הפרוטוקול יכול לשמש כמדריך לSERCaMPs כתב חלופי.

Protocol

1. במבחנה Assay: זיהוי שחרור SERCaMP משורת תאי SH-SY5Y יציב

  1. טופל SH-SY5Y-GLuc-ASARTDL צלחת (SERCaMP) בתרבית רקמת צלחות ב150,000 תאים לכל 2 סנטימטר של שטח פנים. 96 צלחות גם, למשל, זרע 50,000 תאים לכל היטב (איור 1 א). לגדל תאי SH-SY5Y בDMEM סרום + 1x פניצילין / סטרפטומיצין (הגבוה של גלוקוז, Glutamax, פירובט) + צמיחת שור 10%.
    1. תאי מעבר עד 15 פעמים (איור 1). מספר מעבר גבוה לא נבדק.
    2. חזרו תאים לחממת humidified על 37 מעלות צלזיוס עם 5.5% CO 2 ו דגירה הלילה.
  2. לפני טיפול ניסויי (ים), לאסוף דגימת בסיס לכל אחד גם על ידי העברת 5 μl של supernatant התרבות לאטום מוקף חומת 96 צלחת גם. לפני איסוף, לטפוח בעדינות את הצלחת על כל הצדדים ומערבולת כדי למנוע תופעות שיפוע. חותם את הצלחת האטומה עם דבק שלגיליון אילינג ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד הזמן של assay האנזימטית.
    הערה: המופרש GLuc-SERCaMP הוא יציב מאוד במדיום תרבית תאים. אנו דווחו בעבר כ 5-10% מפעילות GLuc אבדו לאחר דגירה 72 שעות ב 37 ° C (מודגרות על תאי SH-SY5Y) 12.
  3. פנק את התאים כרצויים לבחון דלדול סידן ER (למשל סביבתי, תרופתי, מניפולציות גנטיות). יש להימנע מחשיפה ארוכה לסביבת סביבה (מחוץ לחממה מבוקרת) כשינויי pH יהיה במהירות להתרחש בCO 2 באטמוספרה. להוסיף HEPES עד בינוני התרבות ב 20 מ"מ, כדי לייצב pH 14, אם מניפולציות ממושכות נדרשות. הימנע מחשיפה לאור בעת שימוש HEPES במדיום תרבות 15.
    1. בקרה חיובית: פנק את תאים עם 100 ננומטר thapsigargin (TG) או חומצת cyclopiazonic 50 מיקרומטר (רו"ח) במשך 4-6 שעות לניסויים בתאי SH-SY5Y. תגובה מקסימלי בשורות תאים אחרות עשויה לדרוש incubations יותר או concen שונהtrations של תרכובות.
    2. שליטה שלילית: בינוני תרבות אסוף מתאי SH-SY5Y הורים. מניסיוננו, הארה הרקע לassay זה היא פחות מ 0.05% מהפרשה בסיסית מתאי SH-SY5Y-GLuc-SERCaMP יציבים.
  4. לאסוף דגימות חנות 5 μl של תקשורת מותנה בנקודתי הזמן הרצויים, כפי שמתוארים בשלב 1.2.
  5. להעריך את הפעילות האנזימטית במדיום כפי שתואר בסעיף 5.
  6. בדוק GLuc תאית על ידי immunoblot או assay הארה.
    1. לimmunoblot: תאי lyse במאגר Ripa שונה המכיל 50 מ"מ טריס (pH 7.4), 150 מ"מ NaCl, 0.25% deoxycholate נתרן, 1 mM EDTA, 1% NP40, ומעכבי פרוטאז. נפרד על ג'ל SDS-polyacrylamide והעברה לממברנה 0.20 מיקרומטר PVDF. דגירה הממברנה עם נוגדן GLuc (1: 2,000 דילול) הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. לבצע שטיפות דגירה נוגדן וקרום המשניות לפי פרוטוקול מוגדר על ידי משתמש למגיב זיהוי של בחירה.
    2. לassay הארה (איור 2): בצע את השלבים על הקרח הבא:
      1. הסר את כל המדיום מבארות של צלחת תרבית הרקמה ולשטוף עם 200 μl של PBS הקר.
      2. להוסיף 75 μl של חיץ תמוגה המכיל 50 מ"מ טריס (pH 7.5), 150 מ"מ NaCl, 1% NP40 ומעכבי פרוטאז היטב כל אחד.
      3. סובב את הצלחת על שייקר מסלולית (120 סל"ד) בשעת 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
      4. בעדינות פיפטה lysate למעלה ולמטה באמצעות pipettor רבי ערוצים, הימנעות בועות אוויר. העבר 5 μl של lysate לצלחת אטומה ולהעריך הארה כפי שתואר בסעיף 5.

2. במבחנה Assay: Transfection חולף של תאים הונצחו עם SERCaMP

הערה: יש לנו ציינו כי נהלי transfection חולפים יכולים לגרום ללחץ סלולארי ולהקהות את תגובת GLuc-SERCaMP שלאחר מכן. הגישה הבאה פותחה כדי למזער EFF transfection רישומם בתאי SH-SY5Y. אופטימיזציה של הליך זה (כולל בחירה של מגיב transfection) לשורות תאים חלופיות עשויה להידרש. במידת האפשר, מומלץ שימוש בקווים יציבים תא או שיטות התמרה ויראלית המפורטים בסעיפי 1 ו -3 בהתאמה.

  1. תאי SH-SY5Y צלחת בצלחת 100 מ"מ ב 4 x 10 6 תאים. מנה זו תהיה מספיק כדי מחדש זרע כ -300 בארות (96 פורמט צלחת היטב) בעקבות הליך transfection.
  2. תאי Transfect עם מגיב Xfect באמצעות 20 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד (קידוד GLuc-SERCaMP) ו -6 μl של מגיב Xfect. ה- DNA בקנה מידה ומגיב בהתאם לXfect כלי תרבות גדולים יותר או קטנים יותר.
  3. חזור תאי חממה במשך 48 שעות.
  4. Trypsinize תאים ולזרוע 96 צלחות גם ב60,000 תאים לכל טוב. בצע את הפעולות הבאות תוארו בסעיף 1.

3. במבחנה Assay: ביטוי בתיווך וקטור ויראלי של GLuc-SERCaMP

אוהל "> הערה: נגיפי הקשורים Adeno (AAV) אריזת וקטור 16 וטיהור 12 וlentivirus ייצור 13 כבר דווח בעבר.

  1. כייל GLuc-SERCaMP AAV באמצעות פריימרים ובדיקות הבאים: פריימר קדימה, 5'-CACGCCCAAGATGAAGAAGT-3 '; פריימר ההפוך, 5'-GAACCCAGGAATCTCAGGAATG-3 '; בדיקה (5'-6-FAM / 3'-BHQ-1 שכותרת), 5'-TACGAAGGCGACAAAGAGTCCGC-3 'לPCR כמותי.
    1. הכן את עקומת הסטנדרט ידי linearizing פלסמיד המכיל GLuc ומטהר את ה- DNA באמצעות ספין-טור (למשל ניקוי Machery-נגל NucleoSpin ג'ל וPCR). לכמת את ה- DNA על ידי הפרדה על agarose ג'ל לצד סולם המוני. הכן דילולים 1:10 של DNA בין 100 pg / ml 10 / מיליליטר FG בPBS. חשב את / עותקי מיליליטר של פלסמיד דנ"א GLuc בכל אחד מהריכוזים המבוססים על המשקל המולקולרי של פלסמיד.
    2. לדלל את מניות AAV בPBS (הדילול המתאים יהיה תלוי בפרמטרים של הכנה נגיפית ולקבוע באופן אמפירי).
    3. הפעל את תגובת PCR במערכת ה- PCR בזמן אמת באמצעות התנאים הבאים: 95 ° C × 5 דקות, 94 ° C × 20 שניות, ודקות × 1 60 מעלות צלזיוס במשך 41 מחזורים. חישוב עותקים / מ"ל ​​באמצעות העקומה סטנדרטית.
  2. lentivirus כייל עם ערכת כייל המהיר p24 Lenti-X. להפשיר aliquots lentiviral על קרח ולדלל את חלבון p24 שליטה במדיום SH-SY5Y.
    1. לדלל את lentivirus כך שהיא תיפול על העקומה סטנדרטית (למשל 1: 20,000 או 1: 100,000). הגורם לדילול הנדרש ישתנה בהתאם לפרמטרים הכנת lentiviral וצריך להיקבע באופן אמפירי. עקוב אחר ההוראות של היצרן עבור כל השלבים הבאים.
  3. תאי פלייט 96 צלחות גם. לתאי SH-SY5Y, ניתן בעקבות הליכי ציפוי המפורטים בסעיף 1. לנוירונים בקליפת המוח עיקריים חולדה, צריכים להיות מבודדים תאי זרע ועל צלחות מצופים כראויים שתואר קודם לכן 16. לשמור נוירונים בקליפת המוח עיקריים עכברוש במדיום Neurobasal בתוספת 1x B27 ו- L-גלוטמין 500 מיקרומטר. לבצע חילופים בינוניים חצי בכל יום אחר.
  4. Transduce התאים בנגיף. המטרה של התמרה ויראלית היא להשיג ביטוי ברמה נמוך, כמו בלוציפראז Gaussia מספק אות חזקה.
    1. תאי SH-SY5Y התמרה AAV: transduce למחרת ציפוי. לדלל AAV 6.0 x 10 7 VG / μl במאגר דילול AAV (PBS + 0.5mm MgCl 2). הוסף 5 μl של AAV המדולל (3.0 x 10 8 VG; משרד הפנים בסך של כ -6,000) בכל טוב של 96 צלחת היטב (איור 3 א). להשתמש באקונומיקת 10% כדי להשבית פסולת וקטור נגיפית.
    2. AAV התמרה של תאי עצב בקליפת המוח עיקרי עכברוש: ​​transduce 6-8 ימים לאחר ציפוי. לדלל AAV 4.0 x 10 6 VG / μl במאגר דילול AAV. הוסף 5 μl של AAV המדולל (2.0 x 10 7 VG; משרד הפנים בסך של כ 350) לכל גם96 צלחת היטב (איור 3). משרד הפנים האופטימלי צריכים להיקבע באופן אמפירי לסוגי תאים אחרים. להשתמש באקונומיקת 10% כדי להשבית פסולת וקטור נגיפית.
    3. התמרה lentiviral של תאי SH-SY5Y: transduce למחרת ציפוי. לדלל lentivirus 20 pg / p24 μl (ריכוז נקבע באמצעות ערכת Titering) בתמיסת מלח המאוזן של האנק. להוסיף 5μl של הנגיף המדולל לטוב (של p24 100 עמ ', שווה ערך ל 1,250,000 חלקיקי lentiviral, או ~ 1,250 IFUs) של צלחת גם 96 המכילה 100 נפח μl. בקנה מידה גדול יותר בהתאם לפורמטים. להשתמש באקונומיקת 10% כדי להשבית פסולת ויראלי.
  5. לאסוף דגימת טיפול מראש של מדיום ולהתחיל טיפולים ניסיוניים 48 שעות (SH-SY5Y) או 5-7 ימים (נוירונים בקליפת המוח עיקריים עכברוש) לאחר התמרה.

4. בVivo SERCaMP Assay

הערה: לפני ביצוע כל הליכי בעלי חיים כדי להיות בטוחים לקבל את האישור מתאים באמצעות המוסד שלך. כלניתוחי הישרדות הם להיעשות בתנאים סטריליים בהרדמה נאותה. כל ההליכים המתוארים להלן אושרו ועומדים בהנחיות NIH ACUC.

  1. מכשירי ניתוח החיטוי לפני תחילת הניתוח (121 מעלות צלזיוס, 30 דקות עיקור, זמן יבש 20 דקות). נקה את כל המכשירים בultrasonicator הבאים מייד את כל הנהלים ולפני מעוקר. לשמור על תנאים סטריליים במהלך ניתוח הישרדות. לניתוחים הדורשים בעלי חיים רבים, לנגב מכשירי ניתוח עם אלכוהול 70%, ultrasonicate וחרוז לעקר בין חולדות. עיין בחומרי רשימת מכשירים דרושים.
  2. הכן חולדה לניתוח. כאן אנו משתמשים זכר Sprague-Dawley (180-200 גרם).
    1. להרדים חולדות באמצעות isoflurane גז במשך 3 דקות (4-5% Isoflurane נשאו ב1,000 סמ"ק / דקה) ואחרי זריקות intraperitoneal של xylazine (8 מ"ג / קילוגרם) וקטמין (80 מ"ג / קילוגרם). החל משחת עיניים כדי להגן על קרניות מהתייבשות. Bניתוח egin פעם העכברוש הוא עמוק בהרדמה כפי שהודגם על ידי חוסר רפלקס הנסיגה הבא זנב או קמצוץ רגל.
    2. לגלח את האזור של בטן מעט מתחת לצלעות (אזור בית חזה נמוך) לאזור הבטן באמצע. לשפשף את אזור ניתוח שלוש פעמים, לסירוגין אלכוהול 70% ולשפשף פולידין. מניחים חולדה במצב שכיבה באזור ניתוח סטרילי עם וילונות כירורגי סטרילי.
  3. לדלל AAV-GLuc-SERCaMP 7.6 x 10 9 מיליליטר VG / (ריכוז סופי). מערבבים היטב על ידי צינור היפוך.
    הערה: טווח של ריכוז נגיפי יכול להשתנות (איור 4).
    1. Pipet 105 μl של AAV המדולל לתוך צלחת סטרילית. שימוש במחט 30-מד לאסוף את הווירוס לתוך מזרק.
  4. לבצע ניתוח כדי לחשוף את הכבד ולהזריק AAV-GLuc-SERCaMP.
    1. לפני ביצוע חתך בבטן, תחול bupivacaine 0.25% לאזור החתך. באמצעות אזמל, לעשות חתך אופקי מתחת לצלעות (AP2-3 סנטימטר בסמיכות). בוטה לנתח להפריד רקמת חיבור מבהיפודרמיס.
    2. חותך שרירים בטן, לחשוף את האונה הימנית של כבד המדיאלי.
      הערה: אונות נוספות ניתן להזריק מבוססות על יישום הסוף.
    3. הנח חיה תחת מיקרוסקופ הניתוחי ולהתאים כדי לקבל אונה המדיאלי תקין של כבד בשדה הראייה. הזרק וירוס לתוך parenchyma של האונה המדיאלי; 3 אתרים נפרדים, כ 33 μl לכל אתר.
      הערה: השאר את מחט ברקמה למשך 5-10 שניות לאחר הזרקה כדי להבטיח אספקה ​​של כל נפח ההזרקה.
    4. לתפור את השרירים ועור בטן בנפרד ולהוסיף כוהל באמצעות מוליך כותנה שקצה. מניחים חולדה בחדר התאוששות עד התודעה הוא חזר ועכברוש הוא מסוגל לשמור על תנוחה זקופה. אל תשאיר חולדה (ים) ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספיק כדי לשמור על כיבה sternal. הבית לבד עד החתך הגליד ותפרים הוסרו (7-14 ימים).
      הערה: לפי הנחיות לאחר ניתוח NIH, לשמור על שיא כירורגית. תסמן כרטיס כלוב עם הליך, תאריך, מזהה ניסוי, משקל גוף, ויום של ניתוח. כאב / מצוקה, ייצור צואה, פעילות, ומזון וצריכת מים הם להיות במעקב והניתוח נרשם 3 ימים שלאחר. שיכוך כאבים שלאחר ניתוח מסופק על ידי הוספת פרצטמול למי השתייה (450 מ"ג / 100 סמ"ק) למרות שאנחנו לא בדרך כלל לצפות סימנים של כאב או מצוקה לאחר ניתוח.
  5. בגין איסוף דם זנב 4-7 ימים לאחר ההזרקה. הכן צינורות איסוף דם על ידי תיוג ומראש משקלות. הוסף 50 הפרין μl (1000 U / ml) על צינור אחד.
  6. עכברוש מקום בתא ההרדמה isoflurane 3 דקות (4-5% Isoflurane נשאו ב1,000 סמ"ק / min). הסר עכברוש מהתא והמקום בחרטום (2-3% Isoflurane נמסר על 500 סמ"ק / min). איסוף דם יכול להתחיל ברגע שהחולדה בהרדמה עמוקה כפי שהודגם על ידי חוסר רפלקס הנסיגה הבאה pi הזנבNCH.
    1. בעזרת המספריים סטרילי קצה לחתוך זנב (מ"מ 1-2) ולאסוף דם ירידה מבחינת לתוך צינור הפרין טרום מלא. איסוף דם עד נפח מגיע יותר מ 2: 1 דם ליחס הפרין (> 100 הפרין μl μl דם / 50). יכולים להיות מותאמים כרכי איסוף דם המבוסס על עיצוב ניסיוני. השתמש במוליך כותנה רטוב להחיל אבקת עצירות לזנב כדי לעצור את הדימום.
    2. צינורות דם חנות ב 4 מעלות צלזיוס אם איסוף דגימות שלאחר מכן. נגב מספריים עם כרית אתנול וחרוז לעקר בין אוספים.
    3. לשקול צינורות איסוף ולהתאים עם הפרין להשיג 2: 1 יחס (דם: הפרין). צעד זה לנרמל את הסכום של הפרין בכל דגימה (טבלה 1).
    4. צינורות צנטריפוגה XG ב 2000 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. מעבירים את supernatant (פלזמה) לצינור וחנות טרי ב -80 ° C עד הזמן של assay בלוציפראז (סעיף 5).
      הערה: אחסון של דגימות ב 4 מעלות צלזיוס עד 72 שעות לפני assay האנזימטית יש מ 'השפעת inimal על הארה (איור 5 א). יש עד 3 מחזורים להקפיא להפשיר דגימות פלזמה אין כל השפעה על הארה (איור 5).
  7. ממשל thapsigargin (ביקורת חיובית):
    1. הכן thapsigargin על ידי דילול באתנול לריכוז סופי של 2.5 מ"ג / מיליליטר. הזרק thapsigargin ב1 מ"ג / קילוגרם IP לתוך הבטן התחתונה.
      הערה: thapsigargin מגביר קרישת טסיות מושרה תרומבין 17 והוא יכול לעשות אוסף דם מזנב קשה יותר.
  8. assay בלוציפראז Gaussia:
    1. להפשיר דגימות פלזמה על קרח.
      הערה: מחקרים ארוכי טווח, הפשרה ולבצע assay הארה לכל דגימות נקודת הזמן באותו היום (שימוש בתכשיר יחיד של מצע).
    2. העברת 10 μl של פלזמה לצלחת מוקפת חומה אטומה ולמדוד את הפעילות האנזימטית כפי שתואר בסעיף משכפל טכני 5. הפעלה 3-4 של כל דגימת פלזמה.
  9. Euthanasi
    הערה: היתרון של טכנולוגית SERCaMP הוא היכולת longitudinally סידן ER הצג. בהתאם לפרמטרים ונקודתי קצה ניתוחים ניסיוניים, בעלי חיים הם להיות מורדמים באמצעים מתאימים לנקודת סיום ניתוח ובהתאם להנחיות ACUC מוסדיות.

5. הארה Assay

  1. הכן את פתרונות coelenterazine מניות (CTZ) על ידי דילול המתחם במתנול acidified (30 μl 10 N HCl עד 3 מיליליטר של מתנול) עד ​​20 מ"מ. הכן aliquots ליחד ולאחסן ב -80 ° C.
  2. הכן את מצע העבודה ביום של assay.
    1. למבחנים במבחנה, לדלל coelenterazine 8 מיקרומטר ב PBS, למשל להוסיף 10 μl של 20 מ"מ מניית CTZ 25 מיליליטר של PBS (איור 6 א ', ב').
    2. עבור מבחני in vivo, לדלל coelenterazine בPBS 100 מיקרומטר, 500 חומצה אסקורבית מ"מ, 5 מ"מ NaCl.
  3. דגירה CTZ מוכן לפחות 30 דק 'בטמפרטורת חדר לפני תחילת assay.
    הערה: שלב זה הוא לעתים קרובות כלול במבחני בלוציפראז Gaussia כמו שיש דיווחים על דעיכת מצע מהירה במהלך 30 דקות הראשונות לאחר ההכנה. אנחנו לא נצפו השפעה זו במערכת שלנו (איור 6 ג); עם זאת, לעתים קרובות אנו כוללים את שלב הדגירה שכן מצאנו שום השפעה שלילית על assay.
  4. השתמש בקורא צלחת כי הוא מסוגל פליטת אור ניטור ומצויד בהזרקת מצע. ראש הקווים עם מצע.
    הערה: המצע הראשוני דרך הקווים יכול להיות מועדים לשפלה. כדי להימנע מקריאות נמוכות באופן מלאכותי לדגימות מוקדמות, להזריק 20-30 בארות ריקות (טעינת צלחת ריקה על הקורא) לפני מדידת דגימות ניסוי.
  5. הזרק של מצע 100 μl לטוב, לנער מהירות בינונית במשך 5 שניות, ולמדוד פליטת אור. לקורא צלחת Biotek Synergy השני, לשלב פליטת אור על 0.5 שניות (במבחנה דגימות) ו -5 שניות (בvivo דגימות) לצעד הקריאה. לייעל פרמטרים צלחת קורא לביצועי assay אידיאליים.
    הערה: תערוכות לוציפראז Gaussia קינטיקה הבזק עם דעיכת אות מהירה (בהשוואה לזוהר קינטיקה נצפתה עם luciferases אחר). קינטיקה של הבזק GLuc מושפעת בסרום בתרבית תאים בינוני (איור 7 א), המדגישה את החשיבות של שליטה על הרכב בינוני על פני דגימות. בשל הריקבון המהיר של הארה לאחר הוספת מצע (קינטיקה פלאש), את הזמן בין להזריק ולקרוא צעדים חייבים להיות אחיד לכל הדגימות. קורא הצלחת צריך להיות מוגדר להזריק מצע לטוב, לחכות זמן קבוע (לדוגמא, אנו משתמשים בצעד שייק 5 שניות), וקראנו שכן. הוספת מצע לכל צלחת לפני הקריאה מציבה אתגר משמעותי, אלא אם כן מצע ניתן להוסיף לכל הבארות בו זמנית. אם מזרק אינו זמין, ניתן לעקוף הבעיה באופן חלקי על ידי דוגרים הצלחת במשך 10 דקות בין addi המצעtion ומדידה (וכך למנוע את החלק התלול של עקומת הדעיכה) (איור 7).
  6. חזור על ההזרקה, לחכות זמן, ולקרוא לכל צעדים גם על הצלחת.

תוצאות

שיטת GLuc-SERCaMP מאפשרת הערכה של הומאוסטזיס סידן ER על ידי דגימת נוזלים תאיים. ניתן לכלול מספר פקדים בעיצוב ניסיוני כדי לשפר את הפרשנות של תוצאות. ראשית, שימוש בכתב constitutively מופרש (למשל GLuc ללא ASARTDL C-המסוף או "GLuc-אין תג") יכול להיות מועסק על מנת להעריך את ההשפעות של טי...

Discussion

פרוטוקול זה מדגיש במבחנה ובשירות vivo של GLuc-SERCaMP לפקח דלדול סידן ER. למרות שינוי החלבון כדי ליצור SERCaMP מופיע להכליל לחלבוני כתב אחרים 12, בחרנו בלוציפראז Gaussia לפליטת האור שלו חזק (200-1,000 הגדול יותר פי) בהשוואה לluciferases האחר 18. אנו מדגימים שחרור GLuc-SERCaMP זיה?...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Intramural Research Program at the National Institute on Drug Abuse. We thank Doug Howard, Chris Richie, Lowella Fortuno, and Josh Hinkle for their contributions to developing this method.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 ml tubesFisher 02-682-550
10% NP-40 solution Pierce28324for intracellular GLuc assays
1 ml luer-lok syringesFisher14-823-30
200 microliter filter tipsRaininRT-L200F
3-0 surgical suturesFisherNC9598192
30 G needlesFisher Scientific14-821-13A 
Adhesive microplate sealing sheetsThermoAB-0558
Alcohol prep padsFisher22-246-073
Anesthesia Auto Flow SystemE-Z AnesthesiaEZ-AF9000
Animal recovery chamberLyon VetICU-912-004
B27 supplementLife Technologies17504-044
Betadine solutionFisherNC9386574
BleachCloroxn/a
Bovine growth serumThermoSH30541.03
Coelenterazine, NativeRegis Technologies1-361204-200
Cotton tipped applicatorsPuritan806-WC
Cutting needles 3/8 circle suturesWPI501803
Digital ultrasconic cleanerFisher ScientificFS60D
DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvateLife Technologies10569-010
DNA mass ladderLife Technologies10496-016
Gaussia luciferase (recombinant protein)Nanolight321-100
Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC)New England BiolabsE8023S1:2,000 (WB)
Germinator 500CellPoint ScientificDS-401
Gluc assay plates (96 well, opaque)Fisher07-200-589
Hank's balanced salt solutionLife Technologies14175-095
HeparinAllmedtech63323-276-02
IsofluraneButler Schein29404
KetamineHenry Schein995-2949
Kwik Stop Styptic powderButler Schein5867
L-glutamineSigmaG8540
MethanolFishera452-4
Microfuge 22R CentrifugeBekman Colter368831
NeosporinFisher19-898-143
Neurobasal mediumLife Technologies21103049
Nikon StereoscopeNikonSMZ745T
Nucleospin Gel and PCR CleanupMachery-Nagel740609
P200 pipetRaininL-200XLS+
p24 Lenti-X rapid titer kitClontech632200
PCR film sealFisherAB0558
Penicillin/streptomycinLife Technologies15140-122
Protease inhibitor cocktailSigmaP8340
ReFresh Charcoal Filter canisterE-Z AnesthesiaEZ-258
Scalpel blades, #10Fine Science tools Inc10010-00
SD rats 150-200 gCharles RiverRatsrats ordered at 150-200 g.  Surgery 5 days after arrival
Small animal ear tagsNational Band and Tag co1005-1
Sterile surgical drapesBraintree ScientificSP-MPS
Synergy 2 plate readerBioTekn/a
TaqMan Universal PCR Master MixApplied Biosystems4304437
ThapsigarginSigmaT9033harmful to human health
Virapower lentiviral packaging mixLife TechnologiesK4975-00
Xfect Transfection reagentClontech631318
XylazineValley Vet468RX

References

  1. Sitia, R., Braakman, I. Quality control in the endoplasmic reticulum protein factory. Nature. 426 (6968), 891-894 (2003).
  2. Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function. Cell Calcium. 38 (3-4), 303-310 (2005).
  3. Fu, S., et al. Aberrant lipid metabolism disrupts calcium homeostasis causing liver endoplasmic reticulum stress in obesity. Nature. 473 (7348), 528-531 (2011).
  4. Micaroni, M. The role of calcium in intracellular trafficking. Curr Mol Med. 10 (8), 763-773 (2010).
  5. Mekahli, D., Bultynck, G., Parys, J. B., De Smedt, H., Missiaen, L. Endoplasmic-reticulum calcium depletion and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (6), (2011).
  6. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
  7. Whitaker, M. Genetically encoded probes for measurement of intracellular calcium. Methods Cell Biol. 99, 153-182 (2010).
  8. Tang, S., et al. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (39), 16265-16270 (2011).
  9. Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (50), 17404-17409 (2004).
  10. Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nat Commun. 5, 4153 (2014).
  11. Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum. Cell Calcium. 44 (4), 386-399 (2008).
  12. Henderson, M. J., Wires, E. S., Trychta, K. A., Richie, C. T., Harvey, B. K. SERCaMP: a carboxy-terminal protein modification that enables monitoring of ER calcium homeostasis. Mol Biol Cell. 25 (18), 2828-2839 (2014).
  13. Henderson, M. J., Richie, C. T., Airavaara, M., Wang, Y., Harvey, B. K. Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) secretion and cell surface binding are modulated by KDEL receptors. J Biol Chem. 288 (6), 4209-4225 (2013).
  14. Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proc Soc Exp Biol Med. 130 (1), 305-310 (1969).
  15. Zigler, J. S., Lepe-Zuniga, J. L., Vistica, B., Gery, I. Analysis of the cytotoxic effects of light-exposed HEPES-containing culture medium. In Vitro Cell Dev Biol. 21 (5), 282-287 (1985).
  16. Howard, D. B., Powers, K., Wang, Y., Harvey, B. K. Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and glia in vitro. Virology. 372 (1), 24-34 (2008).
  17. Smeets, E. F., Heemskerk, J. W., Comfurius, P., Bevers, E. M., Zwaal, R. F. Thapsigargin amplifies the platelet procoagulant response caused by thrombin. Thromb Haemost. 70 (6), 1024-1029 (1993).
  18. Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (4), 582-591 (2009).
  19. Sobrevals, L., et al. AAV vectors transduce hepatocytes in vivo as efficiently in cirrhotic as in healthy rat livers. Gene Ther. 19 (4), 411-417 (2012).
  20. Wang, Z., et al. Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (26), 2105-2111 (2003).
  21. Seppen, J., et al. Adeno-associated virus vector serotypes mediate sustained correction of bilirubin UDP glucuronosyltransferase deficiency in rats. Mol Ther. 13 (6), 1085-1092 (2006).
  22. Hareendran, S., et al. Adeno-associated virus (AAV) vectors in gene therapy: immune challenges and strategies to circumvent them. Rev Med Virol. 23 (6), 399-413 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

103SERCaMPreticulum endoplasmicERGaussia

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved