Suivi réticulum endoplasmique homéostasie calcique l&#39;aide d&#39;un<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciférase SERCaMP

Résumé

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Résumé

Le réticulum endoplasmique (RE) contient le plus haut niveau de calcium intracellulaire, avec des concentrations d'environ 5000 fois plus élevée que les niveaux cytoplasmiques. Un contrôle serré sur ER calcium est impératif pour le repliement des protéines, la modification et la traite. Les perturbations à ER calcium peuvent conduire à l'activation de la réponse de la protéine dépliée, un mécanisme de réponse au stress du RE à trois broches, et contribuer à la pathogenèse d'une variété de maladies. La capacité de surveiller les modifications de calcium ER apparition et la progression au cours de la maladie est important en principe, mais difficile en pratique. Méthodes actuellement disponibles pour ER de surveillance de calcium, tels que les colorants et les protéines fluorescentes calcium-dépendante, ont permis de mieux comprendre la dynamique ER de calcium dans les cellules, mais ces outils ne sont pas bien adaptés pour des études in vivo. Notre laboratoire a démontré qu'une modification de l'extrémité carboxy-terminale de la luciférase de Gaussia confère sécrétion du rapporteur en réponse àER appauvrissement de calcium. Les procédés d'utilisation d'une luciférase en fonction, la protéine de surveillance de calcium du RE sécrétée (SERCaMP) pour in vitro et in vivo dans des applications sont décrits ici. Cette vidéo met injections hépatiques, la manipulation pharmacologique de GLUC-SERCaMP, la collecte et le traitement du sang, et les paramètres de dosage pour le suivi longitudinal de ER calcium.

Introduction

Le réticulum endoplasmique (RE) des fonctions dans de nombreuses capacités cellulaires, y compris le repliement des protéines, la sécrétion de protéines, l'homéostasie lipidique et de signalisation intracellulaire ^1. Central à la fonction ER normale est de maintenir les concentrations de calcium luminal à ~ 5000 fois ceux trouvés dans le cytoplasme ^2-4. Ce processus intensif d'énergie est réglementée par la ATPase Sarco / réticulum endoplasmique de calcium (SERCA), une pompe qui déplace des ions calcium dans le RE. Efflux de calcium du RE est principalement médiée par la ryanodine (RyR) et l'inositol triphosphate (IP3R) récepteurs. Parce que de nombreux processus de ER sont dépendantes du calcium, perturbant le magasin peut conduire à des stress du RE et la mort cellulaire éventuelle.

ER dysrégulation de calcium a été observée dans les maladies y compris la cardiomyopathie, le diabète, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson et ^5. En raison de la nature progressive de ces maladies, il a été difficile de délimiter la nouvelle cause à effetlation entre la pathogenèse et les modifications dans le magasin ER de calcium. Un certain nombre de technologies ont permis des avancées significatives dans notre compréhension de la dynamique ER de calcium, y compris les colorants et les indicateurs de calcium génétiquement codés (GeCIS). Des colorants à faible affinité de calcium, ce qui augmente la fluorescence lorsqu'il est lié à ^Ca2 +, peuvent être chargées dans les cellules à examiner compartiments subcellulaires avec des concentrations élevées de calcium ^6. GeCIS, comme D1ER et le receveur permettre un suivi des fluctuations de calcium avec un contrôle plus précis de la localisation subcellulaire ^7-9. Récemment, une autre classe de GECIS appelés indicateurs de protéines organelles piégée calcium de mesure (CEPIA) ont été décrits ^10. Une troisième approche combinant la génétique et la chimie des petites molécules ciblé est-estérase charge de colorant (TED), qui utilise une carboxylestérase codé génétiquement (ciblé pour l'ER) avec un colorant à base d'ester de ^calcium-11.

Bien que la aforementioned approches ont des forces et des faiblesses inhérentes, ils peuvent fournir des informations précieuses sur la dynamique de calcium ER par des mesures aigus de fluorescence. Ils sont, cependant, pas optimal pour les études longitudinales souvent nécessaires pour enquêter sur la progression de la maladie. Dans le but de mettre au point une méthode pour surveiller la dynamique de calcium sur des périodes de temps prolongées, nous avons identifié et développé une modification des protéines pour créer les protéines sécrétées de calcium ER surveillance (SERCaMPs) ^12.

SERCaMP contourne plusieurs limitations associées avec d'autres méthodes, en fournissant une approche minimalement invasive pour interroger plusieurs reprises la boutique ER de calcium. Nous avons précédemment démontré que le peptide ASARTDL carboxy-terminale (alanine-sérine-arginine-alanine-thréonine-leucine-acide aspartique) est suffisante pour favoriser la rétention au ER; cependant, dans des conditions qui causent des diminutions de calcium ER, la séquence peptidique est plus en mesure de maintenir ER localization et la protéine est sécrétée ^13. La base de la technologie de SERCaMP est l'appendice de ASARTDL à l'extrémité carboxy-terminale d'une protéine sécrétée (par exemple, la luciférase de Gaussia, ou Gluc) de telle sorte que la sécrétion est déclenchée par épuisement ER de calcium, créant ainsi un journaliste robuste de ER dysrégulation de calcium ^12. L'expression de Gluc-SERCaMP par des méthodes transgéniques permet fluides biologiques, notamment milieu de culture de cellules et le plasma à analyser les changements dans l'activité Gluc comme indicateur de l'homéostasie de calcium ER. La méthode a des applications pour l'étude longitudinale des modifications progressives dans le magasin de calcium ER la fois in vitro et in vivo. Le protocole suivant est écrit comme un cadre général pour l'aide basée SERCaMP-GLUC pour étudier ER homéostasie du calcium, mais le protocole peut servir de guide pour SERCaMPs rapporteurs alternatives.

Protocole

1. Essai in vitro: Détection SERCaMP sortie d'une écurie SH-SY5Y Cell Line

1. Plate-SH-SY5Y Gluc-ASARTDL (SERCaMP) dans une culture tissulaire traitée plaques à 150.000 cellules par cm ² de surface. Pour plaques à 96 puits, par exemple, les graines de 50.000 cellules par puits (figure 1A). Cultiver les cellules SH-SY5Y dans DMEM (glucose élevé, GlutaMAX, pyruvate) + 10% de croissance de sérum bovin + 1x pénicilline / streptomycine.
   1. Cellules jusqu'à 15 fois (figure 1B) de Passage. Numéro de passage supérieur n'a pas été testé.
   2. Retour à cellules incubateur humidifié à 37 ° C avec 5,5% de CO ₂ et incuber pendant une nuit.
2. Avant le traitement (s) expérimentale, prélever un échantillon de référence pour chaque puits en transférant 5 pi de surnageant de culture à une opaque muré plaque de 96 puits. Avant de recueillir, tapotez doucement la plaque sur tous les côtés et agiter pour éviter les effets de dégradé. Sceller la plaque opaque avec un adhésif sfeuille Ealing et conserver à 4 ° C jusqu'au moment de l'essai enzymatique.
   Remarque: sécrétée Gluc-SERCaMP est très stable dans un milieu de culture cellulaire. Nous avons précédemment rapporté environ 5-10% de l'activité a été perdue Gluc après une incubation de 72 h à 37 ° C (incubé sur SH-SY5Y) ^12.
3. Traiter les cellules comme souhaité pour examiner ER appauvrissement de calcium (par exemple l'environnement, pharmacologique, manipulations génétiques). Evitez une longue exposition à l'environnement ambiant (en dehors de l'incubateur contrôlée) que les changements de pH va se produire rapidement au _CO 2 atmosphérique. Ajouter HEPES au milieu de culture à 20 mM, pH ¹⁴ pour stabiliser, si manipulations longues sont nécessaires. Éviter l'exposition à la lumière lors de l'utilisation HEPES dans le milieu de culture ^15.
   1. Contrôle positif: traiter les cellules avec 100 nM thapsigargine (Tg) ou de l'acide cyclopiazonique 50 pm (CPA) pour 4-6 heures pour des expériences dans SH-SY5Y. Réponse maximale dans d'autres lignées cellulaires peut exiger incubations plus longues ou différentes concentrations de composés.
   2. Contrôle négatif: milieu de culture recueillons auprès de SH-SY5Y parentales. Dans notre expérience, la luminescence de fond pour cet essai est inférieure à 0,05% de la sécrétion basale de cellules SH-SY5Y-Gluc-SERCaMP stables.
4. Recueillir et échantillons magasin 5 pi de milieu conditionné au timepoints souhaitées, comme indiqué dans l'étape 1.2.
5. Évaluer l'activité enzymatique dans le milieu, comme indiqué à la section 5.
6. Examinez GLUC intracellulaire par immunotransfert ou un essai de luminescence.
   1. Pour immunoblot: lyser des cellules dans un tampon RIPA modifié contenant 50 mM de Tris (pH 7,4), NaCl 150 mM, désoxycholate de sodium à 0,25%, EDTA 1 mM, 1% de NP40 et des inhibiteurs de protéase. Séparé sur gel de polyacrylamide-SDS et transfert sur une membrane de 0,20 um en PVDF. Incuber la membrane avec l'anticorps GLUC (1: 2000 de dilution) nuit à 4 ° C. Effectuer incubation d'anticorps et membranaires lavages secondaires selon le protocole défini par l'utilisateur pour le réactif de détection de choix.
   2. Pourtest de luminescence (Figure 2): effectuez les étapes suivantes sur la glace:
      1. Retirez tout moyen de puits de la plaque de culture de tissus et rincer avec 200 pi de PBS froid.
      2. Ajouter 75 ul de tampon de lyse contenant 50 mM de Tris (pH 7,5), NaCl 150 mM, 1% de NP40 et des inhibiteurs de protease à chaque puits.
      3. Faire tourner la plaque sur un agitateur orbital (120 rpm) à 4 ° C pendant 20 min.
      4. Pipette doucement le lysat de haut en bas à l'aide d'une pipette multicanaux, en évitant les bulles d'air. Transfert 5 pi de lysat à une plaque opaque et évaluer la luminescence comme indiqué à la section 5.

2. Essai in vitro: transfection transitoire de cellules immortalisées avec SERCaMP

Note: Nous avons observé que les procédures de transfection transitoire peuvent induire un stress cellulaire et émousser la réponse GLUC-SERCaMP ultérieure. L'approche suivante a été développé pour minimiser transfection eff ECTS à SH-SY5Y. L'optimisation de ce procédé (y compris le choix du réactif de transfection) pour les lignées cellulaires de remplacement peut être nécessaire. Lorsque cela est possible, il est recommandé d'utiliser des lignées cellulaires stables ou méthodes de transduction virales décrites dans les sections 1 et 3 respectivement.

1. Plate SH-SY5Y dans un plat de 100 mm à 4 x 10 ⁶ cellules. Ce plat sera suffisante pour réensemencer environ 300 puits (format de plaque à 96 puits) en suivant la procédure de transfection.
2. Transfecter des cellules avec un réactif xfect en utilisant 20 ug d'ADN plasmidique (codant Gluc-SERCaMP) et 6 ul de réactif xfect. ADN à grande échelle et de réactif xfect conséquence pour grands ou plus petits récipients de culture.
3. Retour cellules dans l'incubateur pendant 48 heures.
4. Trypsiniser cellules et réensemencer des plaques à 96 puits à 60.000 cellules par puits. Suivez les étapes suivantes décrites dans la Section 1.

3. Test in vitro: Viral Expression Vector médiation GLUC-SERCaMP

tente "> Remarque: viral adéno-associé (AAV) emballage ¹⁶ et la purification ^{12 et 13} lentivirus production ont déjà été signalé.

1. Titre Gluc-SERCaMP AAV en utilisant les amorces et les sondes suivantes: amorce avant, 5'-CACGCCCAAGATGAAGAAGT-3 '; amorce inverse, 5'-GAACCCAGGAATCTCAGGAATG-3 '; sonde (5'-6-FAM / 3'-BHQ-1 marqué), 5'-TACGAAGGCGACAAAGAGTCCGC-3 'pour la PCR quantitative.
   1. Préparer la courbe standard par linéarisation un plasmide contenant GLUC et la purification de l'ADN en utilisant un spin-colonne (par exemple Machery-Nagel NucleoSpin Gel et PCR nettoyage). Quantifier l'ADN par séparation sur un gel d'agarose à côté d'une échelle de masse. Préparer des dilutions 1:10 de l'ADN de 100 pg / ml à 10 fg / ml dans PBS. Calculer les copies / ml d'ADN plasmidique Gluc à chacune des concentrations en fonction du poids moléculaire du plasmide.
   2. Diluer les stocks de AAV dans du PBS (dilution appropriée sera fonctionparamètres de préparation virale et déterminée empiriquement).
   3. Exécuter la réaction de PCR dans un système PCR en temps réel en utilisant les conditions suivantes: 95 ° C x 5 min, 94 ° C x 20 sec, et 60 ° C x 1 min pendant 41 cycles. Calculer copies / mL en utilisant la courbe standard.
2. Titre avec un lentivirus Lenti-X kit de titration rapide de p24. Décongeler aliquotes lentiviraux sur la glace et diluer la protéine de contrôle de p24 dans un milieu SH-SY5Y.
   1. Diluer le lentivirus tels qu'il va tomber sur la courbe standard (par exemple, 1: 20.000 ou 1: 100 000). Le facteur de dilution requis variera en fonction des paramètres de préparation lentiviraux et doit être déterminée de manière empirique. Suivez les instructions du fabricant pour toutes les étapes subséquentes.
3. Cellules de la plaque plaques à 96 puits. Pour SH-SY5Y, procédures de placage décrits dans la section 1 peuvent être suivies. Pour les neurones corticaux primaires de rat, les cellules doivent être isolés et ensemencées sur des plaques revêtues de manière appropriée uns ¹⁶ décrit précédemment. Maintenir les neurones corticaux primaires de rat dans du milieu Neurobasal additionné de B27 1x et 500 uM de L-glutamine. Effectuer des échanges demi de taille tous les autres jours.
4. Transduire les cellules avec le virus. Le but de transduction virale est de parvenir à une expression faible niveau, comme Gaussia luciférase fournit le signal robuste.
   1. Cellules SH-SY5Y AAV transduction: transduisent le lendemain placage. Diluer AAV à 6,0 x 10 ⁷ vg / ul dans AAV tampon de dilution (PBS + 0,5 mM _MgCl2). Ajouter 5 ul de AAV dilué (3.0 x 10 ⁸ vg; MOI d'environ 6.000) par puits de plaque de 96 puits (figure 3A). Utilisez l'eau de Javel à 10% pour inactiver les déchets de vecteur viral.
   2. AAV transduction de neurones corticaux primaires de rat: transduire 6-8 jours après placage. Diluer AAV à 4,0 x 10 ⁶ vg / ul dans du tampon de dilution AAV. Ajouter 5 ul de l'AAV diluée (2,0 x 10 ⁷ vg; MOI d'environ 350) par puits dePlaque de 96 puits (figure 3B). La MOI optimale doit être déterminée empiriquement pour d'autres types de cellules. Utilisez l'eau de Javel à 10% pour inactiver les déchets de vecteur viral.
   3. De transduction lentivirale SH-SY5Y: transduire le jour suivant placage. Diluer à 20 lentivirus pg / pl p24 (concentration déterminée en utilisant le kit de titrage) dans une solution saline équilibrée de Hank. Ajouter 5 ul du virus dilué par puits (100 pg de p24, équivalent à 1.250.000 particules lentiviraux, ou ~ 1250 IFU) d'une plaque de 96 puits contenant un volume de 100 pi. Échelle conséquence pour les grands formats. Utilisez l'eau de Javel à 10% pour inactiver les déchets virale.
5. Prélever un échantillon du milieu de pré-traitement et de commencer des traitements expérimentaux 48 h (SH-SY5Y) ou 5-7 jours (rat neurones corticaux primaires) après transduction.

4. Dosage in vivo SERCaMP

Remarque: Avant de procéder à toutes les procédures animales être sûr d'obtenir l'approbation appropriée auprès de votre institution. Touschirurgies survie sont à faire dans des conditions stériles avec une anesthésie adéquate. Toutes les procédures décrites ci-dessous ont été approuvés et sont en conformité avec les directives du NIH ACUC.

1. Instruments chirurgicaux autoclave avant le début de la chirurgie (121 ° C, 30 min stérilisation, 20 min le temps de séchage). Nettoyez tous les instruments d'un appareil à ultrasons immédiatement après toutes les procédures et avant autoclavage. Maintenir des conditions stériles pendant la chirurgie de survie. Pour les chirurgies nécessitant plusieurs animaux, essuyez instruments chirurgicaux avec 70% d'alcool, de perles et de stériliser ultrasonicate entre les rats. Reportez-vous à la liste de matériaux pour les instruments nécessaires.
2. Préparer rat pour la chirurgie. Ici, nous utilisons Sprague-Dawley mâle (180-200 g).
   1. Anesthésier les rats à l'aide de gaz isoflurane pendant 3 min (4-5% d'isoflurane présentées à 1000 cc / min), suivi par des injections intraperitoneales de xylazine (8 mg / kg) et de la kétamine (80 mg / kg). Appliquer une pommade ophtalmique pour protéger les cornées de se dessécher. Bla chirurgie egin une fois que le rat est profondément anesthésié comme l'a démontré par le manque de réflexe de retrait suivant la queue ou le pied presseur.
   2. Rasez la région de l'abdomen légèrement en dessous des côtes (faible) région thoracique à la région abdominale mi. Frotter la zone chirurgicale trois fois, en alternant 70% d'alcool et Betadine scrub. Placez rat en position couchée sur la zone chirurgicale stérile avec draps chirurgicaux stériles.
3. Diluer AAV-Gluc-SERCaMP à 7,6 x 10 ⁹ vg / ml (concentration finale). Bien mélanger en inversant le tube.
   Remarque: La portée de la concentration virale peut varier (Figure 4).
   1. Pipet 105 pi de AAV diluée dans un plat stérile. Utiliser une aiguille de calibre 30 pour recueillir le virus dans une seringue.
4. Effectuer une chirurgie pour exposer le foie et injecter AAV-Gluc-SERCaMP.
   1. Avant de faire une incision dans l'abdomen, appliquer bupivacaïne à 0,25% pour la zone d'incision. Avec un scalpel, faire une incision horizontale en dessous de la cage thoracique (apron 2-3 cm). Blunt disséquer pour séparer le tissu conjonctif de l'hypoderme.
   2. Couper muscle abdominal, exposant le lobe médial droit de foie.
      Nota: Les lobes supplémentaires peuvent être injectées en fonction de l'application finale.
   3. Placez l'animal sous microscope chirurgical et ajuster pour obtenir lobe médial droit de foie dans le champ de vision. Injecter virus dans le parenchyme du lobe médial; 3 sites distincts, environ 33 pi par site.
      Remarque: Laissez l'aiguille dans le tissu pour les 5-10 secondes après l'injection pour assurer la livraison de l'ensemble du volume d'injection.
   4. Suturer le muscle abdominal et la peau séparément et ajouter Néosporine utilisant du coton applicateur à bout. Placez rat dans une chambre de récupération jusqu'à ce que la conscience est repris et le rat est capable de maintenir en position verticale. Ne pas laisser le rat (s) sans surveillance tant qu'il a repris conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal. Maison seuls jusqu'à l'incision est guérie et les sutures ont été retirées (7-14 jours).
      Remarque: Conformément aux directives post-chirurgicales NIH, tenir un registre chirurgical. Annoter la carte de la cage à la procédure, la date, l'identificateur de l'expérience, le poids corporel, et le jour de la chirurgie. Douleur / détresse, la production de matières fécales, l'activité, l'alimentation et la consommation d'eau doivent être surveillés et enregistrés la chirurgie de 3 jours. Analgésie post-opératoire est fournie par l'ajout de l'acétaminophène pour l'eau potable (450 mg / 100 cc), même si nous ne constatons généralement des signes de douleur ou de détresse après la chirurgie.
5. Commencer la collecte de sang de la queue 4-7 jours après l'injection. Préparer des tubes de collecte de sang par voie d'étiquetage et de pré-pesée. Ajouter 50 ul d'héparine (1000 U / ml) à chaque tube.
6. Lieu rat dans la chambre de l'isoflurane pendant 3 min (4-5% d'isoflurane livré à 1000 cc / min). Retirer rat de la chambre et le placer dans le nez cône (2-3% d'isoflurane livré à 500 cc / min). La collecte de sang peut commencer une fois que le rat est profondément anesthésié comme l'a démontré par le manque de réflexe de retrait suivante queue piNCH.
   1. Avec des ciseaux stériles pointe couper la queue (1-2 mm) et recueillir le sang goutte à goutte dans le tube pré-remplie héparine. Prélever le sang jusqu'à ce volume atteint supérieur à 2: 1 rapport sang héparine (> 100 pi de sang / 50 ul d'héparine). Volumes de collecte de sang peuvent être ajustées en fonction de la conception expérimentale. Utilisez un applicateur de coton humide pour appliquer la poudre hémostatique à la queue pour arrêter le saignement.
   2. Tubes de sang de magasin à 4 ° C si la collecte d'échantillons ultérieurs. Essuyez ciseaux avec tampon de l'éthanol et le talon stériliser entre les collections.
   3. Peser les tubes de prélèvement et d'ajuster avec de l'héparine pour obtenir ratio 2: 1 (sang: héparine). Cette étape normaliser la quantité d'héparine dans chaque échantillon (tableau 1).
   4. Tubes à centrifuger à 2000 g pendant 5 min à 4 ° C. Transférer le surnageant (plasma) dans un nouveau tube et conserver à -80 ° C jusqu'au dosage de la luciférase (section 5).
      Remarque: Le stockage des échantillons à 4 ° C jusqu'à 72 heures avant le dosage enzymatique a minimal effet sur ​​la luminescence (figure 5A). Jusqu'à 3 cycles de gel-dégel des échantillons de plasma ont aucun effet sur ​​la luminescence (figure 5B).
7. Administration thapsigargine (contrôle positif):
   1. Préparer thapsigargine en diluant dans de l'éthanol à une concentration finale de 2,5 mg / ml. Injecter thapsigargine à 1 mg / kg ip dans le bas-ventre.
      Remarque: thapsigargine augmente plaquettaire induite par la thrombine coagulation ¹⁷ et peut faire la collecte de sang de la queue plus difficile.
8. Gaussia dosage de la luciférase:
   1. Décongeler les échantillons de plasma sur la glace.
      Remarque: Pour les études longitudinales, dégel et effectuer test de luminescence pour tous les échantillons de TIMEPOINT le même jour (en utilisant la préparation unique de substrat).
   2. Transfert 10 pi de plasma à une plaque paroi opaque et mesurer l'activité enzymatique comme décrit dans la section 5. Run 3-4 répétitions techniques de chaque échantillon de plasma.
9. Euthanasiun
   Remarque: L'avantage de la technologie SERCaMP est la capacité de moniteur longitudinalement ER calcium. En fonction des paramètres expérimentaux et point final des analyses, les animaux doivent être euthanasiés par des mesures appropriées pour critère analyses et conformément aux lignes directrices de l'ACUC institutionnels.

5. Luminescence Assay

1. Préparer des solutions coelentérazine (CTZ) sous licence par dilution du composé dans du methanol acidifié (30 ul de HCl à 10 3 ml de methanol) à 20 mM. Préparer des aliquotes à usage unique et conserver à -80 ° C.
2. Préparer le substrat de travail sur le jour de dosage.
   1. Pour les essais in vitro, diluer coelentérazine à 8 uM dans du PBS, par exemple, ajouter 10 ul de 20 mM CTZ de stock à 25 ml de PBS (Figure 6a, b).
   2. Pour les essais in vivo, diluer à 100 uM cœlentérazine dans du PBS mM, acide ascorbique 500, 5 mM de NaCl.
3. Incuber préparé CTZ pendant au moins 30 minà température ambiante avant de commencer le test.
   Remarque: Cette étape est souvent inclus dans Gaussia dosages de luciférase comme il ya des rapports de décomposition du substrat rapide au cours de 30 premières minutes après la préparation. Nous avons pas observé cet effet dans notre système (Figure 6C); cependant, nous incluons souvent l'étape d'incubation comme nous l'avons constaté aucun impact négatif sur le dosage.
4. Utiliser un lecteur de plaque qui est capable de bioluminescence et de surveillance équipé d'un injecteur de substrat. Prime les lignes avec substrat.
   Remarque: Le support initial à travers les lignes peuvent être sujettes à la dégradation. Pour éviter des lectures artificiellement bas pour les premiers échantillons, injecter 20-30 puits vides (chargement une assiette vide sur le lecteur) avant de mesurer les échantillons expérimentaux.
5. Injecter 100 ul de substrat dans le puits, secouez vitesse moyenne pendant 5 sec, et de mesurer l'émission de lumière. Pour le lecteur de plaque Biotek Synergy II, intégrer l'émission de lumière plus de 0,5 sec (échantillons in vitro) et 5 secondes (enin vivo des échantillons) pour l'étape de lecture. Optimiser les paramètres du lecteur de plaque pour la performance du test idéal.
   Remarque: expositions Gaussia luciférase Flash cinétique avec décroissance rapide du signal (par rapport à briller cinétiques observées avec d'autres luciférases). La cinétique flash de GLUC est influencée par le sérum dans un milieu de culture cellulaire (figure 7A), soulignant l'importance de contrôler la composition du milieu entre les échantillons. En raison de la dégradation rapide de la luminescence après l'ajout de substrat (cinétique flash), le temps entre injection et lire étapes doit être uniforme pour tous les échantillons. Le lecteur de plaque doit être réglé pour injecter substrat à un bien, attendez un temps fixe (par exemple, nous utilisons une étape de bougé de 5 sec), et lisons que bien. Ajout de substrat pour une plaque entière avant la lecture pose un défi de taille à moins substrat peut être ajouté à tous les puits simultanément. Si un injecteur ne sont pas disponibles, la question peut être partiellement contourné par incubation de la plaque pendant 10 min entre le substrat Addition et de mesure (évitant ainsi la partie raide de la courbe de décroissance) (figure 7B).
6. Répéter l'injection, le temps d'attente, et de lire étapes pour chaque puits sur la plaque.

Résultats

La méthode GLUC-SERCaMP permet pour l'évaluation des ER homéostasie calcique en échantillonnant les liquides extracellulaires. Plusieurs contrôles peuvent être inclus dans la conception expérimentale pour améliorer l'interprétation des résultats. Tout d'abord, l'utilisation d'un journaliste constitutivement sécrétée (par exemple GLUC sans ASARTDL C-terminale ou "GLUC-Pas Tag") peut être utilisé pour évaluer les effets des traitements expérimentaux sur la voie de s?...

Discussion

Ce protocole met en évidence in vitro et in vivo de l'utilité de Gluc-SERCaMP pour contrôler l'épuisement de calcium ER. Bien que la modification de la protéine pour générer SERCaMP semble généraliser à d'autres ¹² protéines rapporteurs, nous avons choisi pour la luciférase de Gaussia son robuste (200-1,000 fois supérieure) bioluminescence par rapport aux autres luciférases ^18. Nous démontrons détectable induite thapsigargine GLUC-SERCaMP libé...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml tubes	Fisher	02-682-550
10% NP-40 solution	Pierce	28324	for intracellular GLuc assays
1 ml luer-lok syringes	Fisher	14-823-30
200 microliter filter tips	Rainin	RT-L200F
3-0 surgical sutures	Fisher	NC9598192
30 G needles	Fisher Scientific	14-821-13A
Adhesive microplate sealing sheets	Thermo	AB-0558
Alcohol prep pads	Fisher	22-246-073
Anesthesia Auto Flow System	E-Z Anesthesia	EZ-AF9000
Animal recovery chamber	Lyon Vet	ICU-912-004
B27 supplement	Life Technologies	17504-044
Betadine solution	Fisher	NC9386574
Bleach	Clorox	n/a
Bovine growth serum	Thermo	SH30541.03
Coelenterazine, Native	Regis Technologies	1-361204-200
Cotton tipped applicators	Puritan	806-WC
Cutting needles 3/8 circle sutures	WPI	501803
Digital ultrasconic cleaner	Fisher Scientific	FS60D
DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvate	Life Technologies	10569-010
DNA mass ladder	Life Technologies	10496-016
Gaussia luciferase (recombinant protein)	Nanolight	321-100
Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC)	New England Biolabs	E8023S	1:2,000 (WB)
Germinator 500	CellPoint Scientific	DS-401
Gluc assay plates (96 well, opaque)	Fisher	07-200-589
Hank's balanced salt solution	Life Technologies	14175-095
Heparin	Allmedtech	63323-276-02
Isoflurane	Butler Schein	29404
Ketamine	Henry Schein	995-2949
Kwik Stop Styptic powder	Butler Schein	5867
L-glutamine	Sigma	G8540
Methanol	Fisher	a452-4
Microfuge 22R Centrifuge	Bekman Colter	368831
Neosporin	Fisher	19-898-143
Neurobasal medium	Life Technologies	21103049
Nikon Stereoscope	Nikon	SMZ745T
Nucleospin Gel and PCR Cleanup	Machery-Nagel	740609
P200 pipet	Rainin	L-200XLS+
p24 Lenti-X rapid titer kit	Clontech	632200
PCR film seal	Fisher	AB0558
Penicillin/streptomycin	Life Technologies	15140-122
Protease inhibitor cocktail	Sigma	P8340
ReFresh Charcoal Filter canister	E-Z Anesthesia	EZ-258
Scalpel blades, #10	Fine Science tools Inc	10010-00
SD rats 150-200 g	Charles River	Rats	rats ordered at 150-200 g.  Surgery 5 days after arrival
Small animal ear tags	National Band and Tag co	1005-1
Sterile surgical drapes	Braintree Scientific	SP-MPS
Synergy 2 plate reader	BioTek	n/a
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems	4304437
Thapsigargin	Sigma	T9033	harmful to human health
Virapower lentiviral packaging mix	Life Technologies	K4975-00
Xfect Transfection reagent	Clontech	631318
Xylazine	Valley Vet	468RX