Überwachung Endoplasmatischen Reticulum Calciumhomöostase Mit ein<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferase SERCaMP

Zusammenfassung

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Zusammenfassung

Das endoplasmatische Retikulum (ER) enthält, die höchste Stufe von intrazellulärem Calcium, wobei Konzentrationen etwa 5000-fach größer als cytoplasmatische Ebenen. Strenge Kontrolle über ER Calcium ist zwingend notwendig für die Proteinfaltung, Änderung und Menschenhandel. Perturbationen ER Calcium kann in der Aktivierung des ungefalteten Protein-Reaktion, einer dreipoligen ER Stressantwort Mechanismus führen und tragen zur Pathogenese einer Vielzahl von Erkrankungen. Die Fähigkeit, ER Kalzium Veränderungen während der Krankheit Beginn und Fortschreiten zu überwachen ist wichtig, im Prinzip, dennoch schwierig in der Praxis. Derzeit verfügbare Verfahren zur Überwachung von ER Calcium, wie Calcium-abhängigen Fluoreszenzfarbstoffe und Proteine, Einsicht in ER Calciumdynamik in Zellen bereitgestellt, aber diese Werkzeuge sind nicht für in-vivo-Studien geeignet. Unserem Labor haben gezeigt, dass eine Modifikation des Carboxyterminus von Gaussia-Luciferase vermittelt die Sekretion des Reporters in Reaktion aufER Kalzium Erschöpfung. Die Verfahren zur Verwendung einer Luciferase beruht, sezerniert ER Calciumüberwachungsprotein (SERCaMP) zum in vitro und in vivo-Anwendungen werden hier beschrieben. Dieses Video zeigt Leber Injektionen, pharmakologische Manipulation von Gluc-SERCaMP, Blutentnahme und Verarbeitung, und Assay-Parameter für Längs Überwachung der ER Kalzium.

Einleitung

Das endoplasmatische Retikulum (ER) Funktionen in vielen Zellkapazitäten einschließlich Proteinfaltung, Proteinsekretion Lipidhomöostase und intrazelluläre Signal ^1. Von zentraler Bedeutung für normale ER-Funktion wird beibehalten Lumencalciumkonzentrationen bei ~ 5.000 Mal jene im Zytoplasma ^2-4 gefunden. Dieser energieintensive Prozess wird durch die sarco / endoplasmatischen Reticulum Calcium ATPase (SERCA), eine Pumpe, die Calcium-Ionen in das ER bewegt geregelt. Efflux von Kalzium aus dem ER wird hauptsächlich durch den Ryanodin (RyR) und Inositol-Triphosphat (IP3R) -Rezeptoren vermittelt werden. Da viele ER Prozesse sind abhängig von Kalzium, kann stören den Speicher, um ER Stress und schließlich zum Zelltod führen.

ER Calcium Dysregulation in Krankheiten wie Kardiomyopathie, Diabetes, Alzheimer beobachtet und ^Parkinson-5. Infolge der Progressivität dieser Krankheiten wurde schwierig, die Ursache-Wirkungs-Wieder abgrenzenhung zwischen Pathogenese und Veränderungen in der ER Kalziumspeicher. Eine Anzahl von Technologien für signifikante Fortschritte im Verständnis der ER Calciumdynamik, einschließlich Farbstoffe und genetisch kodierte Calciumindikatoren (GeCIS) erlaubt. Geringe Affinität Calcium-Farbstoffe, die in der Fluoreszenz zu erhöhen, wenn Ca ²⁺ gebunden ist, kann in die Zellen geladen werden, um subzellulären Kompartimenten mit hohen Konzentrationen an Calcium ⁶ zu untersuchen. GeCIS wie D1ER und Catcher ermöglichen Überwachung Calciumschwankungen genauere Steuerung der subzellulären Lokalisation ^7-9. Vor kurzem hat eine weitere Klasse von GeCIS sogenannter Kalziummess Organell eingeschlossenen Proteinindikatoren (CEPIA) beschrieben worden sind ^10. Ein dritter Ansatz, der Genetik und der Chemie kleiner Moleküle ist gezielte Esterase-Farbstoffbeladung (TED), die eine genetisch kodierte Carboxylesterase (zum ER gezielte) mit einem Ester-basierten Calcium Farbstoff ¹¹ verwendet.

Während der AFORementioned Ansätze haben inhärenten Stärken und Schwächen, können sie wertvolle Einblicke in ER Kalziumdynamik durch akute Fluoreszenzmessungen bereitzustellen. Sie sind jedoch für die Langzeitstudien oft erforderlich, um den Krankheitsverlauf zu untersuchen nicht optimal. Mit dem Ziel der Entwicklung einer Methode zur Calciumdynamik über längere Zeiträume hinweg zu beobachten, wurde identifiziert und entwickelt eine Proteinmodifikation, die sezerniert ER Calcium Überwachung Proteine ​​(SERCaMPs) ¹² zu schaffen.

SERCaMP umgeht einige Einschränkungen mit anderen Methoden verbunden sind, durch die Bereitstellung einer minimal-invasiven Ansatz, um wiederholt zu verhören die ER Kalziumspeicher. Wir haben zuvor gezeigt, dass die Carboxy-terminalen Peptids ASARTDL (Alanin-Serin-Alanin-Arginin-Threonin-Asparaginsäure-Leucin) ausreicht, um ER-Retentions fördern; jedoch unter Bedingungen, die Abnahme der ER Calcium verursachen kann, ist die Peptidsequenz nicht mehr ER localizatio behaltenn und das Protein sekretiert ^13. Die Basis der SERCaMP Technologie ist das Anhängsel ASARTDL zum Carboxy-Terminus eines sezernierten Proteins (zB Gaussia-Luciferase oder Gluc), so dass die Sekretion von ER Calciumverarmung ausgelöst, wodurch eine robuste Reporter ER Calcium Dysregulation ^12. Die Expression von Gluc-SERCaMP über transgene Methoden können biologische Flüssigkeiten wie Zellkulturmedium und Plasma, um Änderungen der Gluc-Aktivität als Indikator für die ER Calciumhomöostase analysiert werden. Das Verfahren findet Anwendung für die Langzeitstudie über progressive Veränderungen in der ER Calciumspeicher sowohl in vitro als auch in vivo. Das folgende Protokoll wird als eine allgemeine Übersicht zur Verwendung von Gluc-basierte SERCaMP zu ER Calciumhomöostase studieren geschrieben, aber das Protokoll kann als Leitfaden für alternative Reporter SERCaMPs dienen.

Protokoll

1. In vitro-Test: Entdecken SERCaMP Mitteilung von einer stabilen SH-SY5Y-Zelllinie

1. Platte SH-SY5Y-Gluc-ASARTDL (SERCaMP) in Gewebekultur-behandelten Platten mit 150.000 Zellen pro cm ^{2 Oberfläche.} Für Platten mit 96 Vertiefungen, zum Beispiel Saatgut 50.000 Zellen pro Vertiefung (1A). Wachsen SH-SY5Y-Zellen in DMEM (hoher Glukose, GlutaMAX, Pyruvat) + 10% Rinderwachstumsserum + 1x Penicillin / Streptomycin.
   1. Passage-Zellen bis zu 15 mal (1B). Höhere Durchlaufhäufigkeit wurde nicht getestet.
   2. Zurückzukehren Zellen befeuchteten Inkubator bei 37ºC mit 5,5% CO _{2 und} über Nacht inkubieren.
2. Vor Versuchs Behandlung (en) zu sammeln eine Ausgangsprobe für jede Vertiefung durch Übertragung von 5 ul Kulturüberstand zu einem opaken mauert Platte mit 96 Vertiefungen. Vor dem Sammeln, klopfen Sie die Platte auf allen Seiten und wirbeln Gradienten Effekte zu vermeiden. Verschließen Sie die undurchsichtige Platte mit einem Klebstoff sEaling Blatt und bei 4 ° C bis zur enzymatischen Assay.
   Anmerkung: Secreted Gluc-SERCaMP ist in Zellkulturmedium sehr stabil. Wir bereits berichtet etwa 5-10% der Gluc-Aktivität wurde nach einer 72-stündigen Inkubation bei 37 ° C (auf SH-SY5Y-Zellen inkubiert) ¹² verloren.
3. Gönnen Zellen wie gewünscht, um ER Kalziumabbau zu untersuchen (zB Umwelt-, pharmakologische, genetische Manipulationen). Vermeiden Sie lange Aussetzung an Umgebungsbedingungen (außerhalb der Brutapparat) als pH-Änderungen schnell bei atmosphärischem _CO 2 entstehen. Hinzufügen HEPES zum Kulturmedium auf 20 mM, pH-Stabilisierung ^14, wenn längerer Manipulationen erforderlich sind. Lichteinwirkung zu vermeiden, wenn mit HEPES in Kulturmedium ^15.
   1. Positive Kontrolle: Behandeln Sie die Zellen mit 100 nM Thapsigargin (Tg) oder 50 uM Cyclopiazonsäure (CPA) für 4-6 Stunden für Experimente in SH-SY5Y-Zellen. Maximale Reaktion in anderen Zelllinien können längere Inkubationen oder verschiedene Konzen erforderlichtrationen von Verbindungen.
   2. Negative Kontrolle: Collect Kulturmedium aus der Eltern SH-SY5Y-Zellen. Nach unserer Erfahrung ist die Hintergrundlumineszenz für diesen Test weniger als 0,05% der basale Sekretion von stabil SH-SY5Y-Gluc-SERCaMP Zellen.
4. Sammeln und speichern 5 ul Proben des konditionierten Medien zu den gewünschten Zeitpunkten, wie in Schritt 1.2 beschrieben.
5. Beurteilen Sie enzymatischer Aktivität in dem Medium, wie in Abschnitt 5 beschrieben.
6. Untersuchen intrazellulärer Gluc durch Immunoblot oder Lumineszenz-Assays.
   1. Für Immunoblot: lysieren Zellen in modifiziertem RIPA-Puffer, enthaltend 50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 0,25% Natriumdesoxycholat, 1 mM EDTA, 1% NP40 und Protease-Inhibitoren. Separate auf SDS-Polyacrylamid-Gel und Transfer zu 0,20 um PVDF-Membran. Dazu werden die Membranen mit Gluc Antikörpers (1: 2000 Verdünnung) über Nacht bei 4 ° C. Führen sekundären Antikörper Inkubation und Membran wäscht nach benutzerdefinierten Protokolls für Nachweisreagenz der Wahl.
   2. FürLumineszenz-Assays (Abbildung 2): Führen Sie folgende Schritte auf dem Eis:
      1. Entfernen Sie das gesamte Medium aus Vertiefungen der Gewebekulturplatte und spülen mit 200 ul kaltem PBS.
      2. Hinzuzufügen 75 ul Lysepuffer, enthaltend 50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1% NP40 und Protease-Inhibitoren in jede Vertiefung.
      3. Drehen der Platte auf einem Orbitalschüttler (120 Upm) bei 4 ° C für 20 min.
      4. Pipette vorsichtig das Lysat nach oben und unten mit einer Mehrkanalpipette, die Vermeidung von Luftblasen. Bringen Sie 5 ul Lysat zu einer undurchsichtigen Platte und bewerten Lumineszenz, wie in Abschnitt 5 beschrieben.

2. In vitro-Test: transiente Transfektion von immortalisierten Zellen mit SERCaMP

Hinweis: Wir haben festgestellt, dass die transiente Transfektion Verfahren können zellulären Stress zu induzieren und stumpf die anschließende Gluc-SERCaMP Antwort. Der folgende Ansatz wurde entwickelt, um die Transfektion eff minimieren ECTS in SH-SY5Y-Zellen. Optimierung dieses Verfahrens (einschließlich Auswahl des Transfektionsreagenz) zum alternativen Zelllinien erforderlich. Wenn möglich, ist es empfehlenswert, stabile Zelllinien oder viralen Transduktion Methoden in den Abschnitten 1 und 3 jeweils beschriebenen verwenden.

1. Platte SH-SY5Y-Zellen in einer 100 mm-Schale mit 4 × ¹⁰ 6 Zellen. Dieses Gericht wird ausreichen, um re-Samen etwa 300 Brunnen (96 Well-Plattenformat) nach der Transfektion Verfahren.
2. Transfizierenden Zellen mit Xfect Reagens unter Verwendung von 20 ug Plasmid-DNA (kodiert Gluc-SERCaMP) und 6 ul Xfect Reagenz. Skala DNA und Xfect Reagenz entsprechend für größere oder kleinere Kulturgefäße.
3. Zurückzukehren Zellen für 48 Stunden Inkubator.
4. Trypsinize Zellen und reseed Platten mit 96 Vertiefungen mit 60.000 Zellen pro Vertiefung. Folgen Sie den nachfolgenden Schritten in Kapitel 1 beschrieben.

3. In vitro-Test: viralen Vektor-vermittelte Expression von Gluc-SERCaMP

Zelt "> Hinweis: Adeno-assoziierte virale (AAV) Vektor Verpackung ¹⁶ und Reinigung ^{12 und} Lentivirus Produktions ¹³ wurde bereits berichtet.

1. Titer Gluc-SERCaMP AAV unter Verwendung der folgenden Primer und Sonden: Vorwärts-Primer, 5'-CACGCCCAAGATGAAGAAGT-3 '; Rückwärts-Primer, 5'-GAACCCAGGAATCTCAGGAATG-3 '; Sonde (5'-6-FAM / 3'-BHQ-1 bezeichnet), 5'-TACGAAGGCGACAAAGAGTCCGC-3 'für die quantitative PCR.
   1. Vorbereitung der Standardkurve durch Linearisierung eines Plasmids, welches Gluc und Reinigung der DNA unter Verwendung einer Spin-Säule (Macherey-Nagel zB NucleoSpin Gel und PCR-Reinigung). Quantifizierung der DNA durch Trennen an einem Agarosegel zusammen mit einer Masse-Leiter. Vorzubereiten 1.10 Verdünnungen von DNA von 100 pg / ml bis 10 fg / ml in PBS. Berechnung der Kopien / ml Gluc Plasmid-DNA in jeder der Konzentrationen, bezogen auf das Molekulargewicht des Plasmids.
   2. Verdünnen Sie die AAV-Stamm in PBS (entsprechender Verdünnung wird abhängig sein,Parameter der Viruspräparat und empirisch bestimmt).
   3. Führen Sie die PCR-Reaktion in einem Echtzeit-PCR-System unter den folgenden Bedingungen: 95 ° C × 5 min, 94 ° C × 20 Sekunden und 60 ° C × 1 min für 41 Zyklen. Berechnen Sie Kopien / ml unter Verwendung der Standardkurve.
2. Titer Lentivirus mit einer p24 Lenti-X schnellen Titer Kit. Auftauen lentiviralen Aliquots auf Eis und verdünnen das p24-Kontrollprotein in SH-SY5Y Medium.
   1. Verdünnen Sie die Lentivirus, so dass es auf die Standardkurve (zB 1: 20.000 oder 1: 100.000) fällt. Die erforderliche Verdünnung Faktor wird auf dem lentiviralen Herstellungsparameter variieren und muss empirisch ermittelt werden. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers für alle folgenden Schritte.
3. Platten Zellen auf 96-Well-Platten. Für SH-SY5Y-Zellen, können Beschichtungsverfahren in Abschnitt 1 dargelegt befolgt werden. Für Ratten primären kortikalen Neuronen, sollten Zellen isoliert und auf entsprechend beschichtete Platten ein ausgesät werdens die zuvor beschriebenen ^16. Pflegen Ratte primären kortikalen Neuronen in Neurobasalmedium mit 1x B27 und 500 & mgr; M L-Glutamin. Führen Sie jeden zweiten Tag die Hälfte mittel Börsen.
4. Transduktion der Zellen mit Virus. Das Ziel ist es, virale Transduktion Expression auf niedrigem Niveau zu erreichen, wie Gaussia-Luciferase bietet robuste Signal.
   1. AAV-Transduktion SH-SY5Y-Zellen: transduzieren am Tag nach Beschichtung. Verdünnter AAV bis 6,0 x ¹⁰ & sup7; VG / & mgr; l in AAV-Verdünnungspuffer (PBS + 0,5 mM MgCl _2). In 5 ul verdünnt AAV (3,0 x ¹⁰ 8 vg; MOI von etwa 6.000) pro Well von 96-Well-Platte (3A). Verwenden Sie 10% Bleichmittel auf viralen Vektor Abfall inaktivieren.
   2. AAV-Transduktion Ratten primären kortikalen Neuronen: transduzieren 6-8 Tage nach der Plattierung. Verdünnter AAV bis 4,0 x ¹⁰ & sup6; VG / & mgr; l in AAV-Verdünnungspuffer. In 5 ul verdünnt AAV (2,0 x 10 ⁷ vg; MOI von etwa 350) pro VertiefungPlatte mit 96 Vertiefungen (3B). Die optimale MOI sollte empirisch für andere Zelltypen bestimmt werden. Verwenden Sie 10% Bleichmittel auf viralen Vektor Abfall inaktivieren.
   3. Lentivirale Transduktion von SH-SY5Y-Zellen: transduzieren am Tag nach Beschichtung. Verdünnen Sie Lentivirus zu 20 pg / ul p24 in Hanks ausgewogener Salzlösung (mit Titerung Kit Konzentration bestimmt). Add 5 ul der verdünnten Virus pro Vertiefung (100 pg von p24, das entspricht 1.250.000 lentivirale Partikel oder ~ 1.250 IFUs) einer Platte mit 96 Vertiefungen 100 ul Volumen. Skalieren entsprechend für größere Formate. Verwenden Sie 10% Bleichmittel auf virale Abfall inaktivieren.
5. Sammeln Sie eine Vorbehandlung Probe des Mediums und beginnen experimentelle Behandlungen 48 h (SH-SY5Y) oder 5-7 Tage (rat primären kortikalen Neuronen) nach Transduktion.

4. In Vivo SERCaMP Assay

Hinweis: Vor der Durchführung von Tierversuchen irgendwelche Achten Sie auf ordnungsgemäße Genehmigung durch Ihre Einrichtung zu erhalten. AlleÜberleben Operationen sind unter sterilen Bedingungen mit ausreichender Betäubung durchgeführt werden. Alle nachfolgend beschriebenen Verfahren wurden genehmigt und sind in Übereinstimmung mit NIH ACUC Richtlinien.

1. Autoklaven chirurgische Instrumente vor der Operation zu starten (121 ° C, 30 min Sterilisations, 20 min Trockenzeit). Reinigen Sie alle Instrumente in einem Ultraschallgerät unmittelbar nach allen Verfahren und vor dem Autoklavieren. Pflegen sterilen Bedingungen während des Überlebens der Operation. Für Operationen mehrere Tiere erfordern, wischen chirurgische Instrumente mit 70% Alkohol, ultrasonicate und Perlen sterilisieren zwischen Ratten. Siehe Materialliste für die notwendigen Instrumente.
2. Bereiten rat für die Chirurgie. Hier verwenden wir männliche Sprague-Dawley (180-200 g).
   1. Betäuben Ratten mit Isofluran Gas für 3 Minuten (4-5% Isofluran bei 1000 cm³ / min zugeführt), gefolgt von intraperitoneale Injektionen von Xylazin (8 mg / kg) und Ketamin (80 mg / kg). Bewerben Augensalbe zur Hornhaut vor dem Austrocknen zu schützen. BEgin Operation, sobald die Ratte ist tief narkotisierten, wie durch das Fehlen von Ziehreflex folgenden Schwanz oder Fuß Prise demonstriert.
   2. Rasieren Sie die Region des Bauches leicht unter den Rippen (niedrig BWS) auf die Mitte der Bauchregion. Scrub die OP-Bereich dreimal im Wechsel 70% Alkohol und Betadine Scrub. Zeigen Ratte in Rückenlage auf sterilen OP-Bereich mit sterilen OP-Abdeckungen.
3. Verdünnter AAV-Gluc-SERCaMP bis 7,6 x ¹⁰ 9 vg / ml (Endkonzentration). Gut mischen durch Umdrehen des Röhrchens.
   Anmerkung: Reichweite der Viruskonzentration (Abbildung 4) variieren.
   1. Pipette 105 ul verdünnt AAV in eine sterile Schale. Verwenden Sie eine 30-Gauge-Nadel, um das Virus in eine Spritze zu sammeln.
4. Durchführung von Operationen, die Leber zu entlarven und zu injizieren AAV-Gluc-SERCaMP.
   1. Vor dem Vornehmen eines Einschnitts in der Bauchhöhle, gelten 0,25% Bupivacain zu dem Schnittbereich. Mit einem Skalpell einen horizontalen Schnitt unterhalb Brustkorb (apnäherungs 2-3 cm). Stumpf sezieren, um das Bindegewebe aus Unterhaut zu trennen.
   2. Schneiden Sie Bauchmuskel, Freilegung der rechten medialen Leberlappen.
      Hinweis: zusätzliche Lappen kann basierend auf End-Anwendung injiziert werden.
   3. Zeigen Tier unter Operationsmikroskop und passen Sie nach rechts medialen Leberlappen in das Blickfeld zu bekommen. Spritzen Sie Virus in Parenchym der medialen Lappen; 3 separate Websites, etwa 33 & mgr; l pro Standort.
      Hinweis: Lassen Sie Nadel im Gewebe für 5-10 sec nach der Injektion bis zur Lieferung des gesamten Einspritzvolumen zu gewährleisten.
   4. Naht der Bauchmuskeln und die Haut getrennt und fügen Neosporin mit Wattestäbchen. Zeigen Ratte in einem Wiedergewinnungskammer, bis das Bewusstsein wiedererlangt und Ratten in der Lage, aufrecht zu erhalten. Lassen Ratten (n) nicht unbeaufsichtigt, bis es ausreichend, das Bewusstsein wiedererlangt, um Brustlage zu halten. Haus einzeln, bis der Einschnitt verheilt und Nahtmaterialien entfernt worden sind (7-14 Tage).
      Anmerkung: Wie pro NIH postoperativen Richtlinien halten chirurgische Rekord. Anmerken Käfigkarte mit Verfahren, Datum, Experiment Kennung, Körpergewicht und Tag der Operation. Schmerz / Not, Kot Produktion, Aktivität und Futter- und Wasseraufnahme sind überwacht und aufgezeichnet 3 Tage post-OP werden. Postoperative Analgesie wird durch Zugabe von Paracetamol auf die Trinkwasser (450 mg / 100 ml) zur Verfügung gestellt, obwohl wir in der Regel nicht zu beobachten Anzeichen von Schmerzen oder Leiden nach der Operation.
5. Beginnen Schwanz Blutentnahme 4-7 Tage nach der Injektion. Bereiten Blutentnahmeröhrchen Etiketten und pre-Wiegen. Zugabe von 50 & mgr; l Heparin (1000 U / ml) zu jedem Röhrchen.
6. Platz Ratte in Isofluran-Narkose Kammer 3 min (4-5% Isofluran bei 1.000 cm³ / min geliefert). Entfernen Ratte aus der Kammer und in Nasenkegel (2-3% Isofluran bei 500 cm³ / min geliefert). Blutentnahme kann beginnen, sobald die Ratte ist tief anästhesiert, wie durch das Fehlen von Ziehreflex folgenden Schwanz pi nachgewiesennch.
   1. Mit einer sterilen Schere Rutenspitze (1-2 mm) und sammeln Bluttropfenweise in vorgefüllten Heparin Röhrchen. Blutentnahme bis zum Volumen von mehr als 2 erreicht: 1 Blut in Heparin-Verhältnis (> 100 & mgr; l Blut / 50 ul Heparin). Blutabnahmemengen können basierend auf experimentellen Design angepasst werden. Verwenden Sie einen feuchten Watte zur blutstillende Pulver an den Schwanz gelten die Blutung zu stoppen.
   2. Speicher Blutröhrchen bei 4 ° C, wenn das Sammeln nachfolgende Proben. Wischen Schere mit Ethanol-Pad und Perlen sterilisieren zwischen Sammlungen.
   3. Wiegen Sammelröhrchen und stellen Sie mit Heparin, um 2: 1-Verhältnis (Blut: Heparin). Dieser Schritt wird die Menge von Heparin in jeder Probe (Tabelle 1) zu normalisieren.
   4. Zentrifugenröhrchen bei 2.000 xg für 5 Minuten bei 4 ° C. Den Überstand (Plasma) in ein frisches Röhrchen und bei -80 ° C bis zum Zeitpunkt der Luciferase-Assay (Abschnitt 5).
      Anmerkung: Lagerung von Proben bei 4 ° C bis zu 72 Stunden vor der enzymatischen Assay weist minimal Wirkung auf Lumineszenz (5A). Bis zu 3 Gefrier-Tau-Zyklen von Plasmaproben keine Wirkung auf die Lumineszenz (5B).
7. Thapsigargin Verwaltung (Positivkontrolle):
   1. Vorbereitung Thapsigargin durch Verdünnung in Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 2,5 mg / ml. Injizieren Thapsigargin bei 1 mg / kg ip in den Unterleib.
      Hinweis: Thapsigargin erhöht Thrombin-induzierte Blutplättchengerinnungs ^{17 und} kann die Blutentnahme aus Schwanz erschweren.
8. Gaussia-Luciferase-Assay:
   1. Tauen die Plasmaproben auf Eis.
      Hinweis: Für die Längsschnittstudien, Tauwetter und führen Lumineszenz-Assay für alle Zeitpunkt Proben am selben Tag (mit Einzel Herstellung von Substrat).
   2. Transfer 10 ul Plasma zu einem opaken Wandplatte und messen Enzymaktivität, wie in Abschnitt 5. Führen Sie 3-4 technischen Wiederholungen jeder Plasmaprobe beschrieben.
9. Euthanasiein
   Anmerkung: Der Vorteil SERCaMP Technologie ist die Fähigkeit zur Überwachung ER Calcium longitudinal. Je nach Versuchsparameter und Endpoint-Analysen, sind Tiere, die von Maßnahmen zur Endpunktanalysen angebracht und im Einklang mit den institutionellen ACUC Richtlinien eingeschläfert werden.

5. Lumineszenzassay

1. Vorbereitung Coelenterazin (CTZ) Stammlösungen durch Verdünnen der Verbindung in angesäuertem Methanol (30 ul 10 N HCl auf 3 ml Methanol), 20 mM. Bereiten Sie den einmaligen Gebrauch und Aliquots bei -80 ° C.
2. Herstellung der Arbeits Substrat am Tag des Assays.
   1. Für in-vitro-Tests, zu verdünnen Coelenterazin bis 8 um in PBS, zB fügen 10 ul 20 mM CTZ Lager zu 25 ml PBS (6A, B).
   2. Zur in vivo-Assays, verdünnter Coelenterazin bis 100 & mgr; M in PBS, 500 mM Ascorbinsäure, 5 mM NaCl.
3. Inkubieren bereit CTZ für mindestens 30 minbei Raumtemperatur vor dem Test.
   Anmerkung: Dieser Schritt wird häufig in Gaussia-Luciferase-Assays enthalten, da es Berichte über raschen Zerfall Substrat während ersten 30 min nach der Herstellung. Wir haben diesen Effekt nicht in unserem System (6C) beobachtet; jedoch sind wir oft die Inkubationsschritt, da haben wir keine negativen Auswirkungen auf den Test gefunden.
4. Verwenden Sie ein Plattenlesegerät, das in der Lage Überwachung Biolumineszenz und mit einem Substrat Injektor ausgestattet ist. Prime die Linien mit dem Substrat.
   Hinweis: Das Ausgangssubstrat durch die Leitungen können anfällig für Abbau sein. Künstlich niedrige Werte für die frühe Proben zu vermeiden, zu injizieren 20-30 leere Brunnen (Laden eines leeren Teller auf dem Lesegerät) vor der Messung experimentellen Proben.
5. Injizieren Sie 100 ul Substrat in gut schütteln mittlerer Geschwindigkeit für 5 Sekunden, und messen die Lichtemission. Für die Biotek Synergy II-Plattenlesegerät, integriert Lichtemission über 0,5 s (in vitro Proben) und 5 sec (invivo Proben) für den Leseschritt. Optimierungs-Plattenleseparameter für optimale Testleistung.
   Hinweis: Gaussia-Luciferase Exponate Flash-Kinetik mit schneller Signalabfall (im Vergleich zu mit anderen Luciferasen beobachteten Kinetik leuchten). Die Flash-Kinetik Gluc durch Serum in Zellkulturmedium (7A) beeinflusst, Hervorhebung der Bedeutung der Kontrolle für den Mittelzusammensetzung in Proben. Aufgrund des schnellen Zerfalls der Lumineszenz nach Zugabe von Substrat (Flash-Kinetik), der Zeit zwischen spritzen und lesen müssen bei allen Proben gleichförmig sein. Das Plattenlesegerät sollte so eingestellt sein Substrat auf eine gut zu injizieren, warten Sie eine feste Zeit (zum Beispiel verwenden wir eine 5 sec schütteln Schritt), und lesen, dass auch. Hinzufügen Substrat auf eine gesamte Platte, bevor Lesung stellt eine erhebliche Herausforderung, wenn Substrat in alle Vertiefungen gleichzeitig zugegeben werden. Wenn ein Einspritzer nicht verfügbar ist, kann das Problem teilweise durch Inkubation der Platte für 10 Minuten zwischen Substrat ADDI umgangention und Messung (wodurch die steilen Teil der Zerfallskurve) (7B).
6. Wiederholen Sie die Injektion, die Wartezeit, und lesen Sie Schritte für jede Vertiefung auf der Platte.

Ergebnisse

Die Gluc-SERCaMP Methode ermöglicht die Beurteilung ER Calcium-Homöostase durch Abtasten extrazellulären Flüssigkeiten. Mehrere Steuerungen können in der Versuchsplanung einbezogen werden, um die Interpretation der Ergebnisse zu verbessern. Erstens kann die Verwendung eines konstitutiv sezerniertes Reporter (zB Gluc ohne die C-terminale ASARTDL oder "Gluc-No tag") eingesetzt werden, um die Auswirkungen der experimentellen Behandlungen auf den sekretorischen Weg (global zellulären Sekretion) und ...

Diskussion

Dieses Protokoll hebt die in vitro und in vivo Nützlichkeit Gluc-SERCaMP Erschöpfung der ER Calcium zu überwachen. Obwohl die Proteinmodifikation, um SERCaMP erzeugen scheint auf andere Reporter-Proteine ^​​12 verallgemeinern, wählten wir Gaussia-Luciferase für seine robusten (200-1000-fach größer) Biolumineszenz im Vergleich zu anderen Luciferasen ^18. Wir zeigen, nachweisbar Thapsigargin-induzierte Gluc-SERCaMP Mitteilung über einen 100-fachen Dosisbereich von Gluc-SER...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml tubes	Fisher	02-682-550
10% NP-40 solution	Pierce	28324	for intracellular GLuc assays
1 ml luer-lok syringes	Fisher	14-823-30
200 microliter filter tips	Rainin	RT-L200F
3-0 surgical sutures	Fisher	NC9598192
30 G needles	Fisher Scientific	14-821-13A
Adhesive microplate sealing sheets	Thermo	AB-0558
Alcohol prep pads	Fisher	22-246-073
Anesthesia Auto Flow System	E-Z Anesthesia	EZ-AF9000
Animal recovery chamber	Lyon Vet	ICU-912-004
B27 supplement	Life Technologies	17504-044
Betadine solution	Fisher	NC9386574
Bleach	Clorox	n/a
Bovine growth serum	Thermo	SH30541.03
Coelenterazine, Native	Regis Technologies	1-361204-200
Cotton tipped applicators	Puritan	806-WC
Cutting needles 3/8 circle sutures	WPI	501803
Digital ultrasconic cleaner	Fisher Scientific	FS60D
DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvate	Life Technologies	10569-010
DNA mass ladder	Life Technologies	10496-016
Gaussia luciferase (recombinant protein)	Nanolight	321-100
Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC)	New England Biolabs	E8023S	1:2,000 (WB)
Germinator 500	CellPoint Scientific	DS-401
Gluc assay plates (96 well, opaque)	Fisher	07-200-589
Hank's balanced salt solution	Life Technologies	14175-095
Heparin	Allmedtech	63323-276-02
Isoflurane	Butler Schein	29404
Ketamine	Henry Schein	995-2949
Kwik Stop Styptic powder	Butler Schein	5867
L-glutamine	Sigma	G8540
Methanol	Fisher	a452-4
Microfuge 22R Centrifuge	Bekman Colter	368831
Neosporin	Fisher	19-898-143
Neurobasal medium	Life Technologies	21103049
Nikon Stereoscope	Nikon	SMZ745T
Nucleospin Gel and PCR Cleanup	Machery-Nagel	740609
P200 pipet	Rainin	L-200XLS+
p24 Lenti-X rapid titer kit	Clontech	632200
PCR film seal	Fisher	AB0558
Penicillin/streptomycin	Life Technologies	15140-122
Protease inhibitor cocktail	Sigma	P8340
ReFresh Charcoal Filter canister	E-Z Anesthesia	EZ-258
Scalpel blades, #10	Fine Science tools Inc	10010-00
SD rats 150-200 g	Charles River	Rats	rats ordered at 150-200 g.  Surgery 5 days after arrival
Small animal ear tags	National Band and Tag co	1005-1
Sterile surgical drapes	Braintree Scientific	SP-MPS
Synergy 2 plate reader	BioTek	n/a
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems	4304437
Thapsigargin	Sigma	T9033	harmful to human health
Virapower lentiviral packaging mix	Life Technologies	K4975-00
Xfect Transfection reagent	Clontech	631318
Xylazine	Valley Vet	468RX