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Resumen

β-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of β-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.

Resumen

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, α-helical and β-barrel. While α-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, β-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite β-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target β-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.

Introducción

β-barril OMPs sólo pueden encontrarse en las membranas externas de las mitocondrias, cloroplastos, y las bacterias Gram-negativas 1-3. Mientras que sirven funciones similares como las proteínas alfa-helicoidal, tienen un pliegue muy diferente que consiste en un dominio de β-barril membrana embebido en el centro que van desde 8-26 ß-hebras antiparalelas con cada filamento está íntimamente conectada a las dos hebras vecinas (Figuras 1 y 2). Los primeros y últimos hilos de dominio β-barril entonces interactúan uno con el otro, casi exclusivamente de una manera anti-paralelo (a excepción de VDAC mitocondrial), para cerrar y sellar el dominio β-barril de la membrana circundante. Todas las OMPs β-barril tienen bucles extracelulares de diferente secuencia y longitud que desempeñan un papel importante en las interacciones de ligando y / o contactos proteína-proteína, con estos bucles a veces ser tan grande como 75 residuos, tales como los encontrados en Neisseria transferrina de unión proUna proteína (TbpA) 4. β-barril OMPs también pueden tener extensiones periplásmicas N-terminales o C-terminales que sirven como dominios adicionales para el propósito funcional de la proteína (por ejemplo, BAMA 5-7, FimD 8,9, Fadl 10). Aunque existen muchos tipos de OMPs β-barril 11, dos de los tipos más comunes se describen a continuación como ejemplos para aquellos menos familiarizados con el campo, (1) los transportadores de TonB dependiente y (2) autotransporters.

Transportadores TonB dependientes (por ejemplo, FEPA, TbpA, BTub, Cir, etc.) son esenciales para la importación de nutrientes y contienen un dominio de enchufe N-terminal que consta de ~ 150 residuos que se encuentra escondido en el interior de un C-terminal de 22 varados-β- barril dominio incrustado en la membrana externa 12 (Figura 3). Mientras que este dominio tapón impide sustrato de pasar libremente a través del dominio de barril, la unión del sustrato induce un cambio conformacional en el dominio de enchufe THpor lo conduce a la formación de poros (ya sea por el enchufe o el reordenamiento por la expulsión parcial / completo del tapón) que luego pueden facilitar el transporte de sustrato a través de la membrana externa en el periplasma. Transportadores de TonB dependientes son especialmente importantes para la supervivencia de algunas cepas patógenas de bacterias Gram-negativas tales como Neisseria meningitidis que se han desarrollado transportadores especializados que secuestran nutrientes como el hierro directamente de proteínas del huésped humanos 4,13,14.

Autotransporters pertenecen al sistema de secreción de tipo V de las bacterias Gram-negativas y son OMP ß-barril que constan de un dominio β-barril (típicamente 12-capítulos como con ESTA y PSA) y un dominio de pasajeros que se secreta o presentados en el superficie de la célula 15,16 (Figura 3). Estas OMPs β-barril sirven a menudo un papel importante en la supervivencia celular y la virulencia con el dominio pasajero servir ya sea como una proteasa, adhesina, y / u otro effector que media la patogénesis.

métodos estructurales, tales como la cristalografía de rayos X, espectroscopia de RMN, y microscopía electrónica (EM) nos permiten determinar los modelos de las OMP en resolución atómica que puede a su vez ser utilizados para descifrar exactamente cómo funcionan dentro de la membrana externa. Esta valiosa información puede entonces ser utilizada para el desarrollo de medicamentos y vacunas, si procede. Por ejemplo, de unión a transferrina de proteína A (TbpA) se encuentra en la superficie de Neisseria y no se requiere para la patogénesis ya que se une directamente transferrina humana y, a continuación extrae e importa el hierro para su propia supervivencia. Sin TbpA, Neisseria no puede secuestrar el hierro del huésped humano y se convierten en no patógenas. Después de la estructura cristalina de la transferrina humana unido a TbpA 4 se resolvió, se hizo mucho más claro cómo asocian las dos proteínas, lo que las regiones de TbpA mediada la interacción, lo que los residuos son importantes para la extracción de hierro por TbpA, ycómo se podría desarrollar terapias contra Neisseria dirigidos TbpA. Por lo tanto, dada la importancia de OMPs β-barril en bacterias Gram-negativas para la supervivencia y la patogénesis, así como en las mitocondrias y la función del cloroplasto, y la necesidad de información estructural adicional sobre esta única clase de proteínas de membrana y los sistemas en los que funcionan , protocolos generales se presentan con el objetivo general de expresar y purificar OMP objetivo en niveles altos para la caracterización por métodos estructurales.

Protocolo

1. Clonación y expresión

Nota: Para habilitar los estudios estructurales, cantidades suficientes de proteína altamente purificada se deben preparar, y esto por lo general comienza con la clonación y sobreexpresión de la proteína de membrana externa de destino β-barril (OMP) en E. coli (Figura 4). Hasta la fecha, todas las estructuras de OMP β-barril, incluidas las estructuras de VDAC mitocondrial, se han derivado de la proteína expresada en bacterias 11. Aquí, los protocolos generales se presentan para la clonación y expresión de OMPs β-barril para (1) la expresión nativo directamente en las membranas bacterianas y (2) expresión en cuerpos de inclusiones para el replegamiento in vitro 17.

  1. El diseño de una construcción de expresión
    1. Obtener o comprar el gen OMP objetivo de codones optimizados.
    2. Compra o obtener un vector de expresión T7 (i) que contiene una secuencia señal de localización periplásmica, una etiqueta 6x-histidina N-terminal,y un sitio de proteasa TEV 4,18,19 para la expresión in vivo a la membrana o (ii) sin una secuencia señal de localización periplásmica para la expresión de los cuerpos de inclusión para el replegamiento in vitro.
      Nota: una proteasa N-terminal escindible etiqueta 6x o 10x-histidina proporcionaría un método fácil para la purificación. Al igual que con las proteínas solubles, variar la elección de la etiqueta de afinidad (histidina, Strep, GST, etc.), la posición de la etiqueta de afinidad, y la inclusión de un sitio de proteasa (TEV, enteroquinasa, trombina, etc.) para la eliminación de la etiqueta posterior .
    3. Amplificar por PCR la secuencia diana con los cebadores y subclón apropiados en el vector de expresión. Utilice la ligadura de la clonación independiente (LIC) 20,21 o convencionales técnicas de clonación (restricción enzimas / ligadura) para la subclonación. Sin embargo, LIC puede facilitar de alto rendimiento, lo que permite un gran número de diversos constructos (truncamientos, variedad de etiquetas, variedad de promotores) para ser clonado en paralelo másfácilmente.
  2. En Expresión-dirigida de membrana Vivo
    1. Usa análisis de secuenciación para verificar la diana β-barril OMP se clona aguas abajo y en marco con una secuencia señal (es decir, pelB, OmpA) en la construcción de expresión.
      Nota: La secuencia señal dirige la cadena naciente a la translocon Sec para la secreción al periplasma y posterior montaje en la membrana externa.
    2. Transformar la construcción en una cepa de expresión de bacterias para la expresión pipeteando 1.0 l de plásmido en 50 l de BL21 (DE3) células químicamente competentes y mezclar suavemente pipeteando arriba y abajo. Incubar en hielo durante 30 min.
    3. pulso de calor a 42 ° C durante 30 segundos usando un baño de agua y luego se coloca de nuevo en hielo durante 1 min.
    4. Añadir 1 ml de medio SOC precalentado y agitar a 37 ºC durante 1 hora a 1.000 rpm usando un agitador incubador de sobremesa.
    5. Plate 100 l de células en placas de agar LB que contiene un antibiot apropiadoic e incubar durante la noche a 37 ° C invertida.
    6. Realizar pruebas de expresión a pequeña escala mediante la inoculación de un cultivo + antibiótico 5 ml de LB con una sola colonia. Repita durante 5-10 colonias.
      Nota: Debido a la toxicidad potencial de una OMP β-barril y la dependencia de los niveles de expresión basales, a veces se observa la variabilidad de la colonia a colonia. Por lo tanto, la detección de múltiples colonias se recomienda para cada construcción se está probando. Para las pruebas a pequeña escala, en lugar de expresión convencionales 5 ml de cultivos en crecimiento, 25 ml de cultivos en 125 ml de matraces Erlenmeyer se sugiere. Estas condiciones a menudo reflejan mejor lo que sucederá en un crecimiento a gran escala. Además, es una buena idea también la pantalla diversos tipos de medios de cultivo (TB, LB, 2xYT, M9, etc.), ya que se han reportado diferentes niveles de éxito en función de la proteína diana.
      1. Crecer a 37 ° C con agitación hasta una DO600 de 0,6 ~.
      2. Inducir la expresión de la OMP de destino por el anuncianteding 5 l de 1 M isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a cada tubo de cultivo y se deja crecer un 1-2 hr adicional.
      3. Comparación de niveles de expresión de todas las colonias mediante la centrifugación de 1 ml de cada cultivo (OD 600 de ~ 0,6) durante 1 min a 15.000 xg utilizando una microcentrífuga.
      4. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 200 l de tampón de carga 1x SDS-PAGE. Se calienta a 100 ºC durante 5 min y después se centrífuga de nuevo a 15.000 xg durante 5 min.
      5. Analizar las muestras utilizando SDS-PAGE pipeteando 20 l en cada pocillo de un gel de 10%. Dejar correr el gel durante 35 minutos a 200 V. constante
        Nota: Sería beneficioso en este punto para ser capaz de determinar si la proteína objetivo se está correctamente plegada o no. A menudo, esto se puede lograr haciendo purificaciones pequeña escala o ensayando la modificabilidad de calor.
    7. Seleccione la colonia que muestra la mejor expresión y llevar a cabo la expresión a gran escala usando 12-24 l de medio.
      Nota: Los métodos convencionales suelen crecer los cultivos a 37 ° C con agitación hasta una DO600 de 0,6 ~ y luego inducen con un inductor apropiado (es decir, 0,1-1 mM de IPTG o ~ 0,2% de arabinosa) para un 2-4 horas adicionales . Si se desea, antes de la inducción, reducir la temperatura hasta un mínimo de 20 ° C y extender el tiempo de inducción.
      1. Para el método de filtraciones expresión, crecen a 25 ml de cultivo a 37 inoculan ° C en medio LB que contiene el antibiótico apropiado (s) hasta que OD 600 llega a ~ 0,6. A continuación, añadir 1 ml de inóculo a doce frascos de 1 l de medio TB más antibiótico (s) y crecer a 20 ° C hasta la saturación (~ 3 días).
    8. Recoger las células por centrifugación a 6000 xg durante 10 min.
    9. Continúe con el paso de purificación Sección 2.1 o congelar el sedimento de células en nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo a -80 ºC.
  3. Expresión de Cuerpos de Inclusión para In Vitro Refoltimbre
    1. Utilizar el análisis de secuenciación para verificar la construcción de expresión no contiene una secuencia señal. La ausencia de una secuencia señal dirigirá la proteína diana a acumularse en el citosol como cuerpos de inclusión.
    2. Transformar la construcción de expresión en una cepa de expresión de bacterias para la expresión. Para la expresión de cuerpos de inclusión, lo mejor es controlar la expresión por inducción (es decir, IPTG, arabinosa, etc.) para minimizar los posibles efectos de toxicidad.
    3. Placa de 100 l de células transformadas sobre las placas de agar LB que contenían un antibiótico apropiado e incubar durante la noche a 37 ° C invertida.
    4. Realizar pruebas de expresión a pequeña escala mediante la inoculación de un cultivo + antibiótico 5 ml de LB con una sola colonia.
    5. 1.3.4 repita el paso para 2-4 colonias adicionales.
    6. Crecer a 37 ° C con agitación hasta una DO600 de 0,6 ~.
    7. Inducir con un inductor apropiado durante 1-2 horas.
    8. Comparación de los niveles de expresión para todo tque las colonias mediante análisis mediante SDS-PAGE (véase el paso 1.2.6). Seleccione la colonia que muestra la mejor expresión y llevar a cabo la expresión a gran escala usando 12-24 l de medio.
      1. Cultivar las células a 37 ° C hasta una DO600 de 0,6-0,8 e inducir a 37 ° C durante 3-5 horas. Mientras que la expresión de los cuerpos de inclusión es más robusto que otros tipos de expresión, como con todos los experimentos de expresión de proteínas, la expresión se puede mejorar mediante la variación de medio de crecimiento, el tiempo de inducción, la temperatura de inducción, y la concentración del agente inductor.
    9. Recoger las células por centrifugación a 6000 xg durante 10 min.
    10. Continúe con el paso de purificación Sección 2.2 o congelar el sedimento de células en nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo a -80 ºC.

2. purificación

  1. Aislamiento de fracciones de la membrana
    Nota: En contraste con las proteínas solubles, las proteínas integrales de membrana están embebidas en la bicapa lipídica y por lo tantorequieren detergentes para extraerlos para la purificación adicional y el análisis (Figura 5). Después de la expresión, la primera etapa en la purificación de una OMP β-barril es la extracción de la fracción de membrana.
    1. Resuspender las células en tampón de lisis (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 200 mM, 10 mM MgCl 2, 50 mg / ml AEBSF, 5 mg / ml de ADNasa I) en una proporción de 5 ml / g de pasta celular.
    2. Lyse las células por medio de una prensa francesa u homogeneizador celular. Girar las células lisadas a 15.000 xg durante 30 min a 4 ºC para eliminar las células no lisadas y restos de células.
    3. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y se centrifuga de nuevo a alta velocidad (200.000 xg) durante 1 hora a 4 ºC. El sedimento resultante es la fracción de membrana que contiene la proteína de interés.
    4. El uso de un homogeneizador Dounce, resuspender la fracción de membrana, primero la transferencia de las membranas y, a continuación la adición de tampón de solubilización (50 mM KH 2 PO 4 pH 7,5, NaCl 200 mM, imidazol 20 mM, PH 8,0) (50 ml por 20 g de células) a una concentración 2x, sin detergente.
    5. Verter las membranas se resuspendieron en un pequeño vaso de precipitados y añadir detergente (es decir, n-dodecil-β-D-maltósido (DDM), laurildimetilamina-N-óxido (LDAO), n-octil-β-D-glucopiranósido (OG), Triton X-100, etc.) a una concentración final de ~ 10 veces la concentración micelar crítica (CMC).
    6. Rellenar con agua hasta una concentración final de 1 x tampón de solubilización. Se agita durante 0,5 a 16 horas a 4 ºC, dependiendo de la facilidad con se extrae la proteína diana a partir de las membranas.
      Nota: El detergente se utiliza para solubilizar lentamente las membranas para extraer la proteína diana. Hay 3 tipos de detergentes que se pueden utilizar aquí: iónico (SDS, ácido desoxicólico), no iónico (Elugent, TWEEN, Triton X-100, OG, DDM), y de ion híbrido (LDAO, CHAPS). Un complejo de proteína-detergente que es estable y monodispersa durante la etapa de purificación será de gran ayuda en el éxito de crystallizat proteína de membranaion. Más información acerca de los detergentes, sus propiedades, información de CMC, y su uso en la purificación de proteínas de membrana y otras aplicaciones se puede encontrar en los sitios web de proveedores comerciales.
    7. Centrifugar la muestra solubilizada en 300.000 xg durante 1 hora a 4 ºC. El sobrenadante contiene ahora el objetivo OMP β-barril solubilizada con detergente.
    8. Continúe con la Sección 2.3 se describen a continuación.
  2. El replegamiento de cuerpos de inclusión
    Nota: para el replegamiento in vitro, el objetivo β-barril OMP se expresa directamente en cuerpos de inclusión. Una ventaja aquí es que estas proteínas se pueden producir en niveles elevados. Sin embargo, la desventaja es que el replegamiento es a menudo ineficaz y varía de un experimento de replegamiento a la siguiente. Sin embargo, hay muchos ejemplos de proteínas que han sido replegadas con éxito para estudios estructurales. Después de la expresión en cuerpos de inclusión, se debe ahora aislar los cuerpos de inclusión para el replegamiento experimentos.
    1. Resuspender las células en tampón de lisis (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 200 mM, 10 mM MgCl 2, 50 mg / ml de AEBSF, 5 mg / ml de DNasa I, 4 mM 2-mercaptoetanol (BME)) (5 ml por g pasta celular). Lyse utilizando una prensa, ultrasonidos, u homogeneizador celular francés.
    2. Se precipitan los cuerpos de inclusión de un centrifugado a baja velocidad a 6.000 xg durante 10 min a 4 ºC.
    3. Lavar los cuerpos de inclusión resuspendiendo en 25 ml de 1,0 M urea usando un homogeneizador Dounce. Se precipitan de nuevo de un centrifugado a baja velocidad a 6.000 xg durante 10 min a 4 ºC.
    4. Repita el paso 2.2.3, según sea necesario.
    5. Resuspender los cuerpos de inclusión lavados a una concentración final de 10 mg / ml usando tampón que contiene 8,0 M de urea (o 6,0 M de hidrocloruro de guanidinio (GdCl)), además de detergente (es decir, DDM o LDAO) a 2x CMC o superior.
      Nota: Si se desea, para los objetivos de proteínas de membrana que contienen una etiqueta de histidina, la cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC) la purificación puede realizarse usando desnaturalización conditions (en urea 8,0 M o 6,0 M GdCl) como un paso inicial similar a la que se describe a continuación en la Sección 2.3.
    6. Realizar la reacción de replegamiento por lentamente (durante la noche) eliminar el desnaturalizante mediante diálisis en tampón que carece del agente desnaturalizante.
      Nota: Puede tomar varios cambios de tampón de diálisis para lograr esto. Alternativamente, si los cuerpos de inclusión se une primero a una columna de IMAC, uno puede hacer la reacción de replegado mientras que todavía atado a la columna mediante el intercambio de tampones lentamente para eliminar el desnaturalizante. En cualquier caso, hay que recordar que se trata de una proteína de membrana, por lo tanto, el detergente debe estar presente para estabilizar el objetivo. Además, si el detergente que se utiliza es dializable, hay que añadir a la memoria intermedia (s) de diálisis también.
    7. Girar las muestras replegadas a 200.000 xg durante 1 hora a 4 ºC. El sobrenadante contiene la OMP objetivo β-barril solubilizada con detergente replegada.
    8. Continúe con la Sección 2.3 se describen a continuación.
  3. La purificación usando IMAC, intercambio iónico y filtración en gel
    Nota: cromatografía de afinidad con metal Suponiendo que la proteína ha sido diseñado con una etiqueta de histidina, ya sea expresado o replegada de forma nativa utilizando métodos in vitro, a continuación, inmovilizado (IMAC) se lleva a cabo para la purificación al igual que para etiquetadas con histidina proteínas solubles, con la excepción de detergente debe mantenerse en todos los tampones posteriores para mantener la OMP objetivo β-barril solubilizado y estable.
    1. Preparar una columna IMAC 1-5 ml o utilizar una columna preenvasados. Realice los pasos de cromatografía posteriores a 4 ° C. Enjuague con agua para eliminar cualquier rastro de conservantes. Si se utiliza un sistema de purificación automatizada, instalar la columna de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    2. Preparar 500 ml de IMAC Buffer A (50 mM K 2 HPO 4, pH 7,5, NaCl 200 mM, 0,1% de DDM) y 250 ml de IMAC Tampón B (50 mM de K 2 HPO 4, pH 7,5, NaCl 200 mM, 0,1% DDM, y 1,0 M de imidazol).
      Nota: Otros detergentes que pueden ser usados ​​iNCLUDE cimal-6 (0,05%), Triton X-100 (0,03%), y LDAO (0,05%).
    3. Equilibrar la columna de IMAC utilizando 10 volúmenes de columna de tampón A. IMAC
    4. Añadir imidazol a la muestra de proteína a una concentración final de 25 mM y mezclar. Cargar la muestra en la columna de IMAC equilibrada a 2 ml / min. Recoger el flujo a través.
    5. Lavar la columna de IMAC con 5 volúmenes de columna cada uno de concentraciones crecientes de imidazol usando tampón B (es decir, 25 mM, 50 mM, 100 mM). Recoge los lavados en fracciones de 2 ml.
    6. Eluir la muestra con una concentración final de 250 mM para 5 volúmenes de columna. Recoger la muestra eluida en fracciones de 2 ml.
    7. Analizar el flujo a través de, las fracciones de lavado y las fracciones de elución mediante el análisis de SDS-PAGE (véase el paso 1.2.6) en función de su absorbancia a 280 nm. Se combinan las fracciones que contienen el OMP objetivo β-barril que se han verificado mediante análisis de SDS-PAGE.
    8. Retire la etiqueta 6x-histidina mediante la adición de la proteasa TEV a la muestra colectiva (de acuerdocon el protocolo del fabricante) e incubando durante la noche a 4 ° C con agitación suave.
    9. Cargar la solución de muestra / de la proteasa en una columna de IMAC de nuevo para separar el objetivo OMP β-barril (flujo a través) de las etiquetas escindidas y cualquier muestra no escindido. El flujo a través contendrá la muestra escindida que carecen de la etiqueta.
      Nota: Esto también eliminaría cualquier proteasa como TEV-Su, que también tiene un no escindible etiqueta 6x-histidina en sí. De lo contrario, serán necesarios otros métodos para eliminar la proteasa después de la digestión.
    10. Opcionalmente, realizar cromatografía de intercambio iónico para purificar aún más la muestra. Siga las instrucciones del fabricante para la columna que se utilizará, asegurándose de incluir el detergente en todos los tampones.
    11. Para prepararse para la cristalización, cargar la muestra en una columna de filtración en gel en un tampón que contiene el detergente para ser utilizado para la cristalización, tales como 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 200 mM, 1% OG.
    12. Recoger fracciones de 1 ml y analizar USIEl análisis ng SDS-PAGE (véase Paso 1.2.6) en función de su absorbancia a 280 nm. fracciones piscina con absorbancias a 280 nm, ya que contienen la proteína diana. Se concentra hasta ~ 10 mg / ml.
      Nota: Si se desea, el plegamiento adecuado puede evaluarse utilizando un ensayo de capacidad de modificación de calor como se indica a continuación.
  4. Ensayo de calor modificabilidad
    Nota: Un método para controlar el plegamiento correcto de la β-barril purificado OMP es llevar a cabo ensayos de modificabilidad de calor utilizando un semi-nativo SDS-PAGE 22. A continuación, las muestras no calentadas que se pliegan correctamente típicamente migrar de forma diferente de los que se desnaturalizan calor. Esta propiedad es única para ß-barril OMP y ampliamente utilizado para estudiar esta familia de proteínas de membrana.
    1. Antes de la preparación de muestras, montar el aparato de gel. Para empezar, coloque el depósito de inercia en un cubo de hielo y rodear completamente con hielo. Inserte un reparto en la empresa o en gel con gradiente nativa comercial en el soporte y colocar en el tanque. llenar tél tanque completamente con 1x frío MES Operando Buffer (50 mM 2- [N-morfolino] etanosulfónico, Tris base 50 mM, EDTA 1 mM, 0,1% de SDS, pH 7,3).
    2. Pipetear 0,25 l de la muestra (10 mg / ml) en dos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Etiquetar uno como "hervido" y el otro como "RT".
    3. Añadir 9,75 l de tampón de muestra a cada uno y mezclar con la pipeta. Para ambas muestras, añadir 10 l de tampón 2x ​​SDS de carga (100 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 0,2% de azul de bromofenol, y 20% de glicerol) y se mezcla suavemente por pipeteado.
    4. Hervir la muestra 'cocido' a 95 ° C durante 5 minutos, dejando la muestra 'RT' a TA. Girar la muestra brevemente 'cocido'.
    5. Carga de 20 l de las dos muestras en el gel nativo premontado. Correr durante 60 minutos a 150 V. constante Quitar el gel y de inmersión en solución de tinción para visualizar los resultados.

3. La cristalización

Nota: Para la cristalización de ambosdianas proteicas solubles y de membrana, es el protocolo estándar para maximizar la pureza de la muestra y la estabilidad (es decir, mejor detergentes, ligandos, cofactores, etc.). La metodología actual para la cristalización de proteínas diana de membrana, en general, abarca tres enfoques principales que satisfagan los requisitos anfifílicas de proteínas bicapa embebido en: (1) de detergente, (2) bicelle, y (3) la fase cúbica lipídica (LCP) (Figura 6) 23. Se recomienda el uso de un robot de nanolitros cristalización cuando sea posible con el fin de aumentar el número de condiciones que pueden ser seleccionados para un volumen de muestra dado, así como, utilizando los avances recientes en herramientas destinadas a ayudar a determinación de la estructura (Figura 7).

  1. Cristalización utilizando Detergentes
    1. Obtener una muestra de proteína solubilizada de detergente que está en ~ 10 mg / ml de concentración. Opcionalmente, añadir el aditivo 1,2,3-heptanotriol directamente a la muestra a una concentración final de 3% para reducir DetergTamaño de micelas ent.
    2. Se filtra la muestra usando un filtro centrífugo 0,22 micras para eliminar las partículas y la precipitación.
    3. El uso de un robot de cristalización, lleve a cabo la cristalización amplia matriz de cribado utilizando comercialmente disponibles pantallas de 96 pocillos, ya sea colgando o método de vaporización gota sentada con gotas compuestas de ~ 200 muestra de proteína nl y tampón de cristalización nl ~ 200.
    4. Se incuban las placas de cristalización a ~ 21 ° C. Inspeccionar las placas semanales para el crecimiento de cristales usando un microscopio estereoscópico.
    5. Optimizar cables de cristalización mediante la variación de los componentes de la condición de cristalización de una manera sistemática (aumento / disminución de sal o concentraciones precipitantes, pH del tampón, temperatura de incubación, y la concentración / o proteína).
  2. El uso de la cristalización bicelas
    Nota: Una demostración más detallada de las técnicas bicelle ha sido previamente descrito por Ujwal y Abramson 24.
    1. Preparar o comprar un 3Mezcla bicelle 5% que consta de DMPC: CHAPSO en una proporción de 2,8: 1 de acuerdo con los protocolos publicados 25. Otras concentraciones también se pueden ensayar, así como, otros lípidos y detergentes, según sea necesario.
    2. Obtener una muestra de proteína solubilizada de detergente que está en ~ 10 mg / ml de concentración.
    3. Añadir la mezcla de bicelle, en hielo, en una proporción de partida de 4: 1 v / v (proteína: bicelle) (por ejemplo, añadir 10 l de mezcla bicelle a 40 l de proteína y mezclar rápidamente mediante pipeteo).
    4. Incubar en hielo 30-60 min.
      Nota: La proteína: bicelle solución debe permanecer mayormente despejado, pero a menudo puede girar ligeramente opaca. Sin embargo, si la proteína: bicelle solución se vuelve lechoso, indicando la precipitación blanco, a continuación, otras variables deben ser ensayados (es decir, detergente, tampón, etc.). Para las nuevas muestras, haciendo pruebas a pequeña escala (proteína de 8 l y 2 bicelas l) se recomienda para verificar la estabilidad antes de la ampliación de la muestra para evitar la pérdida innecesaria.
    5. El uso de un robot de cristalización, lleve a cabo la cristalización amplia matriz de cribado utilizando comercialmente disponibles pantallas de 96 pocillos, ya sea colgando o método de vaporización gota sentada con gotas compuestas de ~ 200 muestra de proteína nl y tampón de cristalización nl ~ 200.
    6. Se incuban las placas de cristalización a ~ 21 ° C. Inspeccionar las placas semanales para el crecimiento de cristales usando un microscopio estereoscópico.
    7. Optimizar cables de cristalización mediante la variación de los componentes de la condición de cristalización de una manera sistemática (aumento / disminución de sal o concentraciones precipitantes, pH del tampón, temperatura de incubación, y la concentración / o proteína).
  3. El uso de la cristalización fase cúbica lipídico (LCP)
    Nota: Una demostración más detallada de las técnicas de LCP ha sido previamente descrito por Liu y Cherezov 26,27.
    1. Obtener una muestra de proteína solubilizada de detergente que está en ~ 20 mg / ml de concentración.
    2. Pre-caliente el monooleına a ~ 40 ºC. Carga60 l monooleína en una jeringa de 100 l hermética a los gases y 40 l muestra de proteína en otra.
    3. El uso de un acoplador de mezcla, conectar las jeringas, teniendo cuidado de no introducir aire.
    4. Mezclar con cuidado mediante la aplicación de presión alternada sobre los émbolos de la jeringa empujando la mezcla de una jeringa a la otra por completo hasta que la muestra se vuelve traslúcido y homogénea.
    5. El uso de un robot diseñado para la cristalización métodos LCP, lleve a cabo la cristalización amplia matriz de cribado utilizando pantallas disponibles en el mercado, así 96 con placas de cristalización de tipo sándwich (0,1 mm de espesor) y con gotas compuestas por 100 muestra de proteína nl y 750 nl tampón de cristalización.
      Nota: ratios de gota se pueden ajustar si es necesario. Además, se recomiendan cubiertas sólidas (es decir, de vidrio o plástico de espesor) que soportan las gotas muy bien en lugar de películas finas, que tienden a permitir que las gotas se mueven sobre la así como las placas se manejan.
    6. Incubar la cristalización plates a ~ 21 ° C. Inspeccionar las placas semanales para el crecimiento de cristales usando un microscopio estereoscópico.
    7. Optimizar cables de cristalización mediante la variación de los componentes de la condición de cristalización de una manera sistemática (aumento / disminución de sal o concentraciones precipitantes, pH del tampón, temperatura de incubación, y la concentración / o proteína).

Resultados

Yiur es un dependiente transportador de hierro TonB que es un objetivo de la vacuna contra la supuesta Yersinia pestis. Originalmente fue identificado usando un ensayo de microarrays. Aquí, los pasos que se tomaron para determinar la estructura de yiur utilizando cristalografía de rayos X se describen (Figura 9). Para la clonación, la secuencia de ADN de yiur (menos la secuencia señal N-terminal) se amplificó por PCR a partir de ADN genómico y se subclonó...

Discusión

β-barril OMP cumplen funciones esenciales en bacterias Gram-negativas, mitocondrias y cloroplastos y son objetivos importantes para el análisis estructural que ofrecen una gran cantidad de información acerca de los mecanismos moleculares esenciales en las membranas externas de estos respectivos orgánulos. Sin embargo, la producción de suficiente muestra para el análisis estructural no siempre es sencillo y por lo tanto, una tubería en general se presenta para la producción de cantidades suficientes de destino OM...

Divulgaciones

The authors declare that they have no competing financial interests.

Agradecimientos

We would like to thank Herve Celia of the CNRS for providing the UV images and Chris Dettmar and Garth Simpson in the Department of Chemistry at Purdue University for providing the SONICC images. We would like to acknowledge funding from the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases and the Intramural Research Program at the National Institutes of Health. Additionally, we would like to acknowledge additional funding from the National Institute of General Medical Sciences (A.M.S. and C.J.), National Institute of Allergy and Infectious Diseases (N.N. 1K22AI113078-01), and the Department of Biological Sciences at Purdue University (N.N.).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Crystallization RobotTTP Labtech, Art Robbins-Any should work here, except for LCP crystallization
PCR thermocyclerEppendorf, BioRad-
Media ShakerNew Brunswick, Infors HT-
UV-vis spectrometerEppendorf-
SDS-PAGE apparatusBioRad1645050, 1658005
SDS-PAGE and native gelsBioRad, Life Technologies4561084, EC6035BOX (BN1002BOX)
AkTA PrimeGE Healthcare-
AkTA PurifierGE Healthcare-
MicrocentrifugeEppendorf-
Centrifuge (low-medium speed)Beckman-Coulter-
Ultracentrifuge (high speed)Beckman-Coulter-
SS34 rotorSorvall-
Type 45 Ti rotorBeckman-Coulter-
Type 70 Ti rotorBeckman-Coulter-
Dounce homogenizerFisher Scientific06 435C
EmulsiflexAvestin-
Dialysis tubingSigmaD9652
LCP toolsHamilton, TTP Labtech-
VDX 24 well platesHampton ResearchHR3-172
Sandwich platesHampton Research, Molecular DimensionsHR3-151, MD11-50 (MD11-53)
Grace Crystallization sheetsGrace Bio-Labs875238
HiPrep S300 HR columnGE Healthcare17-1167-01
Q-Sepharose columnGE Healthcare17-0510-01
Crystallization screensHampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions-
Gas-tight syringe (100 ml)Hamilton 

Referencias

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