A partir de construções de Cristais - Rumo a determinação da estrutura de β-barril exterior Proteínas de Membrana

Resumo

β-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of β-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.

Resumo

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, α-helical and β-barrel. While α-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, β-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite β-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target β-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.

Introdução

β-barrel OMPs só pode ser encontrada nas membranas exteriores das mitocôndrias, cloroplastos, e bactérias Gram-negativas ^1-3. Enquanto que servem funções semelhantes às proteínas a-helicoidal, que tem uma dobra muito diferente que consiste de um domínio β-barril incorporado na membrana central que varia de 8-26 p-cadeias anti-paralelas com cada filamento sendo intimamente ligados aos dois fios vizinhos (Figuras 1 e 2). Os primeiros e os últimos fios de domínio β-barril então interagir um com o outro, quase exclusivamente de uma forma anti-paralela (excepto para VDAC mitocondrial), para fechar e selar o domínio β-barril a partir da membrana circundante. Todas as OMPs β de barril tem ansas extracelulares de variação de sequência e comprimento, que desempenham um papel importante nas interacções de ligandos e / ou contactos proteína-proteína, com estas laçadas por vezes ser tão grande como 75 resíduos, tais como os encontrados em Neisseria transferrina ligação protein A (TbpA) ^4. β-barrel OMPs também pode ter extensões periplásmicas N-terminais ou C-terminais que servem como domínios adicionais para a finalidade funcional da proteína (por exemplo, ^5-7 bama, FimD ^8,9, fadl ^10). Embora muitos tipos de OMPs β-barril existem ^11, dois dos tipos mais comuns são descritas abaixo como exemplos para os menos familiarizados com o campo, (1) os transportadores dependentes de TonB e (2) autotransportadores.

Transportadores TonB-dependentes (por exemplo, FepA, TbpA, BtuB, Cir, etc.) são essenciais para a importação de nutrientes e contêm um domínio plugue N-terminal que consiste em aproximadamente 150 resíduos que é encontrado escondido dentro de um C-terminal 22 de cadeia β- domínio barril incorporado na membrana externa ¹² (Figura 3). Embora este domínio previne tampão substrato de passar livremente através do domínio de barril, a ligação do substrato induz uma mudança conformacional dentro do domínio bujão them leva a poro formação (quer por rearranjo de tampão ou por ejecção parcial / total do tampão), o que pode, em seguida, facilitar o transporte do substrato através da membrana externa para o periplasma. Transportadores dependentes de Tonb são especialmente importantes para a sobrevivência de algumas estirpes patogénicas de bactérias Gram-negativas, tais como Neisseria meningitidis que evoluíram transportadoras especializadas que roubam nutrientes como o ferro diretamente de proteínas do hospedeiro humanos ^4,13,14.

Autotransportadores pertencem ao sistema de secreção V tipo de bactéria Gram-negativas e são OMPs beta-barril, que consistem em um domínio β-barrel (normalmente 12-costas como com ESTA e ESPP) e um domínio de passageiros que é ou secretados ou apresentados no superfície da célula ^15,16 (Figura 3). Estes OMPs β-barril muitas vezes servem um papel importante na sobrevivência celular e virulência com o domínio de passageiros que serve tanto como uma protease, adesina, e / ou outro EFfector que medeia a patogénese.

métodos estruturais, tais como cristalografia de raios-X, espectroscopia de RMN, e microscopia eletrônica (EM) nos permitem determinar modelos para as OMPs com resolução atômica, que por sua vez podem ser usadas para decifrar exatamente como eles funcionam dentro da membrana externa. Esta informação valiosa pode então ser usado para drogas e desenvolvimento de vacinas, se aplicável. Por exemplo, a ligação à transferrina de proteína A (TbpA) é encontrado na superfície de Neisseria e é necessária para a patogénese porque se liga directamente a transferrina humana e, em seguida, extrai e importa o ferro para a sua sobrevivência. Sem TbpA, Neisseria não podem eliminar o ferro do hospedeiro humano e são tornados não-patogênico. Depois de a estrutura cristalina da transferrina humano ligado a TbpA ⁴ foi resolvido, tornou-se muito mais clara a forma como as duas proteínas associadas, que as regiões de TbpA mediada a interacção, o que os resíduos são importantes para a extracção do ferro por TbpA, ecomo se pode desenvolver agentes terapêuticos contra Neisseria segmentação TbpA. Portanto, dada a importância de OMPs β-barril em bactérias Gram-negativas para a sobrevivência e patogénese, bem como nas mitocôndrias e função do cloroplasto, e a necessidade de informação estrutural adicional sobre esta classe única de proteínas de membrana e os sistemas nos quais eles funcionam , protocolos gerais são apresentados com o objetivo geral de expressar e purificar OMPs alvo em níveis elevados para a caracterização por métodos estruturais.

Protocolo

1. Clonagem e Expressão

Nota: Para permitir estudos estruturais, quantidades suficientes de proteína altamente purificada deve ser preparado, e esta é geralmente iniciado com a clonagem e a sobreexpressão da proteína alvo β-barril da membrana externa (OMP) em E. coli (Figura 4). Até à data, todas as estruturas OMP β-barril, incluindo as estruturas de VDAC mitocondrial, foram derivados de proteína expressa em bactérias ^11. Aqui, protocolos gerais são apresentados para clonagem e expressão de OMPs β-barril para (1) a expressão nativa directamente nas membranas bacterianas e (2) expressão em corpos de inclusões para redobragem in vitro ^17.

1. Projetar uma construção de expressão
   1. Obter ou comprar o gene alvo OMP códon otimizado.
   2. Aquisição ou obter um vector de expressão de T7 (i) contendo uma sequência de sinal de localização periplasmático, uma etiqueta 6x histidina-N-terminal,e um local de protease de TEV ^4,18,19 para a expressão in vivo para a membrana ou (ii) sem uma sequência de sinal de localização para a expressão periplasmática de corpos de inclusão para redobragem in vitro.
      Nota: Uma protease do terminal N clivável etiqueta 6x ou 10x-Histidina iria proporcionar um método fácil para purificação. Tal como acontece com as proteínas solúveis, variar a escolha da marca de afinidade (Histidina, Strep, GST, etc.), a posição da marca de afinidade, e a inclusão de um sítio de protease (TEV, enteroquinase, trombina, etc.) para a remoção subsequente marcação .
   3. Amplificar por PCR a sequência alvo com os iniciadores apropriados e subclone no vector de expressão. Use ligadura clonagem independente (LIC) ^20,21 ou convencionais técnicas de clonagem (enzimas de restrição / ligadura) para subclonagem. No entanto, pode facilitar LIC elevado rendimento, permitindo um grande número de várias construções (truncagens, a variedade de etiquetas, variedade de promotores) para ser clonado em paralelo maisfacilmente.
2. Em Expressão Vivo Membrane-alvo
   1. Use análise de sequenciação para verificar o alvo β-OMP barril é clonado a jusante e na mesma grelha com uma sequência de sinal (isto é, pelB, OmpA) na construção de expressão.
      Nota: A sequência de sinal dirige a cadeia nascente para o translocon SEC para secreção para o periplasma e subsequente montagem na membrana externa.
   2. Transformar a construção em uma cepa de bactérias para a expressão expressão pipetando 1,0 mL de plasmídeo em 50 ul de BL21 (DE3) células quimicamente competentes e misture delicadamente por pipetagem cima e para baixo. Incubar em gelo durante 30 min.
   3. pulso térmico a 42 ° C durante 30 segundos utilizando um banho de água e, em seguida, colocar volta em gelo durante 1 min.
   4. Adicionar 1 ml de meio SOC pré-aquecido e agitar a 37 ºC durante 1 h a 1000 rpm utilizando um agitador de bancada incubadora.
   5. Placa 100 uL de células em placas de agar LB contendo uma Antibiot adequadoic e incubar durante a noite a 37 ºC invertido.
   6. Realizar testes de expressão em pequena escala inoculando a 5 ml LB + cultura antibiótico com uma única colônia. Repita o procedimento para 5-10 colónias.
      Nota: Devido ao potencial toxicidade de uma OMP β-barril ea confiança em níveis de expressão basal, a variabilidade colónia-to-colónia é por vezes observada. Por isso, o rastreio várias colónias é recomendado para cada constructo a ser testado. Para os ensaios em pequena escala, em vez de expressão convencionais, 5 ml de culturas que crescem em culturas de 25 ml de 125 ml com deflectores balões Erlenmeyer é sugerido. Estas condições, muitas vezes refletir melhor o que vai acontecer em um crescimento em grande escala. Além disso, é uma boa ideia para rastrear também vários tipos de meios de cultura (TB, LB, 2xYT, M9, etc), uma vez que níveis variados de sucesso foram relatados em função da proteína alvo.
      1. Crescer a 37 ºC com agitação a uma OD ₆₀₀ de ~ 0,6.
      2. Induzir a expressão do OMP alvo por anúncioDing 5 ul de 1 M de isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a cada tubo de cultura e deixa-se crescer uma 1-2 horas adicionais.
      3. Comparar os níveis de expressão para todos os colónias por centrifugação de 1 ml de cada cultura (OD ₆₀₀ de ~ 0,6) durante 1 min a 15.000 x g usando uma microcentrífuga.
      4. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 200 ul de 1x tampão de carga de SDS-PAGE. Aquece-se a 100 ºC durante 5 min e em seguida centrifugar novamente a 15000 xg durante 5 min.
      5. Analisar as amostras utilizando SDS-PAGE, pipetando 20 mL para cada poço de um gel a 10%. Submeter o gel durante 35 min a 200 V. constante
         Nota: Seria vantajoso, neste ponto, ser capaz de determinar se a proteína alvo está a ser adequadamente ou não dobrada. Isso muitas vezes pode ser realizado fazendo purificações de pequena escala ou através de ensaio para modifiability calor.
   7. Selecione a colônia mostrando a melhor expressão e executa a expressão em larga escala utilizando 12-24 L de meio.
      Nota: Os métodos convencionais tipicamente crescer as culturas a 37 ° C com agitação a uma OD ₆₀₀ de ~ 0,6 e, em seguida, induzir com um indutor adequado (por exemplo, 0,1-1 mM de IPTG ou ~ 0,2% de arabinose) para um 2-4 horas adicionais . Se desejado, antes da indução, reduzir a temperatura para tão baixo como 20 ° C e prolongar o tempo de indução.
      1. Para o método de expressão gotejante, crescer de 25 ml inocular cultura a 37 ° C em meio LB contendo o antibiótico apropriado (s) até _DO600 atinge ~ 0,6. Em seguida, adicionar 1 ml de inóculo de doze frascos de 1 L de meio TB mais antibiótico (s) e crescer a 20 ° C até à saturação (~ 3 dias).
   8. Colher as células por centrifugação a 6000 xg durante 10 min.
   9. Prossiga para a etapa de purificação Seção 2.1 ou congelar o pellet celular em nitrogênio líquido para o armazenamento de longo prazo a -80 ºC.
3. Expressão de Corpos de Inclusão para In Vitro Refolding
   1. Use análise de sequenciação para verificar a construção de expressão não contém uma sequência de sinal. A ausência de uma sequência de sinal irá dirigir a proteína alvo a acumular-se no citosol como corpos de inclusão.
   2. Transformar a construção de expressão numa estirpe de bactérias para expressão de expressão. Para a expressão de corpos de inclusão, que é melhor para controlar a expressão por indução (isto é, IPTG, arabinose, etc), para minimizar os possíveis efeitos de toxicidade.
   3. Placa de 100 ul de células transformadas em placas de agar LB contendo um antibiótico apropriado e incubar durante a noite a 37 ºC invertido.
   4. Realizar testes de expressão em pequena escala inoculando a 5 ml LB + cultura antibiótico com uma única colônia.
   5. 1.3.4 Repita o passo para 2-4 colónias adicionais.
   6. Crescer a 37 ºC com agitação a uma OD ₆₀₀ de ~ 0,6.
   7. Induzir com um indutor apropriado durante 1-2 horas.
   8. Comparar os níveis de expressão para todos tele colónias por análise utilizando SDS-PAGE (veja o Passo 1.2.6). Selecione a colônia mostrando a melhor expressão e executa a expressão em larga escala utilizando 12-24 L de meio.
      1. Crescer as células a 37 ° C para uma DO ₆₀₀ de 0,6-0,8 e induzir a 37 ° C durante 3-5 h. Enquanto a expressão de corpos de inclusão é mais robusta do que outros tipos de expressão, tal como com todas as experiências de expressão da proteína, a expressão pode ser melhorada através da variação meio de crescimento, tempo de indução, temperatura de indução, e a concentração do agente de indução.
   9. Colher as células por centrifugação a 6000 xg durante 10 min.
   10. Prossiga para a etapa de purificação Seção 2.2 ou congelar o pellet celular em nitrogênio líquido para o armazenamento de longo prazo a -80 ºC.

2. purificação

1. Isolamento de fracções de membrana
   Nota: Em contraste com as proteínas solúveis, proteínas de membrana integrais são incorporados na bicamada lipídica e por conseguinterequerem detergentes para extraí-los para posterior purificação e análise (Figura 5). Após expressão, o primeiro passo na purificação de uma OMP β-barril é a extracção da fracção da membrana.
   1. Ressuspender as células em tampão de lise (Tris-HCl a 50, pH 7,4, 200 mM de NaCl, 10 mM de _MgCl2, 50 ug / mL de AEBSF, 5 ug / ml de DNase I) em uma proporção de pasta de células de 5 ml / g.
   2. Lyse as células usando uma prensa francesa ou homogeneizador celular. Rodar as células lisadas a 15000 xg durante 30 min a 4 ° C para remover células não lisadas e os detritos celulares.
   3. Transferir o sobrenadante para um tubo limpo e centrifuga-se de novo a alta velocidade (200000 xg) durante 1 h a 4 ºC. O sedimento resultante é a fracção de membrana que contém a proteína de interesse.
   4. Utilizando um homogeneizador Dounce, ressuspender a fracção de membrana, transferindo primeiro as membranas e depois adicionando tampão de solubilização (50 mM de KH ₂ PO _4, pH 7,5, NaCl 200 mM, imidazol 20 mM, PH 8,0) (50 ml por 20 g de células) a concentração de 2x, sem detergente.
   5. Pour as membranas ressuspensas para uma pequena proveta e adicionar detergente (ou seja, N-dodecil-β-D-maltósido (DDM), lauryldimethylamine-N-óxido (LDAO), N-octil-β-D-glucopiranósido (OG), o Triton X-100, etc.), lentamente, a uma concentração final de ~ 10 vezes a concentração crítica de micelas (CMC).
   6. Encha com água até uma concentração final de 1x tampão de solubilização. Agita-se durante 0,5-16 horas a 4 ° C, dependendo isso da facilidade a proteína alvo é extraído das membranas.
      Nota: O detergente é usado para solubilizar as membranas lentamente para extrair a proteína alvo. Existem 3 tipos de detergentes que podem ser utilizados aqui: iónico (SDS, ácido desoxicólico), não iónicos (Elugent, Tween, Triton X-100, OG, DDM), e zwitteriónico (LDAO, CHAPS). Um complexo de proteína-detergente que é estável e monodispersas durante o passo de purificação será de grande ajuda no sucesso da proteína de membrana crystallizatíon. Mais informações sobre as suas propriedades detergentes, informações, CMC, e a sua utilização na purificação de proteínas de membrana e outras aplicações pode ser encontrada nos sítios fornecedores comerciais.
   7. Centrifugar a amostra solubilizado em 300.000 xg durante 1 hora a 4 ºC. O sobrenadante agora contém o OMP alvo β-barrel detergente solubilizado.
   8. Prossiga com a Seção 2.3, conforme descrito abaixo.
2. O redobramento de Corpos de Inclusão
   Nota: Para a redobragem in vitro, β-barril OMP o alvo é expresso directamente em corpos de inclusão. Uma vantagem aqui é que estas proteínas podem ser produzidas em níveis elevados. No entanto, a desvantagem é que a re-enrolamento é muitas vezes ineficaz e varia a partir de uma experiência de redobragem para o próximo. Ainda assim, existem muitos exemplos de proteínas que foram redobradas com sucesso para estudos estruturais. Após a expressão em corpos de inclusão, deve-se agora isolar os corpos de inclusão para a redobragem experimentos.
   1. Ressuspender as células em tampão de lise (Tris-HCl a 50, pH 7,4, 200 mM de NaCl, 10 mM de _MgCl2, 50 ug / mL de AEBSF, 5 ug / ml de DNase I, 4 mM de 2-mercaptoetanol (BME)) (5 ml por g de pasta celular). Lyse usando uma prensa, ultra-sons, ou homogeneizador celular francês.
   2. Sedimentar os corpos de inclusão por centrifugação a baixa velocidade a 6000 xg durante 10 min a 4 ºC.
   3. Lavar os corpos de inclusão por ressuspensão em 25 ml de ureia 1,0 M, utilizando um homogeneizador Dounce. Sedimentar novamente de uma centrifugação de baixa velocidade a 6000 xg durante 10 min a 4 ºC.
   4. Repita o passo 2.2.3, se necessário.
   5. Ressuspender os corpos de inclusão lavados a uma concentração final de 10 mg / ml usando tampão contendo 8,0 M de ureia (ou 6,0 M de hidrocloreto de guanidinio (GdCl)) mais detergente (ou seja, DCM ou LDAO) em 2x CMC ou superior.
      Nota: Se desejado, para alvos de proteína de membrana contendo uma etiqueta de Histidina, cromatografia de afinidade de metal-imobilizado (IMAC) a purificação pode ser realizada utilizando co desnaturaçãonditions (em 8,0 M de ureia ou 6,0 M GdCl) como um passo inicial semelhante ao descrito abaixo na Seção 2.3.
   6. Realizar a reação redobrando lentamente (durante a noite) remoção do desnaturante por diálise em tampão sem desnaturante.
      Nota: Pode levar várias mudanças do tampão de diálise para alcançar este objetivo. Em alternativa, se os corpos de inclusão são primeiramente ligados a uma coluna de IMAC, pode-se fazer a reacção de re-enrolamento, enquanto ainda ligada à coluna através da troca de tampões lentamente para remover o desnaturante. Em ambos os casos, lembrar que esta é uma proteína de membrana, portanto, o detergente deve estar presente para estabilizar o alvo. Além disso, se o detergente a ser utilizado é dialisável, que deve ser adicionado ao tampão (s) de diálise bem.
   7. Girar as amostras redobradas em 200.000 xg durante 1 hora a 4 ºC. O sobrenadante contém o OMP alvo β-barril detergente solubilizado redobrada.
   8. Prossiga com a Seção 2.3, conforme descrito abaixo.
3. Purificação usando IMAC, Ion-Exchange e Gel Filtration
   Nota: cromatografia de metal-afinidade Assumindo que a proteína tem sido concebido com uma cauda Histidina, quer nativa expressa ou redobradas utilizando métodos in vitro, em seguida imobilizado (IMAC) é realizado para a purificação bem como para marcadas com histidina, proteínas solúveis, com excepção de detergente deve ser mantido em todos os tampões subsequentes para manter o OMP alvo β-barrel solubilizado e estável.
   1. Prepara-se uma coluna de 1-5 ml IMAC ou utilizar uma coluna pré-embalada. Execute as etapas de cromatografia subsequentes a 4 ° C. Lave com água para remover qualquer vestígio de conservantes. Se utilizando um sistema automatizado de purificação, instalar a coluna, de acordo com as instruções do fabricante.
   2. Preparar 500 ml de IMAC tampão A (50 mM de K ₂ HPO _4, pH 7,5, 200 mM de NaCl, 0,1% de DDM) e 250 ml de IMAC tampão B (50 mM de K ₂ HPO _4, pH 7,5, NaCl 200 mM, 0,1% DDM, e imidazol 1,0 M).
      Nota: Outros detergentes que podem ser utilizados include Cymal-6 (0,05%), de Triton X-100 (0,03%), e LDAO (0,05%).
   3. Equilibrar a coluna IMAC usando 10 volumes de tampão de coluna IMAC A.
   4. Adicionar imidazole para a amostra de proteína para uma concentração final de 25 mM e misturar. Carregar a amostra na coluna IMAC equilibrada a 2 ml / min. Recolhe-se o fluxo através de.
   5. Lava-se a coluna IMAC com 5 volumes de coluna cada um de concentrações crescentes de imidazole utilizando tampão B (isto é, 25 mM, 50 mM, 100 mM). Recolher as lavagens em fracções de 2 mL.
   6. Elui-se a amostra com uma concentração final de 250 mM para 5 volumes de coluna. Recolha da amostra eluída em fracções de 2 mL.
   7. Analisar o fluxo através de uma das fracções de lavagem e as fracções de eluição utilizando análise de SDS-PAGE (ver Passo 1.2.6) com base na sua absorvância a 280 nm. Reunir as fracções contendo o OMP alvo β-barril como verificado por análise de SDS-PAGE.
   8. Remover a etiqueta 6x histidina, adicionando-protease TEV a amostra combinada (de acordoo protocolo do fabricante) e incubação durante a noite a 4 ºC com balanço suave.
   9. Coloque a solução de amostra / protease numa coluna de IMAC novamente para separar o alvo OMP β-barrel (fluir através) das marcadores cortados e qualquer amostra clivada. O fluxo através conterá a amostra clivada falta a marca.
      Nota: Isto também iria remover qualquer protease TEV como-His, que também tem em si uma etiqueta 6x histidina-não clivável. Caso contrário, outros métodos que serão necessários para remover a protease, após a digestão.
   10. Opcionalmente, realizar cromatograf ia de permuta iónica para purificar ainda mais a amostra. Siga as instruções do fabricante para a coluna a ser utilizado, tendo a certeza de incluir detergente em todos os tampões.
   11. Para preparar para a cristalização, carregar a amostra numa coluna de filtração em gel em tampão contendo o detergente a ser utilizado para a cristalização, tal como Tris-HCl a 25, pH 7,5, NaCl 200 mM, 1% de OG.
   12. Recolher fracções de 1 ml e analisar usianálise ng SDS-PAGE (veja Passo 1.2.6) com base na sua absorvância a 280 nm. As fracções de associação com absorvências a 280 nm, uma vez que contêm a proteína alvo. Concentra-se para ~ 10 mg / ml.
       Nota: Se se desejar, a dobragem correcta pode ser avaliada utilizando um ensaio a mutabilidade de calor, conforme descrito abaixo.
4. Calor Modificabilidade Assay
   Nota: Um método para monitorar a dobragem correcta da purificada β-barrel OMPs é a realização de ensaios modifiability calor usando um semi-nativa SDS-PAGE ^22. Aqui, as amostras não aquecidas que são dobradas adequadamente irá tipicamente migrar de forma diferente daqueles que são desnaturadas por calor. Esta propriedade é exclusivo para beta-barril OMPs e amplamente utilizado para estudar esta família de proteínas da membrana.
   1. Antes de preparação de amostras, montar o aparelho de gel. Para começar, coloque o tanque de reserva em um balde de gelo e envolver completamente com gelo. Insira um elenco em casa ou em gel com gradiente nativa comercial no suporte e colocar no tanque. Encha tele tanque completamente com 1x frio tampão de corrida MES (50 mM de ácido 2- [N-morfolino] etanossulfónico, Tris base 50 mM, EDTA 1 mM, SDS a 0,1%, pH 7,3).
   2. Pipeta 0,25 ul de amostra (10 mg / ml) para dois tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Rotular um como 'fervido' eo outro como 'RT'.
   3. Adicionar 9,75 mL de tampão de amostra para cada um e misture por pipetagem. Para ambas as amostras, adicionar 10 ul de tampão de carga DSS 2X (Tris-HCl a 100, pH 6,8, 2% SDS, 0,2% de azul de bromofenol e glicerol a 20%) e agitar suavemente por pipetagem.
   4. Ferva a amostra 'fervido' a 95 ºC durante 5 min, deixando a amostra 'RT' à temperatura ambiente. Spin the brevemente sample 'cozido'.
   5. Carga 20 ul de ambas as amostras no gel nativo de pré-montagem. Corra por 60 minutos a constante de 150 V. Retire o gel e mergulhar na solução de coloração para visualizar os resultados.

3. A cristalização

Nota: Para a cristalização de ambosalvos de proteína solúvel e de membrana, é o protocolo padrão para maximizar a pureza da amostra e a estabilidade (isto é, melhor detergente, ligandos, cofactores, etc.). Metodologia atual para cristalizar proteínas alvo de membrana em geral engloba três abordagens principais que satisfazem os requisitos anfifílicas das proteínas embebidas em bicamada: (1) de detergente, (2) bicelle, e (3) fase cúbica lipídica (LCP) (Figura 6) ^23. A utilização de um robô nanolitros cristalização é fortemente recomendada quando possível, a fim de aumentar o número de condições que podem ser rastreadas para um determinado volume de amostra, bem como, utilizando os recentes avanços em ferramentas destinadas a auxiliar a determinação da estrutura (Figura 7).

1. Cristalização usando Detergentes
   1. Obter uma amostra de proteína solubilizada em detergente que é a ~ 10 mg de concentração / ml. Opcionalmente, adicionar o aditivo 1,2,3-heptanotriol directamente à amostra a uma concentração final de 3% para reduzir detergtamanho de micelas ent.
   2. Filtrar a amostra através de um filtro centrífugo de 0,22 um para remover as partículas e precipitação.
   3. Usando um robô cristalização, realizar ampla cristalização matriz de rastreio utilizando comercialmente disponíveis 96 telas assim por qualquer suspensão ou sentado método de vaporização queda com gotas compostas de 200 amostra de proteína nl ~ e ~ 200 tampão de cristalização nl.
   4. Incubar as placas de cristalização a ~ 21 ° C. Inspeccionar as placas semanais para o crescimento de cristal usando um microscópio estereoscópico.
   5. Optimizar ligações de cristalização variando os componentes da condição a cristalização de uma forma sistemática (aumentando / diminuindo sal ou concentrações precipitantes, pH, temperatura de incubação, concentração e / ou proteína).
2. A cristalização Usando bicelles
   Nota: Uma demonstração mais detalhada das técnicas de bicelle foi previamente descrito por Abramson e Ujwal ^24.
   1. Preparar ou comprar um 3Mistura bicelle 5% consistindo de DMPC: CHAPSO em uma proporção de 2,8: 1, de acordo com protocolos publicados ^25. Outras concentrações podem também ser ensaiadas, assim como, outros lípidos e detergentes, como necessário.
   2. Obter uma amostra de proteína solubilizada em detergente que é a ~ 10 mg de concentração / ml.
   3. Adicionar a mistura bicelle, em gelo, a uma proporção inicial de 4: 1 v / v (proteína: bicelle) (por exemplo, adicionar 10 ul de mistura bicelle a 40 uL de proteína e misturar rapidamente por pipetagem).
   4. Incubar em gelo de 30-60 min.
      Nota: A proteína: solução bicelle deve permanecer na sua maioria clara, mas muitas vezes pode virar ligeiramente opaca. No entanto, se a proteína: bicelle solução vira branca leitosa, indicando a precipitação, em seguida, outras variáveis ​​que devem ser ensaiados (isto é, detergentes, tampão, etc.). Para novas amostras, fazendo testes de pequena escala (proteína 8 mL e 2 bicelles ul) é recomendado para verificar a estabilidade antes da ampliação para evitar a perda de amostra desnecessário.
   5. Usando um robô cristalização, realizar ampla cristalização matriz de rastreio utilizando comercialmente disponíveis 96 telas assim por qualquer suspensão ou sentado método de vaporização queda com gotas compostas de 200 amostra de proteína nl ~ e ~ 200 tampão de cristalização nl.
   6. Incubar as placas de cristalização a ~ 21 ° C. Inspeccionar as placas semanais para o crescimento de cristal usando um microscópio estereoscópico.
   7. Optimizar ligações de cristalização variando os componentes da condição a cristalização de uma forma sistemática (aumentando / diminuindo sal ou concentrações precipitantes, pH, temperatura de incubação, concentração e / ou proteína).
3. A cristalização Usando fase cúbica lipídico (LCP)
   Nota: Uma demonstração mais detalhada das técnicas de LCP foi previamente descrito por Liu e Cherezov ^26,27.
   1. Obter uma amostra de proteína solubilizada em detergente que é a ~ 20 mg de concentração / ml.
   2. Pré-aquecer o mono-oleína a ~ 40 ºC. Carga60 ul de monooleína em uma seringa de 100 ul à prova de gás e 40 ul de amostra de proteína para outra.
   3. Usando um acoplador mistura, ligar as seringas, tomando cuidado para não introduzir ar.
   4. Misturar suavemente através da aplicação de pressão alternada sobre os êmbolos das seringas que empurram a mistura a partir de uma seringa para o outro completamente até que a amostra torna-se translúcido e homogénea.
   5. Usando um robô projetado para cristalização métodos LCP, execute ampla cristalização matriz de rastreio utilizando comercialmente disponíveis 96 telas bem com placas de cristalização de estilo sanduíche (espessura bem 0,1 mm) com gotas compostas de 100 amostra de proteína nl e 750 tampão de cristalização nl.
      Nota: rácios de queda pode ser ajustada, se necessário. Além disso, capas de sólidos (isto é, de vidro ou de plástico de espessura) são recomendados que suportam as gotas bem em vez de filmes finos, que tendem a permitir que as gotas para se mover sobre a bem como as placas são manipulados.
   6. Incubar a cristalização plates a ~ 21 ° C. Inspeccionar as placas semanais para o crescimento de cristal usando um microscópio estereoscópico.
   7. Optimizar ligações de cristalização variando os componentes da condição a cristalização de uma forma sistemática (aumentando / diminuindo sal ou concentrações precipitantes, pH, temperatura de incubação, concentração e / ou proteína).

Resultados

Yiur é um transportador de ferro dependente TonB que é um alvo da vacina putativa contra Yersinia pestis. Ele foi originalmente identificados utilizando um ensaio de microarray. Aqui, as medidas que foram tomadas para determinar a estrutura de yiur utilizando cristalografia de raios-X são descritas (Figura 9). Para a clonagem, a sequência de ADN de yiur (menos a sequência de sinal N-terminal) foi amplificado por PCR a partir de ADN genómico e sub-clonado n...

Discussão

β-barrel OMPs servir papéis essenciais em bactérias Gram-negativas, mitocôndrias e cloroplastos e são alvos importantes para a análise estrutural que oferecem uma riqueza de informações sobre mecanismos moleculares essenciais nas membranas externas desses respectivos organelas. No entanto, a produção de amostra suficiente para análise estrutural nem sempre é fácil e, portanto, um gasoduto geral é apresentado para a produção de quantidades suficientes de alvo OMPs β-barril para determinação da estrutur...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Crystallization Robot	TTP Labtech, Art Robbins	-	Any should work here, except for LCP crystallization
PCR thermocycler	Eppendorf, BioRad	-
Media Shaker	New Brunswick, Infors HT	-
UV-vis spectrometer	Eppendorf	-
SDS-PAGE apparatus	BioRad	1645050, 1658005
SDS-PAGE and native gels	BioRad, Life Technologies	4561084, EC6035BOX (BN1002BOX)
AkTA Prime	GE Healthcare	-
AkTA Purifier	GE Healthcare	-
Microcentrifuge	Eppendorf	-
Centrifuge (low-medium speed)	Beckman-Coulter	-
Ultracentrifuge (high speed)	Beckman-Coulter	-
SS34 rotor	Sorvall	-
Type 45 Ti rotor	Beckman-Coulter	-
Type 70 Ti rotor	Beckman-Coulter	-
Dounce homogenizer	Fisher Scientific	06 435C
Emulsiflex	Avestin	-
Dialysis tubing	Sigma	D9652
LCP tools	Hamilton, TTP Labtech	-
VDX 24 well plates	Hampton Research	HR3-172
Sandwich plates	Hampton Research, Molecular Dimensions	HR3-151, MD11-50 (MD11-53)
Grace Crystallization sheets	Grace Bio-Labs	875238
HiPrep S300 HR column	GE Healthcare	17-1167-01
Q-Sepharose column	GE Healthcare	17-0510-01
Crystallization screens	Hampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions	-
Gas-tight syringe (100 ml)	Hamilton