β-varil Dış Membran Proteinleri Yapı Tayini Doğru - Yapıların itibaren Crystals

Özet

β-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of β-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.

Özet

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, α-helical and β-barrel. While α-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, β-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite β-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target β-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.

Giriş

β-varil OMP sadece mitokondri, kloroplast dış zarlarında bulunan ve Gram-negatif bakteriler ^1-3 edilebilir. bunlar α-helikal proteinleri olarak benzer rolleri hizmet ederken, her şerit içten iki komşu şeritlerin bağlı olmak üzere 8-26 adet anti-paralel β-ip kolları arasında değişen bir merkezi doku, gömülü β-barrel alanından oluşan çok farklı kıvrım (Şekil 1 ve 2). β-barrel alan ilk ve son şeritler daha sonra yakın ve çevresindeki membrandan β-barrel alan mühür (mitokondriyal SSVD hariç), bir anti-paralel bir şekilde hemen hemen tamamen birbiriyle etkileşime girer. Tüm β-barrel OMPlerdir Bu döngüler bazen Neisseria transferrin bulunan Pro bağlayıcı 75 kalıntı, kadar büyük olması ile, ligand etkileşimleri ve / veya protein-protein temasları önemli bir rol oynar farklı sekanslarda ve uzunluklarda hücre dışı ilmiklitein A (TbpA) ^4. β-varil OMP da proteinin fonksiyonel bir amaç için ek etki hizmet N-terminal ya da C-terminal periplazmik uzantılarına sahip (örneğin, Bama ^5-7, Fadl ^{10 8,9,} FimD). Β-varil OMPlerin birçok çeşit ¹¹ bulunmakla birlikte, daha yaygın türlerinden iki alanda, (1) TonB bağımlı nakliyeciler ve (2) autotransporters daha az aşina olanlar için örnekler olarak aşağıda açıklanmıştır.

TonB bağımlı taşıyıcılar (örneğin, FEPA, TbpA, BtuB, Cir, vs.) besin alma için gerekli olan ve bir C-ucu β- 22 bükümlü içinde sıkışmış bulunmuş ~ 150 kalıntısından oluşan bir N-terminal fiş alanı içermektedir varil alanı dış zar ¹² (Şekil 3) içine gömülü. Bu fiş alanı serbest kovan alanı üzerinden geçen substratın engellerken, alt-tabaka bağlanma fiş etki th içinde yapısal bir değişikliği indüklerpotansiyel olarak (fiş düzenlenmesi veya fişin kısmi / tam fırlatma yoluyla) daha sonra periplazmaya dış zarından substrat taşımacılığının kolaylaştırılması için oluşumunu gözenek. TonB bağımlı taşıyıcıları örneğin insan konak proteinler ^4,13,14 şirketinden demir gibi besin kaçırmak özel taşıyıcılar geliştiğini Neisseria meningitidis gibi gram-negatif bakterilere, bazı patojen soylarının hayatta kalmak için özellikle önemlidir.

Autotransporters olarak salgılanan veya sunulmuştur ya β-barrel alan (ESTA ve EspP gibi, tipik olarak 12-ip kolları) oluşmaktadır olan B-bloğu OMPlerdir ve bir yolcu alan Gram-negatif bakteri türü V salgılama sistemine ait olan olan hücre ^15,16 (Şekil 3) yüzeyi. Bu β-barrel OMPlerdir genellikle hizmet yolcu etki hücre hayatta kalma ve virülans önemli roller hizmet ya proteaz adezin, ve / veya diğer EFfector bu patogenezi aracılık eder.

X-ışını kristalografisi, NMR spektroskopi ve elektron mikroskobu (EM) bize sırayla onlar dış zarının içinde işlev tam olarak nasıl deşifre etmek için kullanılabilir atomik çözünürlükte OMPlerin modelleri belirlemek için izin olarak yapısal yöntemler. Bu paha biçilmez bilgiler daha sonra varsa ilaç ve aşı geliştirilmesi için kullanılabilir. Örneğin, transferin bağlanma proteini A (TbpA) Neisseria yüzeyi üzerinde bulunan ve doğrudan insan transferin bağlanır ve daha sonra özü ve kendi hayatta kalma demir alır, çünkü patogenezi için gereklidir. TbpA olmadan, Neisseria, insan ev sahibi demir temizlemek edemez ve patojenik olmayan bir hale getirilmektedir. TbpA ⁴ bağlı insan transferin kristal yapısı çözüldü sonra, iki protein ilişkili ne kadar net oldu TbpA ne bölgeleri etkileşimini aracılık, TbpA demir çıkarılması için önemli ne vardı artıkları venasıl bir TbpA hedefleyen Neisseria karşı ilaçlar geliştirebilmek olabilir. Bu nedenle, hayatta kalma ve patogenezinde Gram-negatif bakterilerde β-barrel OMPlerin önemi göz önüne alındığında, aynı zamanda mitokondri ve kloroplast fonksiyonu ve ek yapısal zar proteinlerinin bu eşsiz sınıfı hakkında bilgi ve bunların işlevi de sistemleri için ihtiyaç genel protokoller ifade ve yapısal yöntemlerle karakterizasyonu için yüksek seviyelerde hedef OMPS saflaştırılması genel amacı ile sunulmaktadır.

Protokol

1. Klonlama ve Ekspresyon

Not: Yapısal çalışmalar etkinleştirmek için, oldukça yüksek oranda saflaştırılmış proteinin yeterli miktarda hazırlanmış olmalıdır ve bu, genel olarak, E. hedef β namlu dış zar proteininin klonlanması ve fazla-ekspresyonu (OMP) ile başlar E. coli (Şekil 4). Bugüne kadar, mitokondriyal SSVD için olanlar dahil bütün β namlu OMP yapılar, bakteriyel olarak salgılanan protein ¹¹ elde edilmiştir. Burada, genel protokoller, in vitro ¹⁷ yeniden katlama için kapanım bedenlerine klonlama ve bakteri membranların doğrudan (1) yerli ifadesi için β-varil OMPS ifade ve (2) ifadesi için sunulmuştur.

1. Bir tanım yapısı Tasarımı
   1. Elde veya kodon optimize hedef OMP geni satın alabilirsiniz.
   2. Satın alma veya T7 ekspresyon vektörü (i) periplazmik lokalizasyon sinyali dizisini ihtiva eden elde, bir N-terminal 6 x-Histidin etiketive membran ya da (ii) 'in vitro tekrar katlanma için dahil organlarına ekspresyonu için bir periplazmik lokalizasyon sinyali dizisi olmadan in vivo ifadesi için bir TEV proteaz Alanı ^4,18,19.
      Not: Bir N-terminal proteaz klivaj 6x veya 10x-histidin etiketi saflaştırma için kolay bir yöntem sağlayacaktır. Çözünür proteinler gibi, daha sonra etiketi çıkarılması için afinite etiketi (histidin, Strep, GST, vs.), afinite etiketinin pozisyonunda ve bir proteaz bölgesi dahil (TEV, enterokinaz, trombin, vs.) seçimi değişir .
   3. PCR ifade vektörü içine uygun primerler ve alt klon ile bir hedef diziyi çoğaltmak. Ligasyon bağımsız klonlama (KDK) alt klonlama için ^20,21 veya geleneksel klonlama teknikleri (restriksiyon enzimleri / ligasyonu) kullanın. Ancak, LIC paralel klonlanmış üzere çeşitli yapıların (kesikler, etiketlerin çeşitli yararlanıcı, çeşitli) büyük bir sayı sağlayan yüksek verim kolaylaştırabilir dahakolayca.
2. Vivo Membran-hedeflı dışa
   1. Bir sinyal sekansı ile hedef OMP aşağı klonlanmış β-varil ve çerçeve içinde doğrulamak için sıralama analizi kullanın (örneğin, pelB, OmpA) ifade yapısında.
      Not: sinyal sekansı dış membran içine periplazma ve sonraki meclise salgılanması için Sec translokon için doğmakta zinciri yönlendirir.
   2. BL21 (DE3) 'e kimyasal yetkin hücre 50 ul halinde plazmid 1.0 ul pipetleme ekspresyon için bakterilerin bir ekspresyon suşu içine inşa dönüştürme ve aşağı yukarı pipetleme yavaşça karıştırın. 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
   3. 30 sn su banyosu kullanılarak ve daha sonra 1 dakika boyunca geri buz üzerinde yer için 42 ° C'de ısı darbe.
   4. önceden ısıtılmış SOC ortamı 1 ml ilave edilir ve bir tezgah üstü çalkalamalı bir inkübatör kullanılarak 1000 rpm'de 1 saat süre ile 37 ° C 'de çalkalanır.
   5. Uygun bir Antibiot içeren LB agar plakaları üzerine hücreleri plaka 100 ulic gece boyunca 37 ºC ters inkübe ve.
   6. tek bir koloni ile 5 ml LB + antibiyotik kültürünü aşılayarak küçük ölçekli ifadesi testleri gerçekleştirin. 5-10 koloniler için tekrarlayın.
      Not: Çünkü β-varil OMP potansiyel toksisitesi ve bazal ifade düzeyleri üzerine güven, koloni-to-kolonisi değişkenlik bazen görülmektedir. Bu nedenle, birden koloniler tarama her yapı denenmektedir için tavsiye edilir. Erlenmeyer şişelerine bölmeli 125 ml, 25 ml, kültür üretmek küçük ölçekli ekspresyon testleri yerine, geleneksel 5 mi kültürleri için önerilmektedir. Bu durumlar genellikle daha iyi bir büyük ölçekli büyüme ne olacağını yansıtmaktadır. Buna ek olarak, çeşitli başarı seviyeleri, hedef proteine ​​bağlı olarak rapor edilmiştir, çünkü kültür ortamı (TB, LB, 2xYT, M9, vs.) çeşitli türleri de taranması için iyi bir fikirdir.
      1. 0.6 ~ bir OD ₆₀₀ çalkalanarak 37 ºC'de büyütün.
      2. reklamın hedef OMP ekspresyonunu indüklerDing her kültür tüpüne 1 M izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) 5 ul ve ek 1-2 saat büyümeye olanak sağlar.
      3. Bir mikro santrifüj kullanılarak 15,000 xg'de 1 dakika boyunca, her kültür, 1 ml (~ 0.6 OD ₆₀₀₎ santrifüj tüm koloniler için ekspresyon düzeyleri karşılaştır.
      4. Süpernatantı ve 1 x SDS-PAGE yükleme tampon maddesinin 200 ul tekrar süspansiyon hücreleri. 5 dakika boyunca 100 ° C'de ısı ve sonra santrifüj tekrar 5 dakika boyunca 15.000 xg'de.
      5. % 10 jel her oyuğuna 20 ul pipetleme SDS-PAGE kullanarak örnekleri analiz edin. Sabit 200 V'de 35 dakika boyunca jel üzerinde çalıştırıldı
         Not: protein hedefi uygun bir şekilde katlanmış ya da altında olduğunu tespit edebilmek için, bu noktada yararlı olacaktır. Bu, genellikle küçük çaplı saflaştırma yaparak ya da ısı Değiştirilebilirlik için tahlil ile gerçekleştirilebilir.
   7. En iyi ifadesini gösteren koloni seçin ve orta 12-24 L kullanılarak büyük ölçekli ifadesini gerçekleştirmek.
      Not: geleneksel yöntemler, tipik olarak, 0.6 ~ bir OD ₆₀₀ çalkalanarak 37 ° C'de kültürlerin büyümesini ve daha sonra, uygun bir uyarıcı ile teşvik (örneğin, 0.1-1 IPTG için mM veya p arabinoz% 0.2) ilave bir 2-4 saat boyunca . Arzu edildiği takdirde, indüksiyon öncesinde, düşük ila 20 ° olarak C sıcaklığını düşürmek ve indüksiyon süresi uzatılabilir.
      1. sızan sentezleme yöntemi için, 25 ml'lik bir 37 ° bir kültürü inoküle büyümeye ° C LB ortamında OD ₆₀₀ ~ 0.6 ulaşana kadar, uygun bir antibiyotik (ler) ihtiva etmektedir. Daha sonra, TBC ortamı artı antibiyotik (ler) in on 1 L şişelere inoküle 1 ml ilave edilir ve (3 gün ~) Satürasyon 20 ° C'de büyütülmüştür.
   8. 10 dakika için 6000 x g'de santrifüjleme ile hasat hücreleri.
   9. saflaştırma adımı Bölüm 2.1 geçin veya -80 ° C'de uzun süreli depolama için sıvı nitrojen içinde hücre pelletini dondurmak.
3. İn Vitro REFOL için katma kütlelerinin Expressionding
   1. bir sinyal sekansı içermeyen sentezleme konstruktunu doğrulamak için sıralama analizi kullanın. Bir sinyal dizisinin olmaması inklüzyon gövdeleri olarak sitoplazmada birikmesine hedef proteini yönlendirir.
   2. İfade için bakteri bir ifade suşu içine ifade yapısı Transform. Cisimcik ifadesi için, mümkün zehirlenme etkileri en aza indirmek için indüksiyon (örneğin IPTG, arabinoz, vs.) ile ifadesini kontrol etmek için uygundur.
   3. Levha 100, uygun bir antibiyotik içeren LB agar plakaları üzerine dönüştürülmüş hücrelerin ul ° C, ters bir gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   4. tek bir koloni ile 5 ml LB + antibiyotik kültürünü aşılayarak küçük ölçekli ifadesi testleri gerçekleştirin.
   5. 2-4 ek koloniler için yineleyin 1.3.4.
   6. 0.6 ~ bir OD ₆₀₀ çalkalanarak 37 ºC'de büyütün.
   7. 1-2 saat süreyle uygun bir uyarıcı ile neden olur.
   8. Tüm T ekspresyon seviyelerini karşılaştırO SDS-PAGE kullanılarak analizi ile kolonilerinin (Adım 1.2.6 bakınız). En iyi ifadesini gösteren koloni seçin ve orta 12-24 L kullanılarak büyük ölçekli ifadesini gerçekleştirin.
      1. 0.6-0.8 OD _600-37 ° C 'de hücrelerin büyümesine ve 3-5 saat boyunca 37 ° C' de neden olur. inklüzyon gövdelerinin sentezleme Bütün protein sentezleme deneylerinde olduğu gibi, diğer ifade türlerine göre daha güçlü olmasına rağmen, sentezleme büyüme ortamını, indüksiyon süresi, indüksiyon sıcaklığı ve verici ajan konsantrasyonunun değiştirilmesiyle iyileştirilebilir.
   9. 10 dakika için 6000 x g'de santrifüjleme ile hasat hücreleri.
   10. saflaştırma adımı Bölüm 2.2 geçin veya -80 ° C'de uzun süreli depolama için sıvı nitrojen içinde hücre pelletini dondurmak.

2. Arıtma

1. Membran fraksiyonlarından izole
   Not: çözünebilir proteinlerin aksine, yekpare zar proteinleri, lipid ikili katmanı içine gömülü ve dolayısıyladaha fazla arıtılmadan ve analiz (Şekil 5) bunları çıkarmak için deterjan gerektirir. ifade eden bir β-barrel OMP Saflaştırmadaki birinci aşama, zar fraksiyonu elde edilen ekstrelerdir.
   1. 5 mL / g hücre pastası bir oranda lisiz tamponu (50 mM Tris-HCI, pH 7.4, 200 mM NaCI, 10 mM _MgCI2, 50 ug / ml AEBSF'in, 5 ug / ml DNase I) içinde süspanse hücreleri.
   2. Lyse bir Fransız basını veya hücre homojenleştirici kullanılarak hücreler. Lizinlerle parçalanmayan hücreler ve hücre artıkları çıkarmak için 4 ° C'de 30 dakika boyunca 15,000 xg'de lize hücreleri dönerler.
   3. 4 ° C'de 1 saat boyunca yüksek hızda (200,000 x g) yeniden temiz bir tüpe ve santrifüj süpernatant aktarın. Elde edilen pelet, ilgili proteini içeren membran fraksiyonu olup.
   4. Membran fraksiyonu, ilk membranlar aktarılması, bir Dounce homojenleştirici tekrar süspansiyon kullanılarak ve daha sonra çözücü tampon (50 mM KH ₂ PO ₄ pH 7.5, 200 mM NaCl eklenerek, 20 mM imidazol, PH 8.0) içinde (deterjansız 2x konsantrasyonda 20 g hücre başına 50 mi).
   5. Deterjan (yani, N-dodesil-β-D-maltozit (DCM), laurildimetilamin-N-oksit (LDAO), n-oktil-β-D-glukopiranosid, Triton (KK), küçük bir cam bardak içine yeniden süspansiyona alınan zarlar dökün ve ekleme yavaş 10x kritik misel konsantrasyonu (CMC) ~ bir son konsantrasyona kadar X-100, vb.)
   6. 1x çözücü tampon nihai bir konsantrasyona kadar su ile doldurun. hedef protein membran elde edilir ne kadar kolay bağlı olarak 4 ° C 'de 0.5-16 saat karıştırın.
      Not: Deterjan yavaş hedef protein elde etmek için membranlar çözünür kullanılır. İyonik (SDS, deoksikolik asit), iyonik olmayan (Elugent, ara, Triton X-100, RG, DCM) ve zitteriyonik (LDAO, CHAPS): burada kullanılabilir deterjan 3 tipi vardır. saflaştırma aşaması esnasında sabit ve tek dağılımlı olan bir protein bir deterjan kompleksi büyük zar proteini krista başarısı yardımcı olacakiyon. deterjanlar, bunların özellikleri, CMC bilgi ve membran proteinleri ve diğer uygulamaların saflaştırılması bunların kullanımı hakkında daha fazla bilgi ticari tedarikçisi web sitelerinde bulunabilir.
   7. 4 ° C'de 1 saat 300.000 xg'de çözünmüş örnek santrifüj. Süpernatan artık deterjan çözündürülmüş hedef β-barrel OMP içerir.
   8. aşağıda belirtilen Bölüm 2.3 ile devam edin.
2. Katma kütlelerinin arasından refolding
   Not: In vitro refolding için, hedef β-varil OMP cisimcikler doğrudan ifade edilir. Burada bir avantajı, bu proteinlerin yüksek düzeyde elde edilebilir olmasıdır. Ancak dezavantajı, tekrar katlama, genellikle verimsiz ve sonraki bir yeniden katlama deney değişmesidir. Yine de, başarılı bir yapısal çalışmalar için refolded olan proteinlerin birçok örnek vardır. cisimcikler içine ifadesini takiben, bir anda deneyi yeniden katlanması için inklüzyon cisimcikleri izole gerekirs.
   1. Her liziz tamponunda yeniden süspanse hücreleri (50 mM Tris-HCI, pH 7.4, 200 mM NaCI, 10 mM _MgCI2, 50 ug / ml AEBSF, 5 ug / ml DNase I, 4 mM 2-merkaptoetanol (BME)) (5 mi g hücre macunu). Lyse bir Fransız basını, sonication veya hücre homojenleştirici kullanarak.
   2. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 6000 x g'de düşük hızlı bir dönüş ile inklüzyonlar Pelet.
   3. bir Dounce homojenleştirici kullanılarak 1.0 M üre, 25 ml içinde yeniden süspanse edilerek Dahil etme gövdelerini yıkayın. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 6000 x g'de düşük hızlı bir dönüş tekrar pelet.
   4. Adımı tekrarlayın gerekli 2.2.3.
   5. 10 mg nihai bir konsantrasyona kadar yıkanmış inklüzyon gövdeleri yeniden süspanse / ml 8.0 M üre ihtiva eden bir tampon (veya 6.0 M guanidinyum hidroklorür (GdCl)) 2x CMC ya da daha yüksek bir artı deterjan (yani, DCM veya LDAO).
      Not: Histidin etiketi içeren zar proteini hedefler için, arzu edilirse, immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) saflaştırma denatüre CO kullanılarak gerçekleştirilebilirBölüm 2.3 aşağıda açıklanana benzer bir ilk adım olarak (8.0 M üre ya da 6.0 M GdCl olarak) şulları.
   6. denatüre eksik tamponunda diyaliz ile denatüre çıkarmadan yavaş yavaş (gece) tarafından refolding reaksiyonu gerçekleştirin.
      Not: Bunu gerçekleştirmek için diyaliz tampon çeşitli değişiklikler alabilir. cisimcikler önce bir IMAC kolona bağlı olup olmadığını hala yavaş denatüre kaldırmak için tamponlar alışverişinde sütuna bağlı iken Alternatif olarak, bir yeniden katlama reaksiyonu yapabilirsiniz. Her iki durumda da, bu nedenle, deterjan hedef stabilize mevcut olması gerekir, bir zar proteini olduğunu hatırlayın. Kullanılan deterjan diyaliz ise de, bu da diyaliz tampon maddesi (ler) e ilave edilmesi gerekmektedir.
   7. 4 ° C'de 1 saat 200.000 xg'de tekrar katlanmış örnekleri Spin. Süpernatan yeniden katlanmış deterjan çözündürülmüş hedef β-barrel OMP içerir.
   8. aşağıda belirtilen Bölüm 2.3 ile devam edin.
3. I kullanılarak yapılan saflaştırma işlemiMAC, İyon Değişim ve Jel Filtrasyon
   Not: doğal olarak, in vitro yöntemler kullanılarak açık veya tekrar katlanmış olup protein varsayarak, bir histidin etiketi ile işlenmiş olan, daha sonra, immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) Deterjan tutulmalıdır hariç Histidin çözünür etiketli proteinlerin çoğu için gibi saflaştırma için gerçekleştirilir Tüm takip eden tampon çözülmüş ve sabit hedef β-barrel OMP tutmak.
   1. 1-5 ml IMAC sütunu hazırlayın ya da bir prepacked sütununu kullanın. 4 ° C'de sonraki kromatografi adımları uygulayın. suyla yıkayın koruyucu herhangi izlerini kaldırmak için. otomatik bir arıtma sistemi kullanılarak, üreticinin talimatlarına uygun olarak sütun gerekmektedir.
   2. IMAC Tampon A (50 mM K ₂ HPO _4, pH 7.5, 200 mM NaCl,% 0.1 DCM) ve IMAC Tampon B 250 ml (50 mM K ₂ HPO _4, pH 7.5, 200 mM NaCl,% 0.1 500 ml hazırlanması DCM, ve 1.0 M imidazol).
      Not: Kullanılabilecek diğer deterjanlardışmda şimal-6 (% 0.05), Triton X-100 (% 0,03) ve LDAO (% 0.05).
   3. IMAC A tamponu 10 kolon hacmi ile IMAC sütunu dengeye
   4. 25 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar bir protein örnek imidazol ilave et ve karıştır. 2 mL / dakika dengelenen IMAC kolonu üzerine örnek yükleyin. akışı toplayın.
   5. 5 kolon hacmi tampon B ile imidazol artan konsantrasyonlarının her biri IMAC sütunu yıkayın (örneğin, 25 mM, 50 mM, 100 mM). 2 ml fraksiyonlar halinde yıkama toplayın.
   6. 5 kolon hacmi 250 mM'lik bir son konsantrasyon elde numune yıkayın. 2 ml'lik fraksiyonlar içinde elüt örnek toplamak.
   7. akışı analiz yıkama fraksiyonları ve SDS-PAGE analizi kullanılarak elüsyon fraksiyonları 280 nm'de absorbans göre (Adım 1.2.6 bakınız). SDS-PAGE analizi ile belirlenmiş hedef β-varil OMP ihtiva eden fraksiyonlar havuzda toplayın.
   8. Havuza alınan numuneye TEV proteaz ekleyerek 6x-Histidin etiketi kaldırmak (göreüreticinin protokolü) ve hafif hafif sallanarak 4 ° C'de gece boyunca kuluçka için.
   9. bölünmüş etiketleri ve herhangi bir bölünmemiş örnekten (akmasına) hedef β-varil OMP ayırmak için tekrar bir IMAC kolona örnek / proteaz çözüm yükleyin. Akış yoluyla etiketi eksik bölünmüş numuneyi içerecek.
      Not: Bu aynı zamanda gibi herhangi bir proteaz kaldırmak TEV-His, aynı zamanda bir parçalanamayan 6x-Histidin etiketi kendisi vardır. Aksi takdirde, diğer yöntemler sindirimden sonra proteazı kaldırmak için gerekli olacaktır.
   10. İsteğe bağlı olarak, daha da örnek saflaştırmak için iyon değişimi kromatografisi gerçekleştirin. Sütun kullanılmak üzere tüm tamponlarda deterjan içerdiğinden emin olarak, üreticinin talimatlarına uyun.
   11. Kristalizasyon için hazırlık deterjan ihtiva eden bir tampon maddesi içinde bir jel filtrasyon kolonu üzerine örnek yüklemek için, kristalleştirme için kullanılan, örneğin 25 mM Tris-HCI, pH 7.5, 200 mM NaCI,% 1 RG olarak.
   12. 1 ml'lik kesirler toplayın ve USI analizng, SDS-PAGE analizi (bkz Adım 1.2.6) 280 nm'de kendi absorbans dayalı. 280 nm'de absorbans ile Havuz fraksiyonları, hedef protein içerir olarak. ~ 10 mg / ml için konsantre edilir.
       Not: İstenirse, uygun bir bölme, aşağıda belirtildiği gibi, bir ısı değiştirilebilirliğini analizi kullanılarak değerlendirilebilir.
4. Isı Değiştirilebilirlik Deneyi
   Not: Bir yöntem OMPlerdir yarı ana SDS-PAGE ²² kullanan ısı değiştirilebilirliğini testleri gerçekleştirmek için, saflaştırılmış β-varil doğru katlanmasına izlemek için. Burada, düzgün katlanmış olan ısıtılmayan numuneler genellikle farklı ısı denatüre olanlar göç edecektir. Bu özellik OMPS-varil ß benzersiz ve geniş membran proteinlerinin bu aileye incelemek için kullanılır.
   1. Önceki örnekleri hazırlamak için, jel aparat monte edin. Başlamak için, bir buz kovası içine tampon tankı yerleştirin ve buz ile tamamen kuşatır. tutucunun içine bir in-house döküm veya ticari yerli degrade jel yerleştirin ve tanka yerleştirin. t doldurunÇalışma buffer soğuk 1 x MES tamamen o tankı (50 mM 2- [N-morfolino] etansülfonik asit, 50 mM Tris baz, 1 mM EDTA,% 0.1 SDS, pH 7.3).
   2. Pipet, iki bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine örnek (10 mg / ml), 0.25 ul. 'Haşlanmış' ve 'RT' gibi diğer olarak bir etiketleyin.
   3. Her numune tamponu 9.75 ul ekleyin ve pipetleme karıştırın. Her iki numune için, 2 x SDS yükleme tamponu (100 mM Tris-HCI, pH 6.8,% 2 SDS,% 0.2 mavi bromofenol ve% 20 gliserol) 10 ul ekle ve pipetleme hafifçe karıştırın.
   4. Oda sıcaklığında 'RT' örnek çıkarken 5 dakika boyunca 95 ° C'de 'Haşlanmış' örnek kaynatın. 'Haşlanmış' örnek kısaca Spin.
   5. Yük önceden birleştirilmiş yerli jeli üzerinde her iki numune de 20 ul. sabit 150 V 60 dakika çalıştırın jel çıkarın ve sonuçları görselleştirmek için boyama çözeltisi içinde ıslatın.

3. Kristalizasyon

Not: her iki kristalizasyon içinÇözünür ve zar proteini hedefler, bu örnek saflığı ve stabilite (örneğin, iyi bir deterjan, ligandlar, kofaktörler, vb) üst düzeye çıkarmak için, standart bir protokoldür. (1) deterjan (2) bicelle, ve (3) lipit kübik faz (LCP) (Şekil 6) ^23: Genel olarak membran protein hedeflerini kristalize etmek için halihazırda kullanılan yöntemlere iki tabakalı gömülmüş proteinlerin amfifilik gereksinimlerini karşılamak başlıca üç yol kapsamaktadır. Bir nanoliter kristalleşme robot kullanılması önemle tavsiye edilir mümkün yapı tayini (Şekil 7) yardım etmek amaçlı araçlar belirli bir örnek hacmi için elenebilir koşulları sayısını yanı sıra, kullanan son gelişmeleri artırmak amacıyla.

1. Kristalizasyon kullanılarak deterjanlar
   1. ~ 10 mg / ml konsantrasyonda bir deterjan çözündürülmüş protein örneği elde edilir. İsteğe bağlı olarak, deterg azaltmak için% 3'lük bir son konsantrasyon elde örnek doğrudan ilave 1,2,3-dimerkapto eklemeent misel boyutu.
   2. parçacık ve yağış kaldırmak için 0.22 mikron santrifüj filtre kullanarak örnek Filtre.
   3. Bir kristalleşme robot kullanarak, her iki asılı tarafından ticari olarak mevcut 96 kuyu ekranlarını kullanarak veya ~ 200 nl protein örnek ve ~ 200 nl kristalleşme tampon oluşan damla damla buharlaşma yöntemi oturan tarama geniş matris kristalleşme gerçekleştirin.
   4. ~ 21 ° C 'de kristalleşme inkübe edin. Stereomikroskopta kullanarak kristal büyümesi için haftalık plakaları kontrol edin.
   5. sistematik olarak kristalizasyon durumunun bileşenlerin değiştirilmesiyle kristalleştirme potansiyel optimize (/ artan tuzu ya da çökeltme konsantrasyonlarda tamponu pH kuluçka sıcaklığı azaltılması ve / ya da protein konsantrasyonu).
2. Bicelles kullanarak kristalleştirme
   Not: bicelle tekniklerin daha ayrıntılı bir ispatı Ujwal ve Abramson ²⁴ tarafından tarif edilmiştir.
   1. Hazırlayın veya 3 satınCHAPSO 2.8 bir oranda: yayınlanmış protokollere ²⁵ 1 'e göre DMPC oluşan% 5 bicelle karışımı ile gerçekleştirilmektedir. Diğer konsantrasyonları tahlil, hem de, diğer lipitler ve deterjanlar, gerektiğinde edilebilir.
   2. ~ 10 mg / ml konsantrasyonda bir deterjan çözündürülmüş protein örneği elde edilir.
   3. 1 h / h 4: bir başlangıç ​​oranında, buz üzerinde, bicelle karışımı ekleyin (protein: bicelle) (örneğin, protein 40 ul bicelle karışımı 10 ul ve pipetleme hızla karıştırıldı).
   4. Buz 30-60 dk inkübe edin.
      Not: Protein: bicelle çözümü çoğunlukla açık kalmalıdır ancak genellikle hafif opak açabilirsiniz. Protein, ancak: bicelle Çözelti süt beyazı gösteren çökelmesini döner, daha sonra diğer değişkenler (örn, bir deterjan, tampon, vs.) test edilmelidir. yeni örneklerin yapıyor küçük ölçekli testler (8 ul protein ve 2 ul bicelles) için önce gereksiz örnek kaybını önlemek için ölçeklendirme istikrar doğrulamak için tavsiye edilir.
   5. Bir kristalleşme robot kullanarak, her iki asılı tarafından ticari olarak mevcut 96 kuyu ekranlarını kullanarak veya ~ 200 nl protein örnek ve ~ 200 nl kristalleşme tampon oluşan damla damla buharlaşma yöntemi oturan tarama geniş matris kristalleşme gerçekleştirin.
   6. ~ 21 ° C 'de kristalleşme inkübe edin. Stereomikroskopta kullanarak kristal büyümesi için haftalık plakaları kontrol edin.
   7. sistematik olarak kristalizasyon durumunun bileşenlerin değiştirilmesiyle kristalleştirme potansiyel optimize (/ artan tuzu ya da çökeltme konsantrasyonlarda tamponu pH kuluçka sıcaklığı azaltılması ve / ya da protein konsantrasyonu).
3. Lipidik Kübik Faz kullanma kristalleşme (LCP)
   Not: LCP tekniklerin daha ayrıntılı bir gösterim önce Liu ve Cherezov ^26,27 tarafından tarif edilmiştir.
   1. ~ 20 mg / ml konsantrasyonda bir deterjan çözündürülmüş protein örneği elde edilir.
   2. Pre-sıcak monoolein için ~ 40 ° C. Yük60 ul bir gaz geçirmez 100 ul şırınga ve başka içine 40 ul protein örnek içine monoolein.
   3. Bir karıştırma coupler kullanarak, hava tanıtmak için dikkatli olmak, şırıngalar bağlayın.
   4. Numune saydam ve homojen hale tamamen kadar diğer bir şırınga karışımı iterek şırınga pistonları üzerinde alternatif basınç uygulayarak hafifçe karıştırın.
   5. LCP yöntemleri için tasarlanmış bir kristalleşme robot kullanarak, 100 nl protein örnek ve 750 nl kristalleşme tampon oluşan damla sandviç tarzı kristalleşme plakaları (0.1 mm kuyu kalınlığı) ile piyasada mevcut 96 kuyu ekranlarını kullanarak tarama geniş matris kristalleşme gerçekleştirin.
      Not: Gerekirse Bırak oranları ayarlanabilir. Ayrıca, katı kapaklar (yani, cam ya da kalın plastik) plakaları ele gibi damla hakkında da hareket etmesine izin eğilimindedir damla güzel ziyade ince filmler, destekleyen tavsiye edilir.
   6. kristalleşme p inkübelat'lar ~ 21 ° C de. Stereomikroskopta kullanarak kristal büyümesi için haftalık plakaları kontrol edin.
   7. sistematik olarak kristalizasyon durumunun bileşenlerin değiştirilmesiyle kristalleştirme potansiyel optimize (/ artan tuzu ya da çökeltme konsantrasyonlarda tamponu pH kuluçka sıcaklığı azaltılması ve / ya da protein konsantrasyonu).

Sonuçlar

YiuR Yersinia pestis karşı olası bir aşı hedefi olan bir TonB bağımlı demir taşıyıcıdır. Bu orjinal mikro-dizi analizi kullanılarak belirlenmiştir. Burada, X-ışını kristalografisi kullanarak YiuR yapısını belirlemek için alınmıştır adımlar (Şekil 9) özetlenmiştir. Klonlama için YiuR DNA sekansı (eksi N-terminal sinyal sekansı) PCR genomik DNA'dan kuvvetlendirildi ve TEV proteaz sitesi ardından bir N-terminali pelB ...

Tartışmalar

β-varil OMP bakteri, mitokondri ve kloroplastların Gram-negatif temel rolleri hizmet ve bu ilgili organellerin dış zarlarında da temel moleküler mekanizmaları hakkında bilgi hazinesi sunan yapısal analiz için önemli hedeflerdir. Ancak, yapısal analiz için yeterli örnek üreten her zaman kolay değildir ve bu nedenle, genel bir boru hattı detaylı kristallerine yapılardan sürecini anlatan, yapı tayini için hedef β-varil OMPlerin yeterli miktarda üretimi için sunulmuştur. Bu protokoller, test edilmi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Crystallization Robot	TTP Labtech, Art Robbins	-	Any should work here, except for LCP crystallization
PCR thermocycler	Eppendorf, BioRad	-
Media Shaker	New Brunswick, Infors HT	-
UV-vis spectrometer	Eppendorf	-
SDS-PAGE apparatus	BioRad	1645050, 1658005
SDS-PAGE and native gels	BioRad, Life Technologies	4561084, EC6035BOX (BN1002BOX)
AkTA Prime	GE Healthcare	-
AkTA Purifier	GE Healthcare	-
Microcentrifuge	Eppendorf	-
Centrifuge (low-medium speed)	Beckman-Coulter	-
Ultracentrifuge (high speed)	Beckman-Coulter	-
SS34 rotor	Sorvall	-
Type 45 Ti rotor	Beckman-Coulter	-
Type 70 Ti rotor	Beckman-Coulter	-
Dounce homogenizer	Fisher Scientific	06 435C
Emulsiflex	Avestin	-
Dialysis tubing	Sigma	D9652
LCP tools	Hamilton, TTP Labtech	-
VDX 24 well plates	Hampton Research	HR3-172
Sandwich plates	Hampton Research, Molecular Dimensions	HR3-151, MD11-50 (MD11-53)
Grace Crystallization sheets	Grace Bio-Labs	875238
HiPrep S300 HR column	GE Healthcare	17-1167-01
Q-Sepharose column	GE Healthcare	17-0510-01
Crystallization screens	Hampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions	-
Gas-tight syringe (100 ml)	Hamilton