JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

β-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of β-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.

Аннотация

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, α-helical and β-barrel. While α-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, β-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite β-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target β-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.

Введение

β-бочка ОМР можно найти только во внешних мембранах митохондрий, хлоропластов и грамотрицательные бактерии 1-3. В то время как они служат аналогичные роли в качестве альфа-спиральных белков, они имеют очень разные складку, состоящий из центральной области β-бочка мембраны встраиваемый в диапазоне от 8-26 антипараллельными бета-нитей с каждой пр дь тесно связан с двумя соседними нитями (фиг.1 и 2). Первый и последний пряди области β-бочка затем взаимодействуют друг с другом, почти исключительно в анти-параллельно (за исключением митохондриальной VDAC), чтобы закрыть и загерметизировать домен β-бочка из окружающей мембраны. Все ОМР β-бочка имеют внеклеточные петли разной последовательности и длины, которые играют важную роль в лигандных взаимодействий и / или белок-белковых контактов, причем эти петли иногда быть как большой, как 75 остатков, например, найти в Neisseria, трансферрин связывания проTein A (TbpA) 4. β-бочка ОМР может также иметь N-концевые или С-концевые периплазмической расширения , которые служат в качестве дополнительных доменов для функционального назначения белка (например, Бама 5-7, FimD 8,9, ФАДЛЬ 10). Хотя многие типы β-ствольных ОМР существует 11, два из наиболее распространенных типов описаны ниже в качестве примеров для тех , кто менее знаком с полем, (1) TonB-зависимых транспортеров и (2) автовозы.

TonB-зависимых транспортеров (например, FEPA, TBPA, BtuB, Cir и т.д.) имеют важное значение для импорта питательных веществ и содержат N-концевой домен подключаемый модуль , состоящий из ~ 150 остатков , который находится внутри , заправленные С-концевой 22-многожильный β- Несколько доменов ствол встроен в наружную мембрану 12 (рисунок 3). В то время как этот плагин домен предотвращает субстрат свободно проходя через домен ствола, связывающий субстрат индуцирует конформационные изменения в домене штекером гопри приводит к образованию пор (либо с помощью штекера перегруппировки или путем частичного / полного выталкивания пробки), который затем может облегчить транспорт субстрата через внешнюю мембрану в периплазму. TonB-зависимых транспортеров особенно важны для выживания некоторых патогенных штаммов грамотрицательных бактерий , таких как менингококк, которые эволюционировали специализированные транспортеры , которые угнать питательные вещества , такие как железо непосредственно из белков человека принимающих 4,13,14.

Автовозы относятся к V системы секреции типа грамотрицательных бактерий и бета-баррель ОМР, которые состоят из области β-бочка (как правило, 12-нитей, как с ЭСТА и ESPP) и домен пассажира, который либо секретируются или представленные на поверхность клеток 15,16 (рисунок 3). Эти β-бочка ОМР часто служат важную роль в выживании клеток и вирулентности с доменом пассажирской обслуживающей либо как протеаза, адгезина, и / или других Е.Ф.Fector, что связующим звеном патогенеза.

Структурные методы, такие как рентгеновская кристаллография, ЯМР-спектроскопии и электронной микроскопии (ЭМ) позволяют определить модели для датчиков OMP с атомным разрешением, которое в свою очередь может использоваться, чтобы расшифровать точно, как они функционируют в пределах внешней оболочки. Эта бесценная информация может быть затем использована для лекарственных средств и вакцин развития, если это применимо. Например, трансферрин - связывающий белок А (TbpA) находится на поверхности Neisseria и необходим для патогенеза , поскольку она непосредственно связывается с человеческим трансферрином , а затем извлекает и импортирует железо для своего собственного выживания. Без TbpA, Neisseria не может продувать железа из человеческого организма и оказываются непатогенные. После того, как была решена кристаллическая структура человеческого трансферрина , связанного с TbpA 4, стало гораздо яснее , как связаны эти два белка, каких регионах TbpA опосредованное взаимодействие, какие остатки играют важную роль для извлечения железа путем TbpA, икак можно было бы разработать терапевтические средства против Neisseria таргетинга TbpA. Поэтому, учитывая важность β-ствольных ОМР в грамотрицательных бактерий для выживания и патогенеза, а также в митохондриях и хлоропластов функции, а также необходимость дополнительной структурной информации об этом уникальном классе мембранных белков и систем, в которых они функционируют общие протоколы представлены с общей целью выражения и очистки целевых ОМР на высоких уровнях для определения характеристик структурными методами.

протокол

1. Клонирование и экспрессия

Примечание: Для включения структурных исследований, достаточное количество высокоочищенного белка должно быть получено, и это как правило , начинается с клонированием и избыточной экспрессии белка - мишени β-бочка наружной мембраны (OMP) в E. палочки (Рисунок 4). На сегодняшний день все β-бочка OMP структур, в том числе для структур митохондриальной VDAC, были получены от бактериально экспрессируемого белка 11. Здесь, общие протоколы представлены для клонирования и экспрессии β-ствольной ОМР для (1) нативной экспрессии непосредственно в бактериальных мембранах и (2) выражение в включений тел для ин витро рефолдинга 17.

  1. Проектирование конструкции экспрессии
    1. Получить или приобрести кодон оптимизированный ген целевой OMP.
    2. Покупка или получить вектор экспрессии, Т7 (I), содержащий последовательность периплазматической локализации сигнала, N-терминальный 6х-гистидин тег,и сайт протеазы TEV 4,18,19 для экспрессии к мембране или (II) без периплазмической последовательности локализации сигнала для экспрессии телец включения для рефолдинга в пробирке в естественных условиях.
      Примечание: N-концевой протеазы расщепляться 6х или 10х-гистидин тег обеспечит простой способ очистки. Как и в случае растворимых белков, варьировать выбор аффинной метки (гистидин, Стрептококковое, GST и т.д.), от положения аффинной метки, а также включение сайта протеазы (ТРВ, энтерокиназы, тромбин и т.д.) для последующего удаления тега ,
    3. ПЦР-амплификации последовательности-мишени с соответствующими грунтовками и субклона в вектор экспрессии. Используйте безлигазное клонирование (LIC) 20,21 или обычные способы клонирования (ферменты рестрикции / лигирования) для субклонирования. Однако ЛИК может облегчить высокую пропускную способность, что позволяет для огромного числа различных конструкций (укорочения, разнообразие тегов, разнообразие промоутеров), чтобы быть клонированы параллельно болеебез труда.
  2. В Vivo Мембранная направленной экспрессии
    1. С помощью анализа секвенирования для проверки целевого бета-бочка OMP клонирован вниз по течению и в рамке с сигнальной последовательностью (т.е. pelB, OmpA) в конструкции экспрессии.
      Примечание: сигнальная последовательность направляет синтезируемой цепью к транслокона сек для секреции в периплазму и последующей сборки в наружную мембрану.
    2. Transform конструкцию в штамм экспрессии бактерий для экспрессии пипеткой 1,0 мкл плазмиды в 50 мкл BL21 (DE3) химически компетентные клетки и осторожно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Инкубируют на льду в течение 30 мин.
    3. Тепловой импульс при 42 ° С в течение 30 секунд с помощью водяной бани, а затем поместить обратно на льду в течение 1 мин.
    4. Добавьте 1 мл подогретого SOC СМИ и встряхивают при температуре 37 ° С в течение 1 ч при 1000 оборотах в минуту с использованием шейкера инкубатора настольный.
    5. Пластина 100 мкл клеток на чашках с агаром LB, содержащей соответствующее AntibiotIC и инкубировать в течение ночи при 37 ° С перевернутой.
    6. Выполните мелкомасштабные тесты экспрессии путем инокуляции + культуру с антибиотиком 5 мл LB с одной колонии. Повторите эти действия для 5-10 колоний.
      Примечание: Из-за потенциальной токсичности β-бочка OMP и зависимость от базальных уровней экспрессии, иногда наблюдается колонии к колонии изменчивости. Таким образом, скрининг нескольких колоний рекомендуется для каждой конструкции испытывается. Для малых экспрессии тестов, а не обычные 5 мл культур, растущих в 25 мл культуры в 125 мл колб Эрленмейера с перегородками предлагается. Эти условия часто лучше отражают то, что будет происходить в росте крупномасштабной. Кроме того, это хорошая идея также экран различные виды питательных сред (TB, LB, 2xYT, M9 и т.д.), так как различные уровни успеха были зарегистрированы в зависимости от целевого белка.
      1. Растут при температуре 37 ° С при встряхивании до OD 600 ~ 0,6.
      2. Индуцируют экспрессию целевой OMP по объявлениюDing 5 мкл 1 М изопропилового бета-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) в каждую культуральную пробирку и позволяют выращивать еще 1-2 ч.
      3. Сравните уровни экспрессии для всех колоний путем центрифугировани 1 мл каждой культуры (OD 600 ~ 0,6) в течение 1 мин при 15000 XG с помощью микроцентрифуге.
      4. Удалить супернатант и клетки вновь суспендируют в 200 мкл 1x SDS-PAGE буфера загрузки. Нагревают при 100 ° С в течение 5 мин, а затем снова центрифуге при 15000 х г в течение 5 мин.
      5. Анализ образцов с помощью SDS-PAGE с помощью пипетки 20 мкл в каждую лунку 10% геле. Выполнить гель в течение 35 мин при постоянном 200 В.
        Примечание: Было бы полезно, в этот момент, чтобы иметь возможность определить, является ли целевой белок быть сложены надлежащим образом или нет. Это часто может быть достигнуто, делая небольшие очисток или путем опробования для тепла модифицируемость.
    7. Выберите колонию, показывая лучшее выражение и выполнить широкомасштабную выражение с помощью 12-24 л среды,
      Примечание: Традиционные методы , как правило , растут культуры при 37 ° С при встряхивании до OD 600 ~ 0,6 , а затем вызвать с помощью соответствующего индуктора (т.е. 0,1-1 мм для IPTG или ~ 0,2% для арабинозы) еще в течение 2-4 ч , При желании перед индукцией, снизить температуру до минимального 20 ° C и продлить время индукции.
      1. Для метода вытекающей экспрессии, выращивают в 25 мл прививают культуру при 37 ° С в LB среде , содержащей соответствующий антибиотик (антибиотики) , пока OD 600 не достигает ~ 0,6. Затем добавляют 1 мл посевного материала до двенадцати 1 л колбах среды ТВ плюс антибиотик (антибиотики) и расти при температуре 20 ° C до насыщения (~ 3 дня).
    8. Урожай клетки центрифугированием при 6000 мкг в течение 10 мин.
    9. Перейдите к шагу очистки раздела 2.1 или заморозить осадок клеток в жидком азоте для длительного хранения при температуре -80 ° С.
  3. Выражение для телец включения для In Vitro Refolзвенеть
    1. С помощью анализа секвенирования, чтобы проверить, экспрессирующая конструкция не содержит сигнальную последовательность. Отсутствие сигнальной последовательности направит целевой белок накапливаться в цитозоле в виде телец включения.
    2. Преобразуем выражение конструкции в штамм экспрессии бактерий для экспрессии. Для экспрессии телец включения, то лучше контролировать экспрессию по индукции (т.е. IPTG, арабинозы и т.д.) , чтобы свести к минимуму возможные последствия , связанные с токсичностью.
    3. Пластина 100 мкл трансформированных клеток на чашках с агаром LB, содержащей соответствующий антибиотик и инкубировать в течение ночи при 37 ° С перевернутой.
    4. Выполните мелкомасштабные тесты экспрессии путем инокуляции + культуру с антибиотиком 5 мл LB с одной колонии.
    5. Повторите шаг 1.3.4 для 2-4 дополнительных колоний.
    6. Растут при температуре 37 ° С при встряхивании до OD 600 ~ 0,6.
    7. Индуцируют с соответствующим индуктора в течение 1-2 ч.
    8. Сравнение уровней экспрессии для всех тон колоний анализа с помощью SDS-PAGE (шаг 1.2.6). Выберите колонию, показывая лучшее выражение и выполнить широкомасштабную выражение с помощью 12-24 л среды.
      1. Grow клетки при 37 ° С до OD 600 0,6-0,8 и индуцируют при 37 ° С в течение 3-5 ч. В то время как выражение в тельцах включения является более устойчивым, чем другие типы выражения, как и во всех экспериментах экспрессии белков, экспрессия может быть улучшена за счет изменения среды роста, время индукции, температуру индукции и концентрацию индуцирующего агента.
    9. Урожай клетки центрифугированием при 6000 мкг в течение 10 мин.
    10. Перейдите к шагу очистки Раздел 2.2 или заморозить осадок клеток в жидком азоте для долговременного хранения при -80 ° С.

2. Очистка

  1. Изоляция от мембранными фракциями
    Примечание: В отличие от растворимых белков, интегральными мембранными белками встраиваются в липидный бислой и, следовательно,требуют моющие средства для их извлечения для дальнейшей очистки и анализа (рисунок 5). После экспрессии, первый шаг в очистке β-бочка OMP является извлечение из мембранной фракции.
    1. Ресуспендируют клеток в буфере для лизиса (50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 200 мМ NaCl, 10 мМ MgCl 2, 50 мкг / мл AEBSF, 5 мкг / мл ДНКазы I) в соотношении 5 мл / г клеточной пасты.
    2. Лизировать клетки, используя французскую прессу или клеточную гомогенизатора. Спин лизированных клеток при 15000 х г в течение 30 мин при 4 ° С для удаления unlysed клеток и клеточных остатков.
    3. Передача супернатант в чистую пробирку и центрифугируют еще раз на высокой скорости (200000 х г) в течение 1 ч при 4 ° С. Полученный в результате осадок является мембранную фракцию, которая содержит белок, представляющий интерес.
    4. С помощью гомогенизатора Даунса гомогенизатора, ресуспендируют мембранную фракцию, первый перенос мембран , а затем добавление солюбилизационной буфера (50 мМ KH 2 PO 4 рН 7,5, 200 мМ NaCl, 20 мМ имидазола, РН 8,0) (50 мл на 20 г клеток) при концентрации 2 ×, без моющих средств.
    5. Налейте ресуспендированные мембраны в небольшой стакан и добавьте моющее средство (то есть, н-додецил-β-D-maltoside (ДДМ), lauryldimethylamine-N-оксид (LDAO), н-октил-бета-D-глюкопиранозид (ОГ), Тритон Х-100 и т.д.) медленно до конечной концентрации ~ 10 - кратным критической концентрации мицеллообразования (ККМ).
    6. Наполните водой до конечной концентрации буфера 1x солюбилизацию. Перемешивают в течение 0.5-16 часов при температуре 4 ° С, в зависимости от того, насколько легко целевой белок экстрагируют из мембран.
      Примечание: моющее средство используется для медленно солюбилизации мембран для извлечения целевого белка. Есть 3 вида моющих средств, которые могут быть использованы здесь: ионная (SDS, деоксихолевую кислоты), неионное (Elugent, ТВИН, Тритон Х-100, О. Г., DDM) и цвиттерионная (LDAO, CHAPS). Белок-моющий комплекс, который является стабильным и монодисперсных во время стадии очистки будет в значительной степени способствовать успеху мембранного белка crystallizatиона. Более подробную информацию о моющих средствах, их свойствах, информация о ККМ, а также их использования в очистке мембранных белков и других приложений можно найти на сайтах коммерческих поставщиков.
    7. Центрифуга солюбилизированного образца при 300000 х г в течение 1 ч при 4 ° С. Супернатант теперь содержит моющую солюбилизированных мишень β-бочка OMP.
    8. Продолжить с разделом 2.3, как показано ниже.
  2. Рефолдинга из телец включения
    Примечание: Для рефолдинга в пробирке, мишень β-бочке OMP выражается непосредственно в тельцах включения. Одним из преимуществ является то, что эти белки могут быть получены при высоких уровнях. Однако недостатком является то, что рефолдинга часто неэффективно и варьируется от одного рефолдинга эксперимента к другому. Тем не менее, есть много примеров белков, которые были успешно ренатурирован для структурных исследований. После выражения в телец включения, теперь нужно изолировать тельца включения для рефолдинга экспериментs.
    1. Ресуспендируют клеток в буфере для лизиса (50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 200 мМ NaCl, 10 мМ MgCl 2, 50 мкг / мл AEBSF, 5 мкг / мл ДНКазы I, 4 мМ 2-меркаптоэтанола (BME)) (5 мл на г пасты клеток). Lyse с использованием либо французская пресса, обработка ультразвуком, или клеточный гомогенизатора.
    2. Гранул тела включения низкой скорости вращения при 6000 мкг в течение 10 мин при 4 ° С.
    3. Промыть тел включени путем ресуспендирования в 25 мл 1,0 М мочевины с использованием гомогенизатора Даунса гомогенизатора. Гранул снова низкой скорости вращения при 6000 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
    4. Повторите шаг 2.2.3 по мере необходимости.
    5. Ресуспендируют промытых телец включения до конечной концентрации 10 мг / мл с использованием буфера , содержащего 8,0 М мочевину (или 6,0 М гуанидин гидрохлорид (GDCL)) плюс моющее средство (то есть, ДДМ или LDAO) на 2х КМЦ или выше.
      Примечание: Если желательно, для мембранных белковых мишеней, содержащих гистидин тег, иммобилизованных металл-аффинной хроматографии для очистки (IMAC) может быть выполнена с использованием денатурирующих COnditions (в 8,0 М мочевины или 6,0 М GdCl) в качестве первого шага, аналогичной описано ниже в разделе 2.3.
    6. Выполните Рефолдинг реакцию медленно (в течение ночи) удаление денатурирующего путем диализа в буфере не хватает денатурирующего агента.
      Примечание: Это может занять несколько изменений буфера для диализа для достижения этой цели. В качестве альтернативы, если тела включени связанных вначале в колонну IMAC, можно сделать повторную укладку реакцию в то время как все еще привязаны к колонке путем медленного обмена буферов для удаления денатурирующего. В любом случае, помните, что это мембранный белок, поэтому, моющее средство должно присутствовать для стабилизации цели. Кроме того, если моющее средство используется является диализуемый, оно должно быть добавлено к диализного буфера (ов), а также.
    7. Спиновые ренатурирован образцы при 200000 х г в течение 1 ч при 4 ° С. Супернатант содержит ренатурирован моющий солюбилизированных мишень β-бочка OMP.
    8. Продолжить с разделом 2.3, как показано ниже.
  3. Очистка с помощью IMAC, ионообменные и гель-фильтрация
    Примечание: Если предположить , что белок был разработан с гистидин тег, то ли изначально выражены или сложила с использованием методов в пробирке, затем иммобилизовали металл-аффинной хроматографии (IMAC) выполняется для очистки так же, как для гистидин помечено растворимые белки, кроме моющего средства должны храниться в все последующие буферы для поддержания целевой β-бочка OMP, растворимое и стабильное.
    1. Подготовить 1-5 мл колонку IMAC или использовать набитых колонку. Выполнение последующей стадии хроматографии при 4 ° С. Промывать водой, чтобы удалить любые следы консервантов. При использовании автоматизированной системы очистки, установки колонки в соответствии с инструкциями изготовителя.
    2. Приготовьте 500 мл IMAC буфера А (50 мМ К 2 НРО 4, рН 7,5, 200 мМ NaCl, 0,1% ДДМ) и 250 мл IMAC буфера В (50 мМ К 2 НРО 4, рН 7,5, 200 мМ NaCl, 0,1% ДДМ, и 1,0 М имидазола).
      Примечание: Другие моющие средства, которые могут быть использованы INCLUDE Cymal-6 (0,05%), Тритон Х-100 (0,03%), и LDAO (0,05%).
    3. Равновесие колонку IMAC, используя 10 объемами колонки ИАЦ Буфере A.
    4. Добавить имидазола в образце белка до конечной концентрации 25 мМ и перемешать. Загрузить образец на уравновешенную колонку IMAC при 2 мл / мин. Собирают поток через.
    5. Промывают колонку IMAC с 5 объемами колонки каждого возрастающих концентраций имидазола с использованием буфера В (то есть, 25 мМ, 50 мМ, 100 мМ). Соберите промывок в 2 мл фракции.
    6. Элюции образца с конечной концентрацией 250 мМ в течение 5 объемов колонки. Сбор элюированного образца в 2 мл фракции.
    7. Анализ потока через промывочный фракции и фракции, элюированные с помощью анализа SDS-PAGE (шаг 1.2.6) в зависимости от их оптической плотности при длине волны 280 нм. Объединяют фракции, содержащие целевой бета-баррель OMP, как подтверждают анализом SDS-PAGE.
    8. Удалите 6х-гистидин тег путем добавления TEV протеазы в объединенном образце (в соответствиис протоколом производителя) и инкубирование в течение ночи при 4 ° С с нежным покачиванием.
    9. Загрузите раствор образца / протеазы на колонку IMAC еще раз, чтобы отделить целевой бета-бочке OMP (поток через) из расщепленных тегов и любого нерасщепленного образца. Поток через будет содержать расщепляется образца, в которых отсутствует тег.
      Примечание: Это также приведет к удалению любого протеазы, как ТРВ-His, который также имеет сам нерасщепляемый 6х-гистидин тег. В противном случае, другие методы будут необходимы для удаления протеазы после переваривания.
    10. При желании выполнить ионообменной хроматографии для дальнейшей очистки пробы. Следуйте инструкциям производителя для колонки, которые будут использоваться, будучи уверенным, что включать моющее средство во всех буферов.
    11. Для подготовки к кристаллизации загрузить образец в колонку для гель-фильтрации в буфер, содержащий моющее средство, чтобы использоваться для кристаллизации, например, 25 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 200 мМ NaCl, 1% OG.
    12. Соберите 1 мл фракции и анализируют USIАнализ нг SDS-PAGE (см Шаг 1.2.6) на основе их оптической плотности при длине волны 280 нм. Бассейн фракции с поглощательной способностью при 280 нм, так как они содержат белок-мишень. Концентрат до ~ 10 мг / мл.
      Примечание: При необходимости надлежащего складывания может быть оценена с использованием анализа теплового модифицируемостью, как описано ниже.
  4. Тепло модифицируемостью Анализ
    Примечание: Один из способов , чтобы контролировать надлежащее сгибание очищенной бета-бочке ОМР должен выполнить модифицируемостью анализов тепла с использованием полупроницаемой нативный SDS-PAGE 22. Здесь, неотапливаемые образцы, которые сгибают должным образом, как правило, мигрируют в отличие от тех, что тепло денатурированный. Это свойство является уникальным для бета-баррель ОМР и широко используется для изучения этого семейства мембранных белков.
    1. До начала подготовки образцов, собрать аппарат геля. Для начала, поместите буферный резервуар в ведерке со льдом и полностью окружить со льдом. Вставьте в доме бросание или коммерческий гель родной градиент в держатель и помещают в резервуар. Заполните тон полностью бак с холода 1x MES проточном буфере (50 мМ 2- [N-морфолино] этансульфоновой кислоты, 50 мМ Трис-основание, 1 мМ ЭДТА, 0,1% SDS, рН 7,3).
    2. Пипетка 0,25 мкл образца (10 мг / мл) в две 1,5 мл микропробирок. Этикетка один как "Вареные", а другой как «RT».
    3. Добавить 9,75 мкл буфера для образца к каждому и перемешать с помощью пипетки. Для обоих образцов, добавить 10 мкл 2x SDS буфера для загрузки (100 мМ Трис-HCl, рН 6,8, 2% SDS, 0,2% бромфенолового синего, и 20% глицерина) и осторожно перемешать с помощью пипетки.
    4. Вскипятите '' Вареный образца при 95 ° С в течение 5 мин при выходе из образца 'RT' при комнатной температуре. Крутить "Вареные" образца на короткое время.
    5. Нагрузка 20 мкл обоих образцов на Подготовленный родной гель. Запуск в течение 60 мин при постоянном 150 В. Удалите гель и замочить в растворе для окрашивания, чтобы визуализировать результаты.

3. Кристаллизация

Примечание: Для кристаллизации обоихрастворимые и мембранные белковые мишени, это стандартный протокол , чтобы максимизировать чистоту образца и стабильность (т.е. лучшее моющее средство, лиганды, кофакторов и т.д.). Текущая методология для кристаллизации целей мембранного белка в целом включает в себя три основных подхода , которые удовлетворяют амфифильных требованиям двухслойных встраиваемый белков: (1) моющее средство, (2) bicelle, и (3) липидный кубической фазы (LCP) (рисунок 6) 23. Настоятельно рекомендуется Использование nanoliter кристаллизации робота , когда это возможно , с тем , чтобы увеличить количество условий , которые могут быть подвергнуты скринингу для данного объема выборки, а также с использованием последних достижений в области инструментов , направленных на помощь определения структуры (рисунок 7).

  1. Кристаллизация с помощью Моющие средства
    1. Получают моющий солюбилизированного образца белка, который при ~ 10 мг / мл концентрации. При желании можно добавить добавку 1,2,3-heptanetriol непосредственно к образцу до конечной концентрации 3%, чтобы уменьшить detergлор размер мицеллы.
    2. Фильтр образца с использованием 0,22 мкм центробежный фильтр для удаления твердых частиц и осадков.
    3. С помощью кристаллизации робота, выполняют широкую матрицу кристаллизации скрининга с использованием коммерчески доступных 96 а экраны либо повешение или сидя падение метод испарения с каплями, состоящих из ~ 200 нл образца белка и ~ 200 нл буфера кристаллизации.
    4. Инкубируют при кристаллизации пластин при ~ 21 ° C. Проверьте пластины еженедельно для роста кристаллов с помощью стереомикроскопа.
    5. Оптимизация кристаллизации приводит варьируя компоненты условия кристаллизации на систематической основе (увеличение / уменьшение соли или осадитель, концентрации буфера с рН, температуры инкубации, и / или концентрация белка).
  2. Кристаллизация Использование бицеллах
    Примечание: Более подробная демонстрация bicelle методов ранее был описан Ujwal и Абрамсон 24.
    1. Подготовить или приобрести 35% bicelle смесь , состоящую из DMPC: CHAPSO в соотношении 2,8: 1 , в соответствии с опубликованными протоколами 25. Другие концентрации также могут быть проанализированы, а также, другие липиды и моющие средства, по мере необходимости.
    2. Получают моющий солюбилизированного образца белка, который при ~ 10 мг / мл концентрации.
    3. Добавляют bicelle смесь, на льду, в качестве исходного в соотношении 4: 1 об / об (белок: bicelle) (например, добавить 10 мкл bicelle смеси до 40 мкл белка и быстро перемешать с помощью пипетки).
    4. Инкубировать на льду в 30-60 мин.
      Примечание: Белок: решение bicelle должно оставаться в основном ясно, но часто может оказаться немного непрозрачным. Тем не менее, если этот белок: bicelle раствор становится молочно - белый, указывающую количество осадков, то другие переменные следует анализировать (то есть моющее средство, буфер, и т.д.). Для новых образцов, делая мелкомасштабные тесты (8 мкл белка и 2 мкл бицеллах) рекомендуется проверить стабильность до расширения, чтобы предотвратить ненужные потери образца.
    5. С помощью кристаллизации робота, выполняют широкую матрицу кристаллизации скрининга с использованием коммерчески доступных 96 а экраны либо повешение или сидя падение метод испарения с каплями, состоящих из ~ 200 нл образца белка и ~ 200 нл буфера кристаллизации.
    6. Инкубируют при кристаллизации пластин при ~ 21 ° C. Проверьте пластины еженедельно для роста кристаллов с помощью стереомикроскопа.
    7. Оптимизация кристаллизации приводит варьируя компоненты условия кристаллизации на систематической основе (увеличение / уменьшение соли или осадитель, концентрации буфера с рН, температуры инкубации, и / или концентрация белка).
  3. Кристаллизация Использование липидной кубической фазы (LCP)
    Примечание: Более подробное демонстрация методов LCP была описана ранее Лю и Черезова 26,27.
    1. Получают моющий солюбилизированного образца белка, который при ~ 20 мг / мл концентрации.
    2. Предварительно прогретом моноолеин до ~ 40 ° С. нагрузка60 мкл моноолеина в одну газонепроницаемой 100 мкл шприца и 40 мкл образца белка в другой.
    3. Используя смесительную переходник, соедините шприцы, соблюдая осторожность, чтобы не вводить воздух.
    4. Осторожно перемешать с применением менного давления на шприц плунжеров толкающих смесь из одного шприца в другой полностью, пока образец не станет прозрачным и однородным.
    5. С помощью кристаллизации робота, предназначенный для методов LCP, выполняют широкую матрицу кристаллизации скрининга с использованием коммерчески доступных 96 экранов также с кристаллизацией пластин сэндвич стиле (0,1 мм толщиной) и с каплями, состоящих из 100 нл образца белка и 750 нл буфера кристаллизации.
      Примечание: коэффициенты падения могут быть скорректированы в случае необходимости. Кроме того , твердые покрытия (т.е. стеклянные или толстый пластик) рекомендуется , которые поддерживают капли красиво , а не тонкие пленки, которые , как правило , чтобы капли двигаться хорошо , как пластины обрабатываются.
    6. Выдержите кристаллизации рLates при ~ 21 ° C. Проверьте пластины еженедельно для роста кристаллов с помощью стереомикроскопа.
    7. Оптимизация кристаллизации приводит варьируя компоненты условия кристаллизации на систематической основе (увеличение / уменьшение соли или осадитель, концентрации буфера с рН, температуры инкубации, и / или концентрация белка).

Результаты

YiuR является TonB железа зависит от переносчика , который является предполагаемый целевой вакцины против Yersinia Pestis. Первоначально он был идентифицирован с помощью анализа микрочипов. Вот, шаги , которые были предприняты для определения структуры YiuR с помощью рентген...

Обсуждение

β-бочка ОМР выполняют важные роли в грамотрицательные бактерии, митохондрии и хлоропласты и являются важными объектами для структурного анализа, которые предлагают огромное количество информации о существенных молекулярных механизмов на внешних мембран этих соответствующих органе...

Раскрытие информации

The authors declare that they have no competing financial interests.

Благодарности

We would like to thank Herve Celia of the CNRS for providing the UV images and Chris Dettmar and Garth Simpson in the Department of Chemistry at Purdue University for providing the SONICC images. We would like to acknowledge funding from the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases and the Intramural Research Program at the National Institutes of Health. Additionally, we would like to acknowledge additional funding from the National Institute of General Medical Sciences (A.M.S. and C.J.), National Institute of Allergy and Infectious Diseases (N.N. 1K22AI113078-01), and the Department of Biological Sciences at Purdue University (N.N.).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Crystallization RobotTTP Labtech, Art Robbins-Any should work here, except for LCP crystallization
PCR thermocyclerEppendorf, BioRad-
Media ShakerNew Brunswick, Infors HT-
UV-vis spectrometerEppendorf-
SDS-PAGE apparatusBioRad1645050, 1658005
SDS-PAGE and native gelsBioRad, Life Technologies4561084, EC6035BOX (BN1002BOX)
AkTA PrimeGE Healthcare-
AkTA PurifierGE Healthcare-
MicrocentrifugeEppendorf-
Centrifuge (low-medium speed)Beckman-Coulter-
Ultracentrifuge (high speed)Beckman-Coulter-
SS34 rotorSorvall-
Type 45 Ti rotorBeckman-Coulter-
Type 70 Ti rotorBeckman-Coulter-
Dounce homogenizerFisher Scientific06 435C
EmulsiflexAvestin-
Dialysis tubingSigmaD9652
LCP toolsHamilton, TTP Labtech-
VDX 24 well platesHampton ResearchHR3-172
Sandwich platesHampton Research, Molecular DimensionsHR3-151, MD11-50 (MD11-53)
Grace Crystallization sheetsGrace Bio-Labs875238
HiPrep S300 HR columnGE Healthcare17-1167-01
Q-Sepharose columnGE Healthcare17-0510-01
Crystallization screensHampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions-
Gas-tight syringe (100 ml)Hamilton 

Ссылки

  1. Walther, D. M., Rapaport, D., Tommassen, J. Biogenesis of beta-barrel membrane proteins in bacteria and eukaryotes: evolutionary conservation and divergence. Cell Mol Life Sci. 66, 2789-2804 (2009).
  2. Ricci, D. P., Silhavy, T. J. The Bam machine: A molecular cooper. Biochim Biophys Acta. 1818, 1067-1084 (2012).
  3. Hagan, C. L., Silhavy, T. J., Kahne, D. beta-Barrel membrane protein assembly by the Bam complex. Ann Rev of Biochem. 80, 189-210 (2011).
  4. Noinaj, N., et al. Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria. Nature. 483, 53-58 (2012).
  5. Noinaj, N., et al. Structural insight into the biogenesis of beta-barrel membrane proteins. Nature. 501, 385-390 (2013).
  6. Gatzeva-Topalova, P. Z., Walton, T. A., Sousa, M. C. Crystal structure of YaeT: conformational flexibility and substrate recognition. Structure. 16, 1873-1881 (2008).
  7. Kim, S., et al. Structure and function of an essential component of the outer membrane protein assembly machine. Science. 317, 961-964 (2007).
  8. Geibel, S., Procko, E., Hultgren, S. J., Baker, D., Waksman, G. Structural and energetic basis of folded-protein transport by the FimD usher. Nature. 496, 243-246 (2013).
  9. Phan, G., et al. Crystal structure of the FimD usher bound to its cognate FimC-FimH substrate. Nature. 474, 49-53 (2011).
  10. van den Berg, B., Black, P. N., Clemons, W. M., Rapoport, T. A. Crystal structure of the long-chain fatty acid transporter FadL. Science. 304, 1506-1509 (2004).
  11. Fairman, J. W., Noinaj, N., Buchanan, S. K. The structural biology of beta-barrel membrane proteins: a summary of recent reports. Curr Op Struct Bio. 21, 523-531 (2011).
  12. Noinaj, N., Guillier, M., Barnard, T. J., Buchanan, S. K. TonB-dependent transporters: regulation, structure, and function. Ann Rev of Micro. 64, 43-60 (2010).
  13. Siburt, C. J., et al. Hijacking transferrin bound iron: protein-receptor interactions involved in iron transport in N. gonorrhoeae. Metallomics. 1, 249-255 (2009).
  14. Cornelissen, C. N., Hollander, A. TonB-Dependent Transporters Expressed by Neisseria gonorrhoeae. Front in Micro. 2 (117), (2011).
  15. Dautin, N., Bernstein, H. D. Protein secretion in gram-negative bacteria via the autotransporter pathway. Ann Rev of Micro. 61, 89-112 (2007).
  16. Leo, J. C., Grin, I., Linke, D. Type V secretion: mechanism(s) of autotransport through the bacterial outer membrane. Phil Trans of the Royal Soc of London. Series B, Biological Sciences. 367, 1088-1101 (2012).
  17. Buchanan, S. K., Yamashita, S., Fleming, K. G., Engelman, E. H., Tamm, L. K. . Comprehensive Biophysics. 5, 139-163 (2011).
  18. Buchanan, S. K., et al. Structure of colicin I receptor bound to the R-domain of colicin Ia: implications for protein import. EMBO J. 26, 2594-2604 (2007).
  19. Yamashita, S., et al. Structural insights into Ail-mediated adhesion in Yersinia pestis. Structure. 19, 1672-1682 (2011).
  20. Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Res. 18, 6069-6074 (1990).
  21. Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. Rapid reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors. BioTechniques. 13, 515-518 (1992).
  22. Rosenbusch, J. P. Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecyl sulfate binding. J Biol Chem. 249, 8019-8029 (1974).
  23. Barnard, T. J., Wally, J. L., Buchanan, S. K., Coligan, J. E. Crystallization of integral membrane proteins. Curr Prot in Prot Science. Chapter 17, Unit 17 19 (2007).
  24. Ujwal, R., Abramson, J. High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method. JoVE. , e3383 (2012).
  25. Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles. Curr Topics in Membranes. 63, 111-127 (2009).
  26. Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. JoVE. , e4000 (2012).
  27. Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. JoVE. , (2011).
  28. Buchanan, S. K. Overexpression and refolding of an 80-kDa iron transporter from the outer membrane of Escherichia coli. Biochem Soc Trans. 27, 903-908 (1999).
  29. Buchanan, S. K. Beta-barrel proteins from bacterial outer membranes: structure, function and refolding. Curr Op in Struct Bio. 9, 455-461 (1999).
  30. Stanley, A. M., Fleming, K. G. The process of folding proteins into membranes: challenges and progress. Arch of Biochem and Biophysics. 469, 46-66 (2008).
  31. Pautsch, A., Schulz, G. E. Structure of the outer membrane protein A transmembrane domain. Nature Struct Bio. 5, 1013-1017 (1998).
  32. Cowan, S. W., et al. The structure of OmpF porin in a tetragonal crystal form. Structure. 3, 1041-1050 (1995).
  33. Ujwal, R., et al. The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 A resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating. PNAS. 105, 17742-17747 (2008).
  34. Robert, V., et al. Assembly factor Omp85 recognizes its outer membrane protein substrates by a species-specific C-terminal motif. PLoS Bio. 4, e377 (2006).
  35. Paramasivam, N., Habeck, M., Linke, D. Is the C-terminal insertional signal in Gram-negative bacterial outer membrane proteins species-specific or not?. BMC Genomics. 13, 510 (2012).
  36. Agah, S., Faham, S. Crystallization of membrane proteins in bicelles. Methods in Mol Bio. 914, 3-16 (2012).
  37. Ujwal, R., Bowie, J. U. Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles. Methods. 55, 337-341 (2011).
  38. Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Cur Op in Struct Bio. 21, 559-566 (2011).
  39. Luecke, H., Schobert, B., Richter, H. T., Cartailler, J. P., Lanyi, J. K. Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 A resolution. J Mol Biol. 291, 899-911 (1999).
  40. Kato, H. E., et al. Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel. Nature. 482, 369-374 (2012).
  41. White, J. F., et al. Structure of the agonist-bound neurotensin receptor. Nature. 490, 508-513 (2012).
  42. Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
  43. Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
  44. Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55, 379-386 (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

113

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены