JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

β-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of β-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.

Abstract

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, α-helical and β-barrel. While α-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, β-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite β-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target β-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.

Introduction

β-חבית OMPs ניתן למצוא רק את הקרומים החיצוניים של המיטוכונדריה, כלורופלסטים, וחיידקים גראם שליליים 1-3. בעוד הם משמשים תפקידים דומים כמו חלבוני הסליל α, יש להם קפל שונה מאוד מורכב תחום β-חבית קרום מוטבעת מרכזי החל 8-26 אנטי במקביל β-גדילים עם כל גדיל להיות מחובר בטבורו שני גדילים שהכנות (איורים 1 ו -2). הגדילים הראשונים והאחרונים של תחום β-החבית אז אינטראקציה זה עם זה, כמעט באופן בלעדי בצורה אנטי-מקבילה (למעט VDAC המיטוכונדריה), כדי לסגור ולאטום את תחום β-החבית מן הקרום שמסביב. כל β-חבית OMPs לולאות תאיות של רצף משתנה ואורך אשר ממלאות תפקיד חשוב באינטראקציות ליגנד ו / או אנשי קשר חלבונים, עם הלולאות אלה לפעמים להיות גדולות כמו 75 שאריות, כגון נמצא transferrin Neisserial מחייב פרוהחלבון A (TbpA) 4. β-חבית OMPs יכול גם יש N-terminal או C- מסוף רחבות periplasmic המשמשים תחומים נוספים כמו לצורך הפעילות של החלבון (למשל, במה 5-7, FimD 8,9, פאדל 10). בעוד סוגים רבים של OMPs β-חבית קיימים 11, שני הסוגים הנפוצים יותר מתוארים להלן כדוגמאות עבור אלה פחות שמכיר את השטח, (1) מובילי תלויי TonB ו (2) autotransporters.

TonB תלוי מובילים (למשל, FepA, TbpA, BtuB, Cir, וכו ') הם חיוניים עבור יבוא מזין ומכילים תחום תקע N-terminal מורכב ~ 150 שאריות כי הוא נמצא תחוב בתוך בטרמינל C-22 גדילי β- תחום החבית מוטבע לתוך הקרום החיצוני 12 (איור 3). בעוד תחום תוסף זה מונע מצע מלעבור בחופשיות דרך התחום לחבית, מצע מחייב גורם לשינוי קונפורמציה בתוך תחום התקע הב מוביל היווצרות נקבובית (בין אם על ידי סידור מחדש את רדיו או על ידי פליטה חלקית / מלאה של התקע) אז מה שיכול להקל תחבורת מצע דרך הממברנה החיצונית לתוך periplasm. מובילי TonB התלוי חשובים במיוחד להישרדותו של כמה זנים פתוגניים של חיידקים גראם שליליים כגון meningitidis Neisseria שהתפתח מובילים מיוחדים לחטוף חומרים מזינים כגון ברזל ישירות 4,13,14 חלבוני מארח אנושיים.

Autotransporters השייכים למערכת הפרשת סוג V של חיידקים גראם שליליים והם בטא חבית OMPs המורכבות של תחום β-חבית (בדרך כלל 12-גדילי כמו עם אסטה ו ESPP) ואת תחום הנוסע כי הוא גם מופרש או שהוצג בכנס פני השטח של התא 15,16 (איור 3). OMPs β-החבית אלה לעתים קרובות משמש תפקידים חשובים בהישרדות תא ארסי עם תחום הנוסעים המשרת גם בתור פרוטאז, adhesin, ו / או EF אחרfector שמתווך בפתוגנזה.

שיטות מבנית כגון קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, ספקטרוסקופיה NMR, במיקרוסקופ אלקטרונים (EM) מאפשרים לנו לקבוע מודלים עבור OMPs ברזולוציה אטומית אשר בתורו יכול לשמש כדי לפענח בדיוק איך הם מתפקדים בתוך הממברנה החיצונית. מידע שלא יסולא בפז מצב זה יכול לשמש לפיתוח תרופות חיסון אם זה אפשרי. לדוגמה, חלבון מחייב transferrin (TbpA) נמצא על פני השטח של Neisseria והוא נחוץ לצורך בפתוגנזה כי הוא נקשר transferrin אדם ישירות ולאחר מכן שואבת ומייבא את ברזל להישרדות משלו. ללא TbpA, Neisseria לא יכול לחטט ברזל מהמארח האדם ניתנים שאינם פתוגניים. לאחר המבנה הגבישי של transferrin אדם כבול TbpA 4 נפתר, זה הפך להיות הרבה יותר ברור איך שני חלבונים הקשורים, באילו אזורים של TbpA בתיווך האינטראקציה, מה שאריות היו חשובים להפקת ברזל על ידי TbpA, ואיך אפשר לפתח תרופה נגד Neisseria מיקוד TbpA. לכן, בהתחשב בחשיבות של OMPs β-לחבית גראם שלילי חיידקים להישרדות בפתוגנזה, כמו גם במיטוכונדריה ותפקוד הכלורופלסט, ואת הצורך במידע מבני נוסף על מעמד ייחודי זה של חלבונים בממברנה ואת המערכות שבן הוא פועלים , מוצגים פרוטוקולים כללי כשהמטרה להביע וטיהור OMPs היעד ברמות גבוהות לאפיון על ידי שיטות מבניות.

Protocol

שיבוט ביטוי 1.

הערה: כדי לאפשר מחקרים מבניים, כמויות מספיקות של חלבון נקי במיוחד צריכות להיות מוכנות, וזה מתחיל בדרך כלל עם שיבוט ביטוי היתר של היעד β-חבית חלבון הממברנה חיצונית (OMP) ב E. coli (איור 4). נכון להיום, כל המבנים OMP β-חבית, כולל אלה מבנים עבור VDAC המיטוכונדריה, כבר נגזר הביע bacterially חלבון 11. הנה, פרוטוקולים כלליים מוצגים לשכפול להביע β-חבית OMPs עבור (1) הבעת יליד ישירות לתוך ממברנות חיידקים (2) ביטוי לתוך גוף תכלילים עבור במבחנת refolding 17.

  1. תכנון לבנות ביטוי
    1. להשיג או לרכוש את גן OMP היעד אופטימיזציה קודון.
    2. רכישה או לקבל וקטור ביטוי T7 (i) המכיל רצף האות לוקליזציה periplasmic, תג 6x-היסטידין N-terminal,ואתר פרוטאז TEV 4,18,19 להבעה vivo הקרום או (ii) ללא רצף אות לוקליזציה periplasmic לביטוי לגופים מהכללת refolding במבחנה.
      הערה: N-terminal פרוטאז cleavable 6x או 10x-היסטידין תג יספק שיטה קלה לניקוי. כמו חלבונים מסיסים, לשנות את הבחירה של תג זיקה (היסטידין, סטרפטוקוקוס, GST, וכו '), את המיקום של תג זיקה והכללה של אתר פרוטאז (TEV, enterokinase, תרומבין, וכו') להסרת תג עוקבות .
    3. PCR להגביר את רצף היעד עם פריימרים מתאימים subclone לתוך וקטור ביטוי. השתמש שיבוט עצמאי קשירה (LIC) 20,21 או טכניקות שיבוט קונבנציונלי (הגבלת אנזימים / קשירה) עבור subcloning. עם זאת, LIC יכול להקל קצב העברת נתונים גבוה, המאפשר מספר רב של מבנים שונים (truncations, מגוון של תגים, מגוון של היזמים) שניתן לשכפל במקביל יותרבְּקַלוּת.
  2. In vivo הביטוי ממברנה במיקוד
    1. השתמש בניתוח רצף לאמת את היעד β-חבית OMP הוא משובטים במורד הזרם וב מסגרת עם רצף האות (כלומר, pelB, OmpA) ב לבנות ביטוי.
      הערה: רצף האות מכוון את שרשרת המתהווה אל translocon Sec להפרשה אל periplasm וההרכבה הבאה לתוך הקרום החיצוני.
    2. להפוך את המבנה לתוך זן ביטוי של חיידקים לביטוי על ידי pipetting 1.0 מיקרוליטר של פלסמיד לתוך 50 μl של BL21 (DE3) תאים מוסמכים כימי ומערבבים בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה. דגירה על קרח למשך 30 דקות.
    3. דופק מחמם על 42 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות באמצעות אמבט מים ולאחר מכן למקם בחזרה על קרח למשך 1 דקה.
    4. הוסף 1 מ"ל של התקשורת SOC מחומם מראש ולנער ב 37 ºC עבור שעה 1 ב -1,000 סל"ד באמצעות חממה שייקר המעבדתיים.
    5. פלייט 100 μl של תאים על גבי צלחות אגר LB המכיל antibiot המתאיםic דגירת הלילה בשעת 37 ºC הפוך.
    6. בצע בדיקות ביטוי בקנה מידה קטן על ידי יחסנו תרבות אנטיביוטי 5 מ"ל LB + עם מושבה אחת. חזור על 5-10 מושבות.
      הערה: בגלל הרעילות האפשרית של OMP β-הקנה ואת ההסתמכות על רמות ביטוי בסיסיות, השתנות מושבה אל המושבה הוא ציין לפעמים. לכן, הקרנת מושבות מרובות מומלץ עבור כל מבנה נבדק. עבור בדיקות ביטוי בקנה מידה קטנה, ולא קונבנציונליות 5 מיליליטר תרבויות, גדלו 25 מיליליטר תרבויות 125 מיליליטר מבולבל צלוחיות Erlenmeyer הוא הציע. תנאים אלה בדרך כלל לשקף טוב יותר מה יקרה בעוד צמיחה בקנה מידה גדולה. בנוסף, זה רעיון טוב גם למסך סוגים שונים של תקשורת בתרבות (TB, LB, 2xYT, M9, וכו '), מאז רמות של הצלחה משתנות דווחו בהתאם חלבון המטרה.
      1. לגדול ב 37 ºC עם רעד כדי OD 600 של ~ 0.6.
      2. להשרות ביטוי של OMP היעד על ידי מודעותדינג 5 μl של 1 M איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) על צינור אחד תרבות ולאפשר לגדול יחס סיכון נוסף 1-2.
      3. השוואת רמות ביטוי לכל המושבות על ידי צנטריפוגה 1 מ"ל של כל תרבות (OD 600 של ~ 0.6) עבור 1 דקות ב 15,000 XG באמצעות microcentrifuge.
      4. הסר את supernatant ו resuspend התאים 200 μl של חיץ טעינת 1x SDS-PAGE. מחממים על 100 ºC למשך 5 דקות ולאחר מכן צנטריפוגות שוב ב 15,000 XG במשך 5 דקות.
      5. ניתוח דגימות באמצעות SDS-PAGE ידי pipetting 20 μl לבאר כל ג'ל 10%. הרץ את הג'ל על 35 דק 'ב 200 V. מתמיד
        הערה: זה יהיה מועיל בשלב זה כדי להיות מסוגל לקבוע אם יעד החלבון מתבצע מקופל כראוי או לא. במקרים רבים ניתן להשיג זאת על ידי עושה purifications בקנה מידה קטן או על ידי מנסה לאמוד על יכולת ההשתנות חום.
    7. בחר המושבה מראה את הביטוי הטוב ביותר ולבצע ביטוי בקנה מידה גדול באמצעות 12-24 ליטר של המדיום.
      הערה: שיטות קונבנציונליות בדרך כלל לגדול התרבויות ב 37 ºC עם רעד כדי OD 600 של ~ 0.6 ולאחר מכן להשרות עם inducer המתאים (כלומר, 0.1-1 מ"מ עבור IPTG או ~ 0.2% עבור arabinose) עבור 2-4 שעות נוספות . אם ירצה, לפני הגיוס, להפחית את הטמפרטורה לרמה הנמוכה של כ 20 מעלות צלזיוס, להאריך את מועד האינדוקציה.
      1. בשיטת ביטוי דולפת, לגדל 25 מיליליטר לחסן תרבות ב 37 מעלות צלזיוס בינוני LB המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה (ים) עד OD 600 מגיע ~ 0.6. לאחר מכן, להוסיף 1 מ"ל של לחסן עד עשר 1 צלוחיות L של מדיום TB בתוספת אנטיביוטיקה (ים) ו לגדול ב 20 ° C עד הרוויה (~ 3 ימים).
    8. קציר התאים על ידי צנטריפוגה ב 6000 XG במשך 10 דקות.
    9. המשך לסעיף טיהור צעד 2.1 או להקפיא את התא גלולה בחנקן נוזלי עבור אחסון לטווח ארוך ב -80 ºC.
  3. ביטוי גופי הכללה עבור במבחנה Refolדינג
    1. השתמש בניתוח רצף לאמת את מבנה הביטוי אינו מכיל רצף אות. עדר רצף אות ינחה את חלבון המטרה להצטבר cytosol כגופי הכללה.
    2. להפוך את מבנה הביטוי לתוך זן ביטוי של חיידקים לביטוי. עבור ביטוי גוף הכללה, עדיף לשלוט ביטוי על ידי אינדוקציה (כלומר, IPTG, arabinose, וכו ') כדי למזער את השפעות רעילות אפשריות.
    3. פלייט 100 μl של תאים טרנספורמציה על צלחות אגר LB המכיל אנטיביוטיקה מתאימה דגירה לילה בשעה 37 ºC הפוכה.
    4. בצע בדיקות ביטוי בקנה מידה קטן על ידי יחסנו תרבות אנטיביוטי 5 מ"ל LB + עם מושבה אחת.
    5. 1.3.4 חזור על שלב 2-4 מושבות נוספות.
    6. לגדול ב 37 ºC עם רעד כדי OD 600 של ~ 0.6.
    7. להשרות עם inducer מתאים 1-2 שעות.
    8. השוואת רמות ביטוי לכל tהוא מושב על ידי ניתוח באמצעות SDS-PAGE (ראה שלב 1.2.6). בחר המושבה מראה את הביטוי הטוב ביותר ולבצע ביטוי בקנה מידה גדול באמצעות 12-24 ליטר של המדיום.
      1. לגדל את התאים ב 37 ° C ל OD 600 של 0.6-0.8 ולגרום ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3-5 שעות. בעוד ביטוי לגופי הכללה הוא חזק יותר מאשר סוגים אחרים של ביטוי, כמו עם כל ניסויי ביטוי החלבון, ביטוי ניתן לשפר על ידי שינוי מדיום גידול, זמן של אינדוקציה, טמפרטורה של אינדוקציה, וריכוז של סוכן הגרימה.
    9. קציר התאים על ידי צנטריפוגה ב 6000 XG במשך 10 דקות.
    10. המשך לסעיף טיהור צעד 2.2 או להקפיא את התא גלולה בחנקן נוזלי עבור אחסון לטווח ארוך ב -80 ºC.

טיהור 2.

  1. במנותק מן השברים ממברנה
    הערה: בניגוד חלבונים מסיסים, חלבונים בממברנה אינטגרלי המוטבעים לתוך bilayer השומנים ולכןדורש דטרגנטים כדי לחלץ אותם להיטהרות לניתוח נוסף (איור 5). בעקבות ביטוי, הצעד הראשון בתחום הטיהור של OMP β-חבית הוא חילוץ מתוך השבר הממברנה.
    1. Resuspend תאים תמוגה חיץ (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 200 מ"מ NaCl, 10 מ"מ MgCl 2, 50 מיקרוגרם / מ"ל AEBSF, 5 מיקרוגרם / מ"ל DNase I) ביחס של 5 מ"ל / g תא הדבק.
    2. Lyse תא באמצעות homogenizer עיתונות או תא צרפתי. ספין התאים lysed ב 15,000 XG במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס כדי להסיר שאריות תאים ותא unlysed.
    3. מעבירים את supernatant לצינור צנטריפוגות נקי שוב במהירות גבוהה (200,000 XG) במשך שעה 1 ב 4 ºC. הגלולה וכתוצאה מכך היא שבריר הקרום המכיל את החלבון של עניין.
    4. באמצעות homogenizer dounce, resuspend השבר קרום, הראשון בהעברת ממברנות ולאחר מכן הוספת חיץ solubilization (50 מ"מ KH 2 PO 4 pH 7.5, 200 מ"מ NaCl, 20 מ"מ imidazole, PH 8.0) (50 מ"ל לכל 20 תאים ז) בריכוז 2x, ללא חומרי ניקוי.
    5. יוצקים את ממברנות resuspended לתוך מבחנה קטנה ומוסיפים אבקת כביסה (כלומר, n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM), lauryldimethylamine-N-תחמוצת (LDAO), n-octyl-β-D-glucopyranoside (OG), טריטון X-100, וכו ') לאט לריכוז סופי של ~ 10x ריכוז micelle ביקורתית (CMC).
    6. וממלאים במים עד לריכוז סופי של חיץ 1x solubilization. מערבבים עבור 0.5-16 שעות ב 4 ºC, תלוי כמה חלבון המטרה בקלות מופק ממברנות.
      הערה: דטרגנט משמש solubilize ממברנות לאט כדי לחלץ את חלבון המטרה. ישנם 3 סוגים של חומרי ניקוי, שניתן להשתמש בהם כאן: יונית (SDS, חומצה deoxycholic), שאינם יוניים (Elugent, Tween, טריטון X-100, OG, DDM), ו zwitterionic (LDAO, בחורים). קומפלקס חלבון-דטרגנט כי היא יציבה monodisperse במהלך שלב טיהור יהיה מאוד לסייע בהצלחת crystallizat חלבון הממברנהיוֹן. מידע נוסף על חומרי ניקוי, תכונותיהם, מידע CMC, והשימוש בהם בתהליך של טיהור חלבונים בממברנה ויישומים אחרים ניתן למצוא באתרים הספק מסחרי.
    7. צנטריפוגה מדגם solubilized ב 300.000 XG עבור שעה 1 ב 4 ºC. את supernatant מכיל כעת את OMP β-חבית היעד דטרגנט-solubilized.
    8. המשך לסעיף 2.3 כמפורט להלן.
  2. Refolding מגופי הכללה
    הערה: refolding במבחנה, היעד β-חבית OMP מתבטאת באופן ישיר לתוך גוף הכללה. אחד יתרונות כאן הם כי חלבונים אלה יכולים להיות מיוצרים ברמות גבוהות. עם זאת החיסרון הוא כי refolding הוא לעתים קרובות לא יעיל משתנה מניסוי refolding אחד למשנהו. ובכל זאת, ישנן דוגמאות רבות של חלבונים כי כבר וקפלו בהצלחה ללימודים מבניים. בעקבות ביטוי לתוך גופי הכללה, אחד עכשיו צריך לבודד את הגופות מהכללת refolding ניסויים.
    1. Resuspend תאים תמוגה חיץ (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 200 מ"מ NaCl, 10 מ"מ MgCl 2, 50 מיקרוגרם / AEBSF מ"ל, 5 מיקרוגרם / מ"ל אני DNase, 4 מ"מ 2-mercaptoethanol (BME)) (5 מ"ל לכל דבק תא גרם). Lyse או באמצעות העיתונות הצרפתית, sonication, או homogenizer התא.
    2. גלולה גופי ההכללה על ספין במהירות נמוך ב -6,000 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    3. שטפו את גופי הכללה על resuspending ב 25 מ"ל של 1.0 M אוריאה באמצעות homogenizer dounce. גלול שוב על ידי ספין במהירות נמוך ב -6,000 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    4. חזור על שלב 2.2.3 לפי הצורך.
    5. Resuspend הגופים הכללת שטף לריכוז סופי של 10 מ"ג / מ"ל באמצעות מאגר המכיל 8.0 אוריאה M (או 6.0 M hydrochloride guanidinium (GdCl)) בתוספת דטרגנט (כלומר, DDM או LDAO) ב 2x CMC ומעלה.
      הערה: אם תרצה, עבור מטרות חלבון קרום המכיל תג היסטידין, כרומטוגרפיה מתכת-זיקה משותקת (IMAC) טיהור יכול להתבצע באמצעות שיתוף denaturingnditions (ב 8.0 M אוריאה או 6.0 M GdCl) כשלב מכין דומה לזה המתואר להלן בסעיף 2.3.
    6. בצעו את התגובה refolding ידי לאט (לילה) הסרת denaturant ידי דיאליזה חיץ חסר denaturant.
      הערה: זה עלול לקחת מספר שינויים של חיץ דיאליזה כדי להשיג את זה. לחלופין, אם גופי ההכללה מאוגדים ראשונים טור IMAC, אחד יכול לעשות את תגובת refolding ועדיין מחויב לעמודה ידי החלפת מאגרים לאט להסיר את denaturant. בכל מקרה, יש לזכור כי מדובר חלבון הממברנה, ולכן, חומרי ניקוי חייבים להיות נוכחים כדי לייצב את היעד. כמו כן, אם חומר הניקוי בשימוש הוא dialyzable, זה יש להוסיף למאגר דיאליזה (ים) וכן.
    7. ספין הדגימות וקפלו ב 200,000 XG עבור שעה 1 ב 4 ºC. את supernatant המכיל את OMP β-חבית יעד דטרגנט-solubilized וקפל.
    8. המשך לסעיף 2.3 כמפורט להלן.
  3. טיהור ושפהMAC, יון-Exchange ולאחר סינון ג'ל
    הערה: בהנחת החלבון תוכננה עם תג היסטידין, אם הביע באופן מקורי או וקפל בשיטות חוץ גופייה, משותק אז כרומטוגרפיה מתכת-זיקה (IMAC) מתבצעת לטיהור דומה עבור היסטידין מתויג חלבונים מסיסים, למעט חומר ניקוי חייב להישמר כל המאגרים הבאים כדי לשמור על OMP β-חבית היעד solubilized ויציב.
    1. הכן טור 1-5 מ"ל IMAC או להשתמש טור prepacked. בצע שלבים כרומטוגרפיה הבאים ב 4 ° C. לשטוף עם מים כדי להסיר כל עקבות של חומרים משמרים. אם באמצעות מערכת טיהור אוטומטית, להתקין את הטור על פי הוראות היצרן.
    2. הכן 500 מ"ל של IMAC הצפת (50 מ"מ K 2 HPO 4, pH 7.5, 200 מ"מ NaCl, 0.1% DDM) ו -250 מ"ל של IMAC הצפת B (50 מ"מ K 2 4 HPO, pH 7.5, 200 מ"מ NaCl, 0.1% DDM, ו 1.0 M imidazole).
      הערה: חומרי ניקוי אחרים שעשויים לשמש include Cymal-6 (0.05%), טריטון X-100 (0.03%), ו LDAO (0.05%).
    3. לאזן את העמודה IMAC באמצעות 10 כרכים הטור של א הצפת IMAC
    4. להוסיף imidazole המדגם חלבון לריכוז סופי של 25 מ"מ ומערבבים. טען המדגם על הטור IMAC equilibrated ב 2 מ"ל / דקה. אסוף את הזרימה דרך.
    5. לשטוף את העמודה IMAC עם 5 כרכים עמודה אחת ריכוז גדל והולך של imidazole באמצעות הצפת B (כלומר, 25 מ"מ, 50 מ"מ, 100 מ"מ). אסוף הכביסות ב 2 מ"ל שברים.
    6. Elute המדגם עם ריכוז סופי של 250 מ"מ עבור 5 כרכים עמודה. אסוף המדגם eluted ב 2 מ"ל שברים.
    7. לנתח את הזרימה דרך, שהברים לשטוף ואת שברי elution באמצעות ניתוח SDS-PAGE (ראו שלב 1.2.6) בהתבסס על הספיגה שלהם ב 280 ננומטר. פינת שברים המכיל את היעד β-חבית OMP כשם מאומת על ידי ניתוח SDS-PAGE.
    8. הסר את תג 6x-היסטידין ידי הוספת פרוטאז TEV המדגם נקווה (פיהפרוטוקול של היצרן) דוגר הלילה ב 4 מעלות צלזיוס עם נדנדה עדינה.
    9. טען את הפתרון מדגם / פרוטאז על עמודת IMAC שוב להפריד את OMP היעד β-חבית (לזרום) מהתגים ביקע וכל מדגם uncleaved. את הזרימה דרך תכיל המדגם בקע חסר התג.
      הערה: זה היה גם להסיר כל פרוטאז כמו TEV-שלו, שיש לה גם תג הלא cleavable 6x-היסטידין עצמה. אחרת, שיטות אחרות, יהיה צורך להסיר את פרוטאז לאחר עיכול.
    10. לחלופין, לבצע כרומטוגרפיה-חילוף יונים כדי לטהר את במדגם נוסף. פעל על פי הוראות היצרן עבור העמודה כדי לשמש, יש להקפיד לכלול חומר ניקוי בכל המאגרים.
    11. כדי להתכונן התגבשות, טען את המדגם על עמודה ג'ל סינון לתוך מאגר המכיל חומר הניקוי לשמש התגבשות, כגון 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 200 מ"מ NaCl, 1% OG.
    12. אסוף 1 מ"ל שברים ולנתח using ניתוח SDS-PAGE (ראו שלב 1.2.6) בהתבסס על הספיגה שלהם ב 280 ננומטר. שברי ברכה עם absorbances ב 280 ננומטר כפי שהם מכילים חלבון המטרה. להתרכז כדי ~ 10 מ"ג / מ"ל.
      הערה: אם תרצו, קיפול נכון ניתן להעריך באמצעות assay השתנות חומה כמפורטת להלן.
  4. Assay חום ההשתנות
    הערה: שיטה אחת כדי לפקח קיפול נכון של חבית β מטוהרת OMPs הוא לבצע מבחני יכולת השתנות חומות באמצעות למחצה יליד SDS-PAGE 22. כאן, דגימות מוסקות כי מקופלות כראוי בדרך כלל תעבורנה להיות שונות מאלו אשר מפוגלים חומים. מאפיין זה הוא ייחודי בטא חבית OMPs בשימוש נרחב ללמוד המשפחה הזו של חלבונים בממברנה.
    1. לפני הכנת דגימות, להרכיב את מנגנון ג'ל. כדי להתחיל, במקום טנק החיץ לתוך דלי קרח המקיפים לחלוטין עם קרח. הכנס יצוק בתוך הבית או ג'ל שיפוע יליד מסחרי לתוך המחזיק והמקום לתוך הטנק. מלאו tהוא טנק לחלוטין עם MES 1x קר הפעלת מאגר (50 מ"מ 2 [N-morpholino] חומצה ethanesulfonic, 50 בסיס מ"מ טריס, 1 mM EDTA, 0.1% SDS, pH 7.3).
    2. פיפטה 0.25 μl של המדגם (10 מ"ג / מ"ל) לשני צינורות 1.5 מ"ל microcentrifuge. לייבל אחד כמו 'מבושל' והשני בשם "RT".
    3. להוסיף 9.75 μl של חיץ מדגם לכל ומערבבים ידי pipetting. כדי דגימות הן, להוסיף 10 μl של חיץ טעינת 2x SDS (100 מ"מ טריס-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 0.2% bromophenol כחול, ו -20% גליצרול) ומערבבים בעדינות על ידי pipetting.
    4. מרתיחים את מדגם 'מבושל' ב 95 ºC למשך 5 דקות תוך השארת מדגם 'RT' ב RT. ספין בקצרה 'מבושל' מדגם.
    5. טען 20 μl של שני דגימות על ג'ל יליד preassembled. לרוץ 60 דקות ב 150 V. קבוע מסיר את הג'ל ומשרי פתרון מכתים כדי לחזות את התוצאות.

התגבשות 3.

הערה: התגבשות של שנימטרות חלבון מסיסות קרום, זה פרוטוקול סטנדרטי כדי למקסם טוהר מדגם ויציבות (כלומר, חומר הניקוי הטוב ביותר, הליגנדים, קו-פקטורים, וכו '). המתודולוגיה הנוכחית עבור גיבוש מטרות חלבון הממברנה בכלל מקיפה שלוש גישות עיקריות המקיימים את דרישות amphiphilic של חלבונים-מוטבע bilayer: (1) חומרי ניקוי, (2) bicelle, ו (3) בשלב מעוקב lipidic (LCP) (איור 6) 23. שימוש רובוט התגבשות nanoliter מומלץ במידת האפשר על מנת להגדיל את מספר מצבים שעלולים להיות מוקרן על נפח דגימה נתון, כמו גם, ניצול התקדמות כלים שנועדו לסייע קביעת מבנה (איור 7).

  1. דטרגנטים התגבשות באמצעות
    1. השג מדגם חלבון דטרגנט solubilized כי הוא ב ~ 10 מ"ג / מ"ל ​​ריכוז. בנוסף, אפשר להוסיף 1,2,3-heptanetriol כתוסף ישירות מדגם לריכוז סופי של 3% כדי להפחית detergגודל micelle אף אוזן גרון.
    2. סנן את המדגם באמצעות מסנן צנטריפוגלי 0.22 מיקרומטר להסיר חלקיקים ומשקעים.
    3. באמצעות רובוט התגבשות, לבצע התגבשות מטריקס רחבה הקרנה באמצעות 96 מסכים היטב זמינים מסחרי או על ידי תלייה או יושבים שיטת אידוי טיפה עם טיפות מורכבות ~ 200 מדגם חלבון NL ו ~ 200 חיץ התגבשות NL.
    4. דגירת צלחות ההתגבשות ב ~ 21 ° C. בדוק את הצלחות שבועיות לצמיחה קריסטל באמצעות סטראו.
    5. מטב מוביל התגבשות ידי שינוי מרכיבי תנאי ההתגבשות באופן שיטתי (הגדלה / הקטנת מלח או ריכוזי נמהר, pH חיץ, טמפרטורת דגירה, ו / או ריכוז חלבון).
  2. התגבשות שימוש Bicelles
    הערה: הפגנה מפורטת יותר של טכניקות bicelle תוארה בעבר על ידי Ujwal ו אברמסון 24.
    1. כן או לרכוש 35% תערובת bicelle המורכב DMPC: CHAPSO ביחס של 2.8: 1 על פי הפרוטוקולים שפורסמו 25. ריכוזים אחרים עשויים גם להיות assayed, כמו גם, שומנים אחרים דטרגנטים, לפי הצורך.
    2. השג מדגם חלבון דטרגנט solubilized כי הוא ב ~ 10 מ"ג / מ"ל ​​ריכוז.
    3. מוסיפים את תערובת bicelle, על קרח, לפי יחס התחלתי של 4: 1 v / v (חלבון: bicelle) (למשל, להוסיף 10 μl של תערובת bicelle 40 μl של חלבון ומערבבים במהירות על ידי pipetting).
    4. לדגור על 30-60 דקות קרח.
      הערה: חלבון: פתרון bicelle צריך להישאר בעיקר ברור אבל יכול לעתים קרובות להפוך אטום מעט. עם זאת, אם החלבון: פתרון bicelle הופך לבן חלבי, ממטרים מציינים, ואז משתנה אחרים צריך להיות assayed (כלומר, חומר ניקוי, חיץ, וכו '). לקבלת דוגמיות חדש, עושה בדיקות בקנה מידה קטנה (חלבון 8 μl ו -2 bicelles μl) מומלץ לוודא יציבות לפני בגמלון על מנת למנוע אובדן מדגם מיותר.
    5. באמצעות רובוט התגבשות, לבצע התגבשות מטריקס רחבה הקרנה באמצעות 96 מסכים היטב זמינים מסחרי או על ידי תלייה או יושבים שיטת אידוי טיפה עם טיפות מורכבות ~ 200 מדגם חלבון NL ו ~ 200 חיץ התגבשות NL.
    6. דגירת צלחות ההתגבשות ב ~ 21 ° C. בדוק את הצלחות שבועיות לצמיחה קריסטל באמצעות סטראו.
    7. מטב מוביל התגבשות ידי שינוי מרכיבי תנאי ההתגבשות באופן שיטתי (הגדלה / הקטנת מלח או ריכוזי נמהר, pH חיץ, טמפרטורת דגירה, ו / או ריכוז חלבון).
  3. התגבשות שימוש שלב מעוקב lipidic (LCP)
    הערה: הפגנה מפורטת יותר של טכניקות LCP תוארה בעבר על ידי ליו Cherezov 26,27.
    1. השג מדגם חלבון דטרגנט solubilized כי הוא ב ~ 20 מ"ג / מ"ל ​​ריכוז.
    2. טרום החם monoolein ל ~ 40 ºC. לִטעוֹן60 μl monoolein לתוך מזרק 100 μl גז חזק אחד ו -40 μl מדגם החלבון לתוך אחר.
    3. באמצעות מצמד ערבוב, לחבר את המזרקים, נזהר שלא להכניס אוויר.
    4. מערבבים בעדינות על ידי הפעלת לחץ לסירוגין על בוכנות מזרק דוחפים את התערובת מן מזרק אחד אל השני באופן מושלם עד הדגימה נעשה שקוף הומוגני.
    5. באמצעות רובוט התגבשות מיועד שיטות LCP, לבצע התגבשות מטריקס רחבה הקרנה באמצעות 96 מסכים היטב זמינים מסחרי עם צלחות התגבשות כריך בסגנון (עובי גם 0.1 מ"מ) עם טיפות מורכבות 100 מדגם חלבון NL ו -750 חיץ התגבשות NL.
      הערה: יחסי זרוק עשויים להיות מותאמים במידת צורך. כמו כן, מכסה מוצק (כלומר, זכוכית או פלסטיק עבה) מומלץ התומכים טיפות יפה ולא סרטים דקים, אשר נוטים לאפשר טיפות לנוע גם הצלחות מטופלות.
    6. דגירת p ההתגבשותlates ב ~ 21 ° C. בדוק את הצלחות שבועיות לצמיחה קריסטל באמצעות סטראו.
    7. מטב מוביל התגבשות ידי שינוי מרכיבי תנאי ההתגבשות באופן שיטתי (הגדלה / הקטנת מלח או ריכוזי נמהר, pH חיץ, טמפרטורת דגירה, ו / או ריכוז חלבון).

תוצאות

YiuR הוא טרנספורטר ברזל תלוי TonB כי הוא מטרת חיסון משוערת נגד pestis Yersinia. זה זוהה במקור באמצעות assay microarray. הנה, את הצעדים שננקטו כדי לקבוע את המבנה של YiuR באמצעות קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן מתוארים (איור 9). שיבוט, את רצף הדנ"א של YiuR (מינו...

Discussion

β-חבית OMPs משמש תפקידים חיוניים חיידקים גראם שלילי, מיטוכונדריה כלורופלסטים והם יעדים חשובים לניתוח מבני המציעים שפע של מידע על מנגנונים מולקולריים מהותיים שהוא ממברנות החיצוני של האברונים השונים הללו. עם זאת, מייצרת מספיק דגימה לצורך ביצוע אנליזה מבנית אינו תמיד בר...

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

We would like to thank Herve Celia of the CNRS for providing the UV images and Chris Dettmar and Garth Simpson in the Department of Chemistry at Purdue University for providing the SONICC images. We would like to acknowledge funding from the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases and the Intramural Research Program at the National Institutes of Health. Additionally, we would like to acknowledge additional funding from the National Institute of General Medical Sciences (A.M.S. and C.J.), National Institute of Allergy and Infectious Diseases (N.N. 1K22AI113078-01), and the Department of Biological Sciences at Purdue University (N.N.).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Crystallization RobotTTP Labtech, Art Robbins-Any should work here, except for LCP crystallization
PCR thermocyclerEppendorf, BioRad-
Media ShakerNew Brunswick, Infors HT-
UV-vis spectrometerEppendorf-
SDS-PAGE apparatusBioRad1645050, 1658005
SDS-PAGE and native gelsBioRad, Life Technologies4561084, EC6035BOX (BN1002BOX)
AkTA PrimeGE Healthcare-
AkTA PurifierGE Healthcare-
MicrocentrifugeEppendorf-
Centrifuge (low-medium speed)Beckman-Coulter-
Ultracentrifuge (high speed)Beckman-Coulter-
SS34 rotorSorvall-
Type 45 Ti rotorBeckman-Coulter-
Type 70 Ti rotorBeckman-Coulter-
Dounce homogenizerFisher Scientific06 435C
EmulsiflexAvestin-
Dialysis tubingSigmaD9652
LCP toolsHamilton, TTP Labtech-
VDX 24 well platesHampton ResearchHR3-172
Sandwich platesHampton Research, Molecular DimensionsHR3-151, MD11-50 (MD11-53)
Grace Crystallization sheetsGrace Bio-Labs875238
HiPrep S300 HR columnGE Healthcare17-1167-01
Q-Sepharose columnGE Healthcare17-0510-01
Crystallization screensHampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions-
Gas-tight syringe (100 ml)Hamilton 

References

  1. Walther, D. M., Rapaport, D., Tommassen, J. Biogenesis of beta-barrel membrane proteins in bacteria and eukaryotes: evolutionary conservation and divergence. Cell Mol Life Sci. 66, 2789-2804 (2009).
  2. Ricci, D. P., Silhavy, T. J. The Bam machine: A molecular cooper. Biochim Biophys Acta. 1818, 1067-1084 (2012).
  3. Hagan, C. L., Silhavy, T. J., Kahne, D. beta-Barrel membrane protein assembly by the Bam complex. Ann Rev of Biochem. 80, 189-210 (2011).
  4. Noinaj, N., et al. Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria. Nature. 483, 53-58 (2012).
  5. Noinaj, N., et al. Structural insight into the biogenesis of beta-barrel membrane proteins. Nature. 501, 385-390 (2013).
  6. Gatzeva-Topalova, P. Z., Walton, T. A., Sousa, M. C. Crystal structure of YaeT: conformational flexibility and substrate recognition. Structure. 16, 1873-1881 (2008).
  7. Kim, S., et al. Structure and function of an essential component of the outer membrane protein assembly machine. Science. 317, 961-964 (2007).
  8. Geibel, S., Procko, E., Hultgren, S. J., Baker, D., Waksman, G. Structural and energetic basis of folded-protein transport by the FimD usher. Nature. 496, 243-246 (2013).
  9. Phan, G., et al. Crystal structure of the FimD usher bound to its cognate FimC-FimH substrate. Nature. 474, 49-53 (2011).
  10. van den Berg, B., Black, P. N., Clemons, W. M., Rapoport, T. A. Crystal structure of the long-chain fatty acid transporter FadL. Science. 304, 1506-1509 (2004).
  11. Fairman, J. W., Noinaj, N., Buchanan, S. K. The structural biology of beta-barrel membrane proteins: a summary of recent reports. Curr Op Struct Bio. 21, 523-531 (2011).
  12. Noinaj, N., Guillier, M., Barnard, T. J., Buchanan, S. K. TonB-dependent transporters: regulation, structure, and function. Ann Rev of Micro. 64, 43-60 (2010).
  13. Siburt, C. J., et al. Hijacking transferrin bound iron: protein-receptor interactions involved in iron transport in N. gonorrhoeae. Metallomics. 1, 249-255 (2009).
  14. Cornelissen, C. N., Hollander, A. TonB-Dependent Transporters Expressed by Neisseria gonorrhoeae. Front in Micro. 2 (117), (2011).
  15. Dautin, N., Bernstein, H. D. Protein secretion in gram-negative bacteria via the autotransporter pathway. Ann Rev of Micro. 61, 89-112 (2007).
  16. Leo, J. C., Grin, I., Linke, D. Type V secretion: mechanism(s) of autotransport through the bacterial outer membrane. Phil Trans of the Royal Soc of London. Series B, Biological Sciences. 367, 1088-1101 (2012).
  17. Buchanan, S. K., Yamashita, S., Fleming, K. G., Engelman, E. H., Tamm, L. K. . Comprehensive Biophysics. 5, 139-163 (2011).
  18. Buchanan, S. K., et al. Structure of colicin I receptor bound to the R-domain of colicin Ia: implications for protein import. EMBO J. 26, 2594-2604 (2007).
  19. Yamashita, S., et al. Structural insights into Ail-mediated adhesion in Yersinia pestis. Structure. 19, 1672-1682 (2011).
  20. Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Res. 18, 6069-6074 (1990).
  21. Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. Rapid reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors. BioTechniques. 13, 515-518 (1992).
  22. Rosenbusch, J. P. Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecyl sulfate binding. J Biol Chem. 249, 8019-8029 (1974).
  23. Barnard, T. J., Wally, J. L., Buchanan, S. K., Coligan, J. E. Crystallization of integral membrane proteins. Curr Prot in Prot Science. Chapter 17, Unit 17 19 (2007).
  24. Ujwal, R., Abramson, J. High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method. JoVE. , e3383 (2012).
  25. Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles. Curr Topics in Membranes. 63, 111-127 (2009).
  26. Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. JoVE. , e4000 (2012).
  27. Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. JoVE. , (2011).
  28. Buchanan, S. K. Overexpression and refolding of an 80-kDa iron transporter from the outer membrane of Escherichia coli. Biochem Soc Trans. 27, 903-908 (1999).
  29. Buchanan, S. K. Beta-barrel proteins from bacterial outer membranes: structure, function and refolding. Curr Op in Struct Bio. 9, 455-461 (1999).
  30. Stanley, A. M., Fleming, K. G. The process of folding proteins into membranes: challenges and progress. Arch of Biochem and Biophysics. 469, 46-66 (2008).
  31. Pautsch, A., Schulz, G. E. Structure of the outer membrane protein A transmembrane domain. Nature Struct Bio. 5, 1013-1017 (1998).
  32. Cowan, S. W., et al. The structure of OmpF porin in a tetragonal crystal form. Structure. 3, 1041-1050 (1995).
  33. Ujwal, R., et al. The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 A resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating. PNAS. 105, 17742-17747 (2008).
  34. Robert, V., et al. Assembly factor Omp85 recognizes its outer membrane protein substrates by a species-specific C-terminal motif. PLoS Bio. 4, e377 (2006).
  35. Paramasivam, N., Habeck, M., Linke, D. Is the C-terminal insertional signal in Gram-negative bacterial outer membrane proteins species-specific or not?. BMC Genomics. 13, 510 (2012).
  36. Agah, S., Faham, S. Crystallization of membrane proteins in bicelles. Methods in Mol Bio. 914, 3-16 (2012).
  37. Ujwal, R., Bowie, J. U. Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles. Methods. 55, 337-341 (2011).
  38. Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Cur Op in Struct Bio. 21, 559-566 (2011).
  39. Luecke, H., Schobert, B., Richter, H. T., Cartailler, J. P., Lanyi, J. K. Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 A resolution. J Mol Biol. 291, 899-911 (1999).
  40. Kato, H. E., et al. Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel. Nature. 482, 369-374 (2012).
  41. White, J. F., et al. Structure of the agonist-bound neurotensin receptor. Nature. 490, 508-513 (2012).
  42. Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
  43. Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
  44. Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55, 379-386 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

113refolding

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved