Medición de apego y Internalización del Virus de la Influenza en células A549 por Citometría de Flujo

Resumen

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

Resumen

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 °C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

Introducción

La entrada de los virus de influenza A (IAV) es un proceso de múltiples pasos que comienza con la unión del virus a los receptores en la membrana plasmática de las células diana ^1. El receptor para IAV es el ácido siálico que está presente en una gran variedad de glicoproteínas y glicolípidos. La hemaglutinina (HA) de proteína de IAV que está presente en la envoltura viral se une al ácido siálico y por lo tanto media en la unión de las partículas virales a la membrana plasmática de las células diana ^2. El virus entra en las células a través de endocitosis mediada por clatrina, sino también a las vías de entrada alternativos, como macropinocitosis, se han descrito ^6.3. La interacción entre HA y ácido siálico parece ser suficiente para mediar tanto, el apego y desencadenar la internalización de las partículas virales ^7. Sin embargo, se han propuesto los receptores de ingreso alternativas y sus roles en la entrada IAV están siendo investigados ^1,8,9.

Canallatualmente, se hacen esfuerzos para identificar los factores del huésped que están involucrados en el ciclo de vida viral con el objetivo de desarrollar urgentemente necesarias nuevas terapias antivirales ^10-12. La entrada del virus sería un paso favorable para orientar el crecimiento IAV con el fin de bloquear la infección viral en su punto más temprano. Medición de las diferentes etapas de la entrada IAV experimentalmente es un reto ya que se requieren por lo general grandes cantidades de virus para detectar virus entrante. Además, el rango de detección de los cambios en la entrada del virus es solamente lineal debido a la falta de replicación viral. Esto pone de relieve la necesidad de ensayos con alta sensibilidad.

El ensayo que aquí presentamos permite la detección de virus unido a la superficie celular, así como la detección de virus internalizado en relación con la cantidad total de virus asociado a células. El uso de virus de tipo salvaje biotina permite la medición conveniente a través de tinción con STV-Cy3 y lectura por citometría de flujo. Virus biotinilado es frío ligado a la células para permitir la unión, sino evitar la internalización de las partículas virales. Las células pueden ser fijos, permeabilizaron y se tiñeron con STV-Cy3 para medir virus adjunto. La señal procedente de viriones extracelulares, adjuntos puede ser derogada si se aplica una etapa de bloqueo antes de la fijación en la que las células se incuban con estreptavidina no marcada (STV). En un siguiente paso, después de la fijación de biotina IAV, la temperatura se desplaza a 37 ° C y la internalización de las partículas virales se dejó que tuviera lugar. Partículas internalizadas están protegidos de la unión de STV permitiendo así que la discriminación entre virus extra e intracelulares.

Por condición experimental, se requieren cuatro muestras: '0 min': La primera muestra, con la etiqueta "0 min ', es medir el virus frío con destino en la superficie celular. '0 min + STV': La segunda muestra, con la etiqueta "0 min + STV ', da la intensidad de la señal de referencia del experimento. Virus adjunto se bloquea ingenioh STV y la señal después de la tinción con STV-Cy3 deberían ser mucho menor en comparación con la muestra '0 min'. '30 Minutos ': La tercera muestra, '30 minutos' contiene adjunta y el virus internalizado debido al cambio de temperatura a 37 ° C durante 30 minutos. '30 Min + STV ': La cuarta muestra, '30 minutos + STV' mide la fracción intracelular de virus. La etapa de bloqueo STV se aplica después del período de incubación 30 min. Como resultado, las partículas virales en la superficie celular están obligados por STV dejando solamente los virus internalizados disponible para la tinción con STV-Cy3. La cantidad relativa de virus internalizado se puede calcular como la relación de virus internalizado (medido en el '30 min + STV 'muestra) dividido por la cantidad total de virus (descrito por el '30 min' muestra).

Como controles se sugiere incluir las células infectadas. La señal después de la tinción STV-Cy3 de células infectadas da el fondoresultante de el protocolo de tinción. Un control para la fijación IAV es el pre-tratamiento de las células con neuraminidasa bacteriana (NA). Escinde NA fuera de ácido siálico de las glicoproteínas celulares, eliminando de este modo los receptores de unión de la superficie celular. La azida de sodio (SA) es un potente inhibidor metabólico y por lo tanto bloquea la endocitosis ^13. Las células tratadas con azida de sodio deben ser positivos para la unión virus pero negativo para la internalización.

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Protocolo

Nota antes del comienzo: la campana de flujo laminar y Uso biocontención adecuada cuando se trabaja con virus vivo. A continuación, describimos las condiciones de crecimiento adecuadas a la tensión virus de la influenza cultura A / WSN / 33. Multiplicidad de infección (MOI) de incubación y tiempos pueden variar dependiendo de la cepa de virus utilizada.

1. Preparación de biotinilado A / WSN / 33 Virus

1. Las células en un matraz T175 cm ² utilizando Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina (Pen / Strep) Madin-Darby Seed kindey canino (MDCK). Células de cultivo a 37 ° C hasta aproximadamente el 70% de confluencia se alcanza.
2. Antes de la infección, retire medio y lavar las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH7.0-7.3) mediante la adición de un volumen lo suficientemente grande como para cubrir la monocapa de células.
3. Retire PBS e infectar las células con A / WSN / 33 con una MOI de 10 ^-4. Diluir virus en PBS suplementado con 0,02 mg de Mg ^{2 +,} 0,01 mg ^de Ca2 + ^</ sup>, 0,3% de albúmina de suero bovino (BSA), y 1% Pen / Strep (infección-PBS). Utilice un inóculo de 4 ml para un matraz T175 cm ^2.
4. Se incuban las células 1 hora a 37 ° C. Retire inóculo por aspiración y pipeta 10 ml de DMEM suplementado con 0,3% de BSA, 20 mM HEPES, y el 1% penicilina / estreptomicina en el matraz.
5. Se incuban las células a 37 ° C durante aproximadamente 3 días hasta que el efecto citopático (CPE) es visible, y después de la cosecha sobrenadante. CPE puede ser reconocido como el redondeo de las células seguido de desprendimiento y muerte de las células ^14.
6. Girar sobrenadante a 450 xg durante 5 min para eliminar restos celulares. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo Falcon y repita este paso una vez más. Deseche los pellets.
7. Sobrenadantes de transferencia en tubos de ultracentrífuga y sobrenadantes de capas de base con 5 ml de sacarosa al 30% diluido en tampón NTE (10 mM de Tris [pH 7,4], NaCl 100 mM, EDTA 1 mM). Equilibre los tubos antes de la ultracentrifugación y se llenan con PBS para alcanzar un volumen final de 30 ml. Girar supernatantes en 112.398 xg (correspondiente a 25.000 rpm para un rotor SW28) durante 90 min en una ultracentrífuga.
8. Retire con cuidado el sobrenadante con la pipeta y disfrutar sedimento de virus durante la noche a 4 ° C en 250 l de PBS. Resuspender pellet pipeteando arriba y abajo. Mida el contenido de proteínas del virus purificado por Bradford ensayo ^15.
9. Utilice un kit de biotinilación para generar biotina A / WSN / 33. Siga las instrucciones del fabricante.
10. En resumen, añadir la cantidad apropiada de biotina para el virus purificado y se incuba durante 2 h en hielo. Transferencia de virus a un tubo de ultracentrífuga y llenar el tubo con PBS para alcanzar un volumen final de 30 ml. Haga girar virus a 112.389 xg durante 90 minutos en una ultracentrífuga. Aspirar el sobrenadante con la pipeta y añadir 250 l de PBS. Remoje pellet durante la noche a 4 ° C. Alícuota y almacenar el virus biotinilado se almacenó a -80 ° C donde va a ser estable durante al menos 24 meses.
    NOTA: Puede ser útil para determinar el título de la p biotiniladoreparación de IAV por ensayo de placa estándar. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que el protocolo posterior sólo medir partículas de virus biotinilado. Restante partículas no biotinilados debido a biotinilación incompleta contribuirá a la título infeccioso mediante ensayo en placa pero no a la señal medida en el ensayo de unión / internalización.

2. Determinar la cantidad necesaria de Biotinylated Virus

NOTA: Antes de realizar el ensayo de unión / internalización, es importante para determinar la cantidad de virus requerida para infectar biotinilado todas las células de una muestra.

1. Cultura y células A549 trypsinize de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Contar las células por medio de una cámara de celular. Pipeta células 200.000 A549 en FACS Deepwell tubos. Spin 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet con 200 l de PBS. Hacia abajo en hielo durante 10 min Super células.
2. Preparar 5 veces diluciones seriadas del biotistock de virus en la infección por nylated-PBS.
3. Centrifugar los tubos que contienen las células a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet con 100 l infección PBS que contiene el virus. Como el uso de control de la infección maqueta-PBS sin virus biotinilado. Incubar los tubos en hielo durante 1 hr.
4. Centrifugar los tubos a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 l de PBS. Repita este paso una vez más.
5. Para la fijación, tubos de centrifugado a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar sobrenadante y el sedimento se resuspende en 100 l de 3,7% de paraformaldehído (PFA). Incubar durante 10 min a TA. A continuación, repita el paso de lavado descrito en 2.4).
6. Para permeabilización, tubos de centrifugado a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 100 l de PBS que contiene 0,5% de Triton X-100. Incubar durante 6 min a TA. A continuación, repita el paso de lavado descrito en 2.4).
7. Centrifugar los tubos a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender pellet en 50 l 2% de BSA diluido en PBS que contenía STV-Cy3. (Tenga en cuenta que la concentración apropiada de STV-Cy3 debe determinarse antes de iniciar el experimento Comience con una concentración de 1:. 200 y la prueba 2 veces diluciones de hasta 1:. 2400 En nuestras manos, una dilución de 1: 1000 probado a ser óptimo.)
8. Incubar 1 hora en la oscuridad a temperatura ambiente. A continuación, repita el paso de lavado descrito en 2.4, pero resuspender el precipitado en 200 l 2% de BSA diluido en PBS.
9. Analizar muestras por citometría de flujo ^16. Puerta de la población Cy3-positivo. Elige la concentración más baja de virus biotinilado resultante en el número máximo de células Cy3-positivas en la población A549.

3. Determine la cantidad necesaria de estreptavidina

NOTA: La eficiencia de bloquear la señal derivada de virus extracelular determina el rango de detección del ensayo. Por lo tanto, es importante que se suprime la señal de STV-Cy3 tanto como sea posible. The cantidad necesaria de STV necesario depende de la cantidad de stock de virus biotinilado utilizado (determinado en la sección 2).

1. Siga los pasos 2.1-2.4, pero el uso de concentración del virus determina en el apartado 2.
2. Preparar diluciones seriadas de cinco veces de STV diluidos en PBS que contenía 2% de BSA y 0,1% de azida de sodio.
3. Centrifugar los tubos a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar sobrenadante y el sedimento se resuspende en 50 l STV dilución. Como el uso de control de simulacro de PBS que contenía BSA al 2% y el 0,1% de azida de sodio y sin STV. Incubar los tubos durante 30 min en hielo. A continuación, repita paso de lavado descrito en 2.4.
4. Siga los pasos 2,5-2,9. Para el ensayo de internalización, elegir la concentración más baja de STV que resulta en un fuerte bloque de la señal de Cy3 (en comparación con la muestra en la que no estaba presente STV). Para ello, el porcentaje de células Cy3-positivo o la intensidad media de fluorescencia de la señal de Cy3 se puede utilizar. Idealmente, la señal de Cy3 de muestras tratadas con STV debe ser lo más cercano a la señal de infectados por el simulacrocélulas como sea posible.

4. Adjunto / Ensayo Internalización

NOTA: Asegúrese de preparar todos los reactivos antes de comenzar el ensayo. Para los tres grupos de control que se presentan en la sección de resultados (células infectadas simuladas, las células pre-tratadas de la neuraminidasa y células azida sódica tratados) pequeñas alteraciones en el protocolo son obligatorios.

1. Preparar 16 tubos para pozos profundos que contienen cada 200.000 células A549. Al lado del conjunto experimental que consta de 4 tubos, hay 3 condiciones de control, cada uno que requieren 4 tubos: las células infectadas, la neuraminidasa (NA) células -pretreated y células tratadas con azida de sodio. Cada grupo consta de 4 tubos etiquetados como "0 min", "0 min + STV ', '30 minutos', '30 minutos + STV '.
2. Centrifugar los tubos a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 l de PBS.
3. Centrifugar los tubos a 4 ° C a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender pellet 200 en DMEM que contiene 0,3 l% de BSA, HEPES 20 mM y 1% (medio de incubación) penicilina-estreptomicina. Incubar durante 30 minutos a 37 ° C.
   NOTA: Para el control de la neuraminidasa: Uso neuraminidasa bacteriana (por ejemplo, la sialidasa de Vibrio cholera) a una concentración de 200 mU / ml diluido en medio de incubación para resuspender las células.
4. Centrifugar los tubos a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 l de PBS. Repita este paso una vez más, a continuación, los tubos se enfríe en hielo durante 10 min.
5. Centrifugar los tubos a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar sobrenadante y el sedimento se resuspende en 100 l virus biotinilado (utilizar la concentración de virus determina en el apartado 2 diluido en la infección-PBS). Incubar 1 hora en hielo. A continuación, repita paso de lavado descrito en 2.4.
   NOTA: Para el control de modelo de infectados: Uso infección PBS sin virus. Para el control de azida de sodio: Uso virus diluido en PBS-infección suplementado con 0,1% de azida de sodio.
6. Proprocesamiento de las muestras después de la infección en hielo:
   1. Para las muestras '0 min', siga el paso 2.5 y almacenar las muestras a 4 ° C hasta que se fijan las otras muestras.
   2. Para el '0 min + STV' muestras, tubos de centrifugado a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar sobrenadante y el sedimento se resuspende en 50 l STV (utilizar la concentración determinada en la sección 3) diluido en PBS que contenía BSA al 2% y el 0,1% de azida de sodio (para evitar la internalización durante la manipulación de la muestra). Incubar 30 min en hielo. Siga paso 2,4-2,5 y almacenar las muestras a 4 ° C.
   3. Para las muestras de '30 minutos ', tubos de centrifugado a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 l de PBS que contienen 2% de BSA. Incubar 30 minutos a 37 ° C. Siga paso 2,4-2,5 y almacenar las muestras a 4 ° C.
      NOTA: Para el control de azida de sodio: Uso PBS suplementado con 2% de BSA y 0,1% de azida de sodio para la incubación de 30 min a 37 ° C.
   4. Para el '30 min + muestras STV 'giran tubos a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 l de PBS que contienen 2% de BSA. Incubar 30 minutos a 37 ° C. Entonces, los tubos de centrifugado a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Eliminar sobrenadante y el sedimento se resuspende en 50 l STV (utilizar la concentración determinada en la sección 3) diluido en PBS que contenía BSA al 2% y el 0,1% de azida de sodio (para evitar la internalización durante la manipulación de la muestra). Incubar 30 min en hielo. Siga paso 2,4-2,5 y almacenar las muestras a 4 ° C.
      NOTA: Para el control de azida de sodio: Uso PBS suplementado con 2% de BSA y 0,1% de azida de sodio para la incubación de 30 min a 37 ° C.
7. Siga los pasos 2.6-2.8 y analizar muestras por citometría de flujo. Determinar el porcentaje de células Cy3-positivos en cada muestra.
8. Calcular el porcentaje adjunta virus y la cantidad relativa de virus internalizado.
   1. Para calcular la cantidad de virus adjunto, utilice el porcentaje de Cy3-positive células cerradas o la intensidad de fluorescencia media de la señal de Cy3. Para la comparación, establezca las células no tratadas a 100% (Figura 4B).
      NOTA: El porcentaje de virus adjunto se describe por la muestra "0 min".
   2. Para calcular la cantidad de virus interiorizado, tomar la relación entre el "30 min + STV" muestra al "30 minutos" de la muestra (Figura 5B).
      NOTA: Como se mencionó anteriormente, el porcentaje de células cerradas positivos Cy3 o la intensidad media de fluorescencia de la señal de Cy3 se puede utilizar.

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Resultados

Un dibujo animado que describe las cuatro condiciones experimentales diferentes se muestra en la Figura 1 Los resultados de un experimento representativo se presentan en las Figuras 2 -. 5. En la muestra "0 min", virus biotinilado es frío unida a células que pueden ser visualizadas por tinción STV-Cy3 objetivo (Figuras 1 y 2). Cuando se aplica una etapa de bloqueo (en el "0 min + STV" muestra), el...

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Discusión

Nuestro protocolo describe una manera fácil de medir la fijación del virus y la internalización por citometría de flujo. Se permite el uso de virus de tipo salvaje marcado que imita más estrechamente las infecciones de virus en comparación con el uso de partículas similares a virus (VLP). Mientras que nuestro protocolo se ha optimizado para medir unión e internalización de IAV puede ser fácilmente adaptado para otros virus. Además, como la citometría de flujo se utiliza para la lectura, los compañeros de ti...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Life Technologies	41966-052
FBS	Life Technologies	10270-106
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140-163
PBS	Life Technologies	14190-169
BSA	VWR Calbiochem	126579
HEPES	Life Technologies	15630-100
D-Sucrose	Fluka	84100
TRIS	Biosolve BV	20092391
EDTA	Sigma-Aldrich	3680
EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit	Fisher Scientific	W9971E
Bio Rad Protein Bio Assay	Bio Rad	500-0006
deepwell tubes (1.2 ml microtubes)	Milian	82 00 001
PFA	Lucerna chem  Electron microscopy sciences	15710
ultracentrifuge tubes	Hemotec HmbH	253070
Triton X-100	Fluka	93420
STV-Cy3	Life Technologies	43-4315
STV	Life Technologies	43-4302
sodium azide	Fluka	71290
bacterial neuraminidase/sialidase	Sigma-Aldrich	N6514-1UN