Mesurer l'attachement et l'internalisation du virus grippal A dans les cellules A549 par cytométrie en flux

Résumé

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

Résumé

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 °C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

Introduction

L'entrée de virus de la grippe A (IAV) est un processus en plusieurs étapes qui commence par la liaison du virus aux récepteurs sur la membrane plasmique des cellules cibles ^1. Le récepteur de l'acide sialique est IAV qui est présente sur une grande variété de glycoprotéines et des glycolipides. La protéine hémagglutinine (HA) de IAV qui est présent dans l'enveloppe virale se lie à l'acide sialique et médie ainsi la fixation des particules virales à la membrane plasmique de cellules cibles ^2. Le virus pénètre dans les cellules par endocytose clathrine mais aussi les voies d'entrée alternatifs, tels que macropinocytose, ont été décrits ^3-6. L'interaction entre HA et l'acide sialique semble être suffisante pour la médiation à la fois, l'attachement et le déclenchement de l'internalisation de particules virales ^7. Néanmoins, les récepteurs d'entrée alternatives ont été proposées et leurs rôles dans IAV entrée sont actuellement à l'étude ^1,8,9.

Cabotment, des efforts sont faits pour identifier les facteurs de l'hôte qui sont impliqués dans le cycle de vie du virus dans le but de développer de nouveaux traitements antiviraux nécessaires de toute urgence ^10-12. L'entrée du virus serait une étape favorable pour cibler la croissance IAV afin de bloquer l'infection virale à son premier stade. Mesure différentes étapes de IAV entrée expérimentalement est généralement difficile que de grandes quantités de virus sont nécessaires pour détecter des virus entrant. En outre, la plage de détection des variations de l'entrée du virus est uniquement linéaire en raison de l'absence de réplication virale. Cela souligne la nécessité pour les essais avec une grande sensibilité.

Le test que nous présentons ici permet la détection de virus attaché à la surface des cellules ainsi que la détection de virus internalisé par rapport à la quantité totale de virus associé aux cellules. L'utilisation de virus de type sauvage biotinylé permet une mesure pratique à travers la coloration avec STV-Cy3 et la lecture par cytométrie de flux. Virus biotinylé est froid lié à la cellules pour permettre la fixation mais empêche l'internalisation des particules virales. Les cellules peuvent être fixées, perméabilisées et colorées avec STV-Cy3 pour mesurer virus en pièce jointe. Le signal provenant de virions extracellulaires, attachés peut être abrogée si une étape de blocage est appliqué avant la fixation, dans lequel les cellules sont incubées avec de la streptavidine non marqué (STV). Dans une prochaine étape, après la fixation du biotinylé IAV, la température est décalée à 37 ° C et l'internalisation des particules virales est autorisé à prendre place. Particules internalisées sont protégés de liaison de STV permettant ainsi à la discrimination entre les virus extra- et intracellulaires.

Par condition expérimentale, quatre échantillons sont nécessaires: «0 min»: Le premier échantillon, appelée «0 min», est de mesurer le virus froid lié à la surface de la cellule. '0 min + STV': Le deuxième échantillon, appelée «0 min + STV», donne la ligne de base l'intensité du signal de l'expérience. Virus en pièce jointe est bloquée esprith STV et le signal après coloration avec STV-Cy3 devraient être beaucoup plus faible par rapport à l'échantillon «0 min». '30 Minutes ': Le troisième échantillon, '30 minutes' contient fixée intériorisé et le virus en raison de la variation de température à 37 ° C pendant 30 min. '30 Min + STV ': Le quatrième échantillon, '30 min + STV »mesure la fraction intracellulaire des virus. L'étape de blocage STV est appliqué après la période d'incubation de 30 min. Par conséquent, les particules virales à la surface des cellules sont liés par STV laissant seulement les virus internalisés disponible pour la coloration avec STV-Cy3. La quantité relative de virus intériorisé peut être calculé comme le ratio du virus intériorisé (mesurée dans le '30 min + STV 'échantillon) divisée par la quantité totale de virus (décrit par le '30 minutes' échantillon).

Comme témoins, nous proposons d'inclure des cellules pseudo-infectées. Le signal suivant STV-Cy3 coloration des cellules pseudo-infectées donne l'arrière-planrésultant du protocole de coloration. Un contrôle pour la fixation IAV est le pré-traitement des cellules avec la neuraminidase bactérienne (NA). NA hors clive l'acide sialique à partir de glycoprotéines cellulaires, éliminant ainsi les récepteurs de fixation à partir de la surface cellulaire. L'azoture de sodium (SA) est un inhibiteur métabolique puissant et bloque ainsi l'endocytose ^13. Les cellules traitées avec de l'azoture de sodium devraient être positifs pour la liaison du virus mais négatif pour l'internalisation.

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Protocole

Remarque avant le début: hotte utilisation de flux laminaire et de confinement biologique appropriée lorsque l'on travaille avec le virus vivant. Ici, nous décrivons des conditions appropriées pour la culture de la souche de virus influenza A / WSN / 33 de croissance. Multiplicité d'infection (MOI) et incubation fois peuvent varier selon souche virale utilisée.

1. Préparation de biotinylé A / WSN / 33 Virus

1. Graine Madin-Darby canine kindey (MDCK), les cellules dans un flacon T175 cm ^{2 en utilisant} du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de FBS et 1% de pénicilline-streptomycine (Pen / Strep). Des cellules de culture à 37 ° C jusqu'à environ 70% de confluence est atteinte.
2. Avant l'infection, éliminer le milieu et laver les cellules avec un tampon phosphate salin (PBS, pH7.0-7.3) en ajoutant un volume suffisant pour couvrir la monocouche cellulaire.
3. Retirer du PBS et infecter les cellules avec A / WSN / 33 avec un MOI de 10 ^-4. Diluer virus dans PBS complété avec 0,02 mg ^Mg 2+, Ca ²⁺ 0,01 mg ^</ sup>, 0,3% d'albumine de sérum bovin (BSA) et 1% de Pen / Strep (-infection PBS). Utiliser un inoculum de 4 ml pour un flacon T175 cm ^2.
4. Incuber les cellules 1 heure à 37 ° C. Retirer inoculum par aspiration et la pipette 10 ml du DMEM supplémenté avec 0,3% de BSA, 20 mM de HEPES et 1% de Pen / Strep dans le ballon.
5. Incuber les cellules à 37 ° C pendant environ 3 jours jusqu'à ce que l'effet cytopathique (CPE) est visible, et ensuite la récolte surnageant. CPE peut être reconnu comme arrondissement des cellules, suivie par le détachement et la mort des cellules ^14.
6. Spin surnageant à 450 g pendant 5 min pour éliminer les débris cellulaires. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de faucon et répétez cette étape une fois de plus. Jeter les pastilles.
7. Les surnageants dans des tubes de transfert d'ultracentrifugation des surnageants et sous-couche de 5 ml de saccharose à 30% dilué dans du tampon NTE (Tris 10 mM [pH 7,4], NaCl 100 mM, EDTA 1 mM). Équilibrer tubes avant ultracentrifugation et remplir avec du PBS pour atteindre un volume de 30 ml de fin. Spin supernatants à 112 398 xg (correspondant à 25 000 tours par minute pour un rotor SW28) pendant 90 min dans une ultracentrifugeuse.
8. Retirez délicatement surnageant par pipetage et laisser tremper culot de virus nuit à 4 ° C dans 250 pi de PBS. Remettre en suspension pastille par aspiration et vers le bas. Mesurer la teneur en protéines de virus purifié par dosage Bradford ^15.
9. Utilisez un kit de biotinylation pour générer biotinylé A / WSN / 33. Suivez les instructions du fabricant.
10. En bref, ajouter la quantité appropriée de la biotine au virus purifié et incuber pendant 2h sur la glace. Transférer le virus à un tube d'ultracentrifugation et remplir le tube avec PBS pour atteindre un volume de 30 ml de fin. Spin virus à 112 389 g pendant 90 min dans une ultracentrifugeuse. Retirer le surnageant par pipetage et ajouter 250 ul de PBS. Faire tremper granulés pendant la nuit à 4 ° C. Aliquoter et stocker le virus biotinylé stockés à -80 ° C où il sera stable pendant au moins 24 mois.
    NOTE: Il peut être utile pour déterminer le titre de la p biotinyléréparation des IAV par dosage de plaque standard. Toutefois, il convient de noter que le protocole ultérieur ne mesurer particules virales biotinylés. Restant particules non biotinylé en raison de biotinylation incomplet contribuera au titre infectieux par dosage de plaque, mais pas au signal mesuré dans l'essai de fixation / internalisation.

2. Déterminer le montant requis de biotinylé Virus

REMARQUE: Avant l'essai de fixation / internalisation est effectuée, il est important de déterminer la quantité de virus biotinylé nécessaire d'infecter toutes les cellules d'un échantillon.

1. Culture des cellules A549 et Trypsiniser selon les instructions du fabricant. Compter les cellules à l'aide d'une chambre de cellule. Pipettes cellules 200.000 A549 en FACS DEEPWELL tubes. Spin 3 min à 450 x g. Retirer le surnageant et remettre le culot avec 200 pi de PBS. Cellules refroidir sur glace pendant 10 min.
2. Préparation de 5 fois des dilutions en série de la biotinylated stock de virus dans l'infection-PBS.
3. Des tubes de centrifugation contenant les cellules à 4 ° C pendant 3 min à 450 x g. Retirer le surnageant et remettre le culot avec 100 ul contenant le virus infection PBS. Comme l'utilisation de commande maquette infection PBS sans virus biotinylé. Incuber les tubes sur de la glace pendant 1 heure.
4. Des tubes de centrifugation à 4 ° C pendant 3 min à 450 x g. Retirer le surnageant et remettre le culot dans 200 pi de PBS. Répétez cette étape une fois de plus.
5. Pour la fixation, des tubes de rotation à 4 ° C pendant 3 min à 450 x g. Retirer le surnageant et remettre le culot dans 100 ul de 3,7% de paraformaldehyde (PFA). Incuber pendant 10 min à température ambiante. Ensuite, répétez l'étape de lavage décrit dans 2.4).
6. Pour perméabilisation, les tubes de rotation à 4 ° C pendant 3 min à 450 x g. Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 100 pl de PBS contenant 0,5% de Triton X-100. Incuber pendant 6 min à température ambiante. Ensuite, répétez l'étape de lavage décrit dans 2.4).
7. Des tubes de centrifugation à 4 ° C pendant 3 min à 450 x g. Retirer le surnageant et remettre en suspension pêleet dans 50 ul de BSA à 2% dilué dans du PBS contenant STV-Cy3. (S'il vous plaît noter, la concentration appropriée de STV-Cy3 devrait être déterminé avant de commencer l'expérience Commencez avec une concentration de 1:. 200 et le test des dilutions d'un facteur 2 à 1:. 2.400 Dans nos mains, une dilution de 1: 1,000 prouvé comme optimale).
8. Incuber 1 h dans l'obscurité à la température ambiante. Ensuite, répétez l'étape de lavage décrite dans 2.4 mais Reprendre le culot dans 200 pi 2% de BSA dilué dans du PBS.
9. Analyser des échantillons par cytométrie de flux ^16. Porte sur la population Cy3-positif. Choisir la plus faible concentration de virus dans le biotinylée résultante nombre maximum de cellules positives-Cy3 dans la population A549.

3. Déterminez la quantité requise de streptavidine

NOTE: L'efficacité du blocage du signal dérivé du virus extracellulaire détermine la plage de détection du dosage. Par conséquent, il est important d'abroger le signal STV-Cy3 autant que possible. The montant requis de STV nécessaire dépend de la quantité de stock de virus utilisé biotinylé (déterminée à l'article 2).

1. Suivez les étapes 2.1-2.4, mais utiliser la concentration de virus déterminé à l'article 2.
2. Préparer des dilutions en série de cinq pliage de STV dilué dans du PBS contenant 2% de BSA et de l'azide de sodium à 0,1%.
3. Des tubes de centrifugation à 4 ° C pendant 3 min à 450 x g. Retirer le surnageant et remettre le culot dans 50 ul STV dilution. Comme l'utilisation de commande maquette PBS contenant 2% de BSA et de l'azoture de sodium à 0,1%, sans STV. Incuber les tubes pendant 30 minutes sur la glace. Ensuite, l'étape de lavage répétition décrit dans 2.4.
4. Suivez les étapes 2.5 à 2.9. Pour le dosage de l'internalisation, choisir la plus faible concentration de STV résultant en un bloc fort de la Cy3-signal (par rapport à l'échantillon dans lequel aucun STV était présent). Pour cela, le pourcentage de cellules positives à Cy3 ou l'intensité moyenne du signal de fluorescence Cy3 peut être utilisé. Idéalement, le signal Cy3 d'échantillons STV-traités devrait être aussi proche du signal de faussement infectéescellules que possible.

4. Fixation / Internalisation Assay

NOTE: Assurez-vous de préparer tous les réactifs avant de commencer le test. Pour les trois groupes de contrôle présentés dans la section des résultats (cellules infectées simulées, les cellules pré-traitées neuraminidase et les cellules azoture de sodium) traités de petites modifications au protocole sont obligatoires.

1. Préparer 16 tubes deepwell contenant chacune 200.000 cellules A549. Suivant à l'ensemble expérimentale composée de 4 tubes, il ya 3 conditions de contrôle, chacune nécessitant des 4 tubes: cellules pseudo-infectées, la neuraminidase (NA) -pretreated cellules et des cellules traitées azoture de sodium. Chaque groupe se compose de 4 tubes étiquetés comme «0 min», «0 min + STV ', '30 minutes', '30 min + STV.
2. Des tubes de centrifugation à 4 ° C pendant 3 min à 450 x g. Retirer le surnageant et remettre le culot dans 200 pi de PBS.
3. Des tubes de centrifugation à 4 ° C à 450 x g. Retirer le surnageant et remettre en suspension pêleet dans 200 ul de DMEM contenant 0,3% de BSA, 20 mM de HEPES et 1% (de milieu d'incubation) de pénicilline-streptomycine. Incuber pendant 30 min à 37 ° C.
   NOTE: Pour le contrôle de la neuraminidase: Utilisation de la neuraminidase bactérienne (par exemple la sialidase de Vibrio cholerae) à une concentration de 200 mU / ml diluée dans du milieu d'incubation pour remettre en suspension les cellules.
4. Des tubes de centrifugation à 4 ° C pendant 3 min à 450 x g. Retirer le surnageant et remettre le culot dans 200 pi de PBS. Répétez cette étape une fois de plus, puis les tubes refroidir sur glace pendant 10 min.
5. Des tubes de centrifugation à 4 ° C pendant 3 min à 450 x g. Retirer le surnageant et remettre le culot dans 100 pi virus biotinylé (utiliser la concentration de virus déterminé à l'article 2 dilué dans l'infection PBS). Incuber 1 h sur de la glace. Ensuite, l'étape de lavage répétition décrit dans 2.4.
   NOTE: Pour la maquette infectés contrôle: utilisation infection PBS sans virus. Pour le contrôle de l'azoture de sodium: Utilisation virus dilué dans du PBS-infection supplémenté avec de l'azide de sodium à 0,1%.
6. Protransformation des échantillons après l'infection sur la glace:
   1. Pour les échantillons «0 min», suivez l'étape 2.5 et de stocker des échantillons à 4 ° C jusqu'à ce que les autres échantillons sont fixés.
   2. Pour le '0 min + STV' échantillons, tubes de spin à 4 ° C pendant 3 min à 450 x g. Retirer le surnageant et remettre le culot dans 50 ul STV (utiliser la concentration déterminée à l'article 3) dilué dans du PBS contenant 2% de BSA et de l'azoture de sodium à 0,1% (pour éviter l'internalisation lors de la manipulation de l'échantillon). Incuber 30 min sur la glace. Suivez l'étape 2,4-2,5 et stocker des échantillons à 4 ° C.
   3. Pour les échantillons ''30 min, les tubes de rotation à 4 ° C pendant 3 min à 450 x g. Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 200 pl de PBS contenant 2% de BSA. Incuber 30 min à 37 ° C. Suivez l'étape 2,4-2,5 et stocker des échantillons à 4 ° C.
      NOTE: Pour le contrôle de l'azoture de sodium: Utilisation du PBS supplémenté avec 2% de BSA et de l'azide de sodium à 0,1% pour les 30 minutes d'incubation à 37 ° C.
   4. Pour la '30 min + échantillons STV "SPIN tubes à 4 ° C pendant 3 min à 450 x g. Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 200 pl de PBS contenant 2% de BSA. Incuber 30 min à 37 ° C. Ensuite, les tubes de rotation à 4 ° C pendant 3 min à 450 x g. Retirer le surnageant et remettre le culot dans 50 ul STV (utiliser la concentration déterminée à l'article 3) dilué dans du PBS contenant 2% de BSA et de l'azoture de sodium à 0,1% (pour éviter l'internalisation lors de la manipulation de l'échantillon). Incuber 30 min sur la glace. Suivez l'étape 2,4-2,5 et stocker des échantillons à 4 ° C.
      NOTE: Pour le contrôle de l'azoture de sodium: Utilisation du PBS supplémenté avec 2% de BSA et de l'azide de sodium à 0,1% pour les 30 minutes d'incubation à 37 ° C.
7. Suivre les étapes 2,6-2,8 et analyser les échantillons par cytométrie en flux. Déterminer le pourcentage de cellules positives à Cy3 dans chaque échantillon.
8. Calculer le pourcentage de virus ci-joint et la quantité relative de virus intériorisé.
   1. Pour calculer la quantité de virus en pièce jointe, utilisez le pourcentage de Cy3-positive cellules bloquées ou l'intensité de fluorescence moyenne du signal Cy3. A titre de comparaison, définir les cellules non traitées à 100% (figure 4B).
      NOTE: Le pourcentage de virus en pièce jointe est décrite par l'échantillon "0 min".
   2. Pour calculer la quantité de virus intériorisé, prendre le rapport de la "30 min + STV" échantillon à la "30 min" échantillon (figure 5B).
      Remarque: Comme mentionné ci-dessus, le pourcentage de cellules positives gated Cy3 ou l'intensité moyenne du signal de fluorescence Cy3 peut être utilisé.

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Résultats

Une bande dessinée décrivant les quatre conditions expérimentales différentes est illustrée à la figure 1 Résultats d'une expérience représentative sont présentés dans les figures 2 -. 5. Dans l'exemple "0 min", virus biotinylée est liée à froid à des cellules cibles qui peuvent être visualisées par coloration STV-Cy3 (figures 1 et 2). Quand une étape de blocage (dans...

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Discussion

Notre protocole décrit un moyen facile de mesurer l'attachement du virus et de l'internalisation par cytométrie de flux. Il permet l'utilisation de virus de type sauvage marqué qui imite plus étroitement les infections virales par rapport à l'utilisation de particules de type virus (VLP). Alors que notre protocole a été optimisé pour mesurer l'attachement et l'internalisation des IAV il peut facilement être adapté à d'autres virus. En outre, comme la cytométrie de flux est utilis?...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Life Technologies	41966-052
FBS	Life Technologies	10270-106
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140-163
PBS	Life Technologies	14190-169
BSA	VWR Calbiochem	126579
HEPES	Life Technologies	15630-100
D-Sucrose	Fluka	84100
TRIS	Biosolve BV	20092391
EDTA	Sigma-Aldrich	3680
EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit	Fisher Scientific	W9971E
Bio Rad Protein Bio Assay	Bio Rad	500-0006
deepwell tubes (1.2 ml microtubes)	Milian	82 00 001
PFA	Lucerna chem  Electron microscopy sciences	15710
ultracentrifuge tubes	Hemotec HmbH	253070
Triton X-100	Fluka	93420
STV-Cy3	Life Technologies	43-4315
STV	Life Technologies	43-4302
sodium azide	Fluka	71290
bacterial neuraminidase/sialidase	Sigma-Aldrich	N6514-1UN