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  • Reimpressões e Permissões

Resumo

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

Resumo

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 °C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

Introdução

A entrada do vírus influenza A (IAV) é um processo multi-etapas que começa com a ligação do vírus a receptores na membrana plasmática das células alvo 1. O receptor para IAV é ácido siálico que está presente em uma grande variedade de glicoproteínas e glicolípidos. A hemaglutinina (HA) de IAV proteína que está presente no envelope viral se liga ao ácido siálico e assim medeia a ligação das partículas virais na membrana plasmática das células alvo 2. O vírus entra nas células através de endocitose mediada por clatrina, mas também as vias de entrada alternativos, tais como macropinocitose, foram descritos 3-6. A interacção entre o HA e o ácido siálico parece ser suficiente para mediar os dois, a ligação e internalização de disparo de partículas virais 7. No entanto, os receptores de entrada alternativos foram propostos e seus papéis na entrada IAV estão sendo investigados 1,8,9.

Curatualmente, são feitos esforços para identificar os fatores do hospedeiro que estão envolvidos no ciclo de vida viral com o objectivo de desenvolver terapias antivirais novos urgentemente necessários 10-12. A entrada do vírus seria um passo favorável para o direcionamento de crescimento IAV, a fim de bloquear a infecção viral em seu ponto mínimo. Medindo diferentes fases de entrada é um desafio IAV experimentalmente como geralmente grandes quantidades de vírus são necessárias para detectar o vírus de entrada. Além disso, a gama de detecção de mudanças na entrada do vírus é única linear devido à falta de replicação viral. Isso ressalta a necessidade de ensaios com alta sensibilidade.

O ensaio apresentamos aqui permite a detecção de vírus ligados à superfície da célula, bem como a detecção de vírus internalizado em relação à quantidade total de vírus associados a células. A utilização de vírus de tipo selvagem biotinilado permite a medição conveniente através de coloração com a STV-Cy3 e leitura por citometria de fluxo. Vírus Biotinilado é frio-limite para celulars para permitir a ligação, mas impedir a internalização de partículas virais. As células podem ser fixadas, permeabilizadas e coradas com STV-Cy3 para medir vírus anexado. O sinal de viriões extracelulares, podem ser ligados revogada se um passo de bloqueamento é aplicada antes da fixação, em que as células são incubadas com estreptavidina não marcado (STV). Numa etapa seguinte, a seguir à fixação dos IAV biotinilado, a temperatura é deslocada para 37 ° C e internalização de partículas virais é permitido tomar lugar. Partículas internalizadas são protegidos de se ligar de STV permitindo assim a discriminação entre os vírus extra e intracelulares.

Por condição experimental, são necessários quatro amostras: '0 min': A primeira amostra, denominada "0 min ', é medir vírus do resfriado-bound na superfície da célula. '+ 0 min STV': A segunda amostra, rotulado '0 min + STV', dá a intensidade do sinal da linha de base do experimento. Vírus anexado é bloqueado sagacidadeh STV e o sinal após coloração com STV-Cy3 deve ser muito menor em comparação com a amostra "0 minutos". Min '30 ': A terceira amostra, '30 min' contém em anexo e internalizado do vírus devido à mudança de temperatura para 37 ° C durante 30 min. '30 Min + STV ': A quarta amostra, '30 min + STV' medidas a fração intracelular do vírus. O passo de bloqueamento STV é aplicado após o período de incubação de 30 min. Como resultado, as partículas virais na superfície celular estão ligados por STV deixando somente vírus internalizados disponível para coloração com STV-Cy3. A quantidade relativa de vírus internalizado pode ser calculado como a razão entre vírus internalizado (medido na '30 min + STV 'amostra) dividida pela quantidade total de vírus (descrito pela min '30' amostra).

Como controlos sugerimos que incluem células não infectadas. O sinal seguinte STV-Cy3 coloração de células falsamente infectadas dá ao fundoresultante do protocolo de coloração. Um controlo para IAV fixação é o pré-tratamento das células com neuraminidase bacteriana (NA). NA cliva off ácido siálico de glicoproteínas celulares, removendo-se assim os receptores de ligação da superfície da célula. A azida de sódio (SA) é um potente inibidor metabólico e, desse modo bloqueia a endocitose 13. As células tratadas com azida de sódio deve ser positiva para a ligação do vírus, mas negativo para a internalização.

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Protocolo

Nota antes do início: Capa de Uso de fluxo laminar e biocontainment apropriado quando se trabalha com vírus vivo. Aqui, descrevemos as condições de crescimento adequadas para estirpe do vírus influenza cultura A / WSN / 33. Multiplicidade de infecção (MOI) de incubação e tempos podem variar dependendo da estirpe do vírus utilizado.

1. Preparação de biotinilada / WSN / 33

  1. Semente de células para um balão T175 cm 2 utilizando Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina-estreptomicina (Pen / Strep) Madin-Darby kindey canino (MDCK). As células de cultura a 37 ° C até cerca de 70% de confluência é atingido.
  2. Antes de infecção, remover o meio e lava-se as células com solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH7.0-7.3) pela adição de um grande volume suficiente para cobrir a monocamada de células.
  3. Remover PBS e infectar as células com A / WSN / 33 com uma MOI de 10 -4. Dilui-se o vírus em PBS suplementado com 0,02 mg de Mg 2+, Ca 2+ de 0,01 mg </ sup>, 0,3% de albumina de soro bovino (BSA), e 1% de Pen / Strep (infecção-PBS). Usar um inoculo de 4 ml para um balão T175 cm 2.
  4. Incubar as células 1 h a 37 ° C. Remover por aspiração e inoculo de pipeta 10 ml de DMEM suplementado com 0,3% de BSA, 20 mM de HEPES, e 1% de Pen / Strep para o balão.
  5. Incubar as células a 37 ° C durante cerca de 3 dias até o efeito citopático (ECP) é visível, e depois da colheita sobrenadante. CPE pode ser reconhecido como arredondamento das células, seguido por descolamento e morte das células 14.
  6. Rotação sobrenadante a 450 xg durante 5 min para remover os detritos celulares. Transfira o sobrenadante para um novo tubo falcon e repita este passo mais uma vez. Descartar as pelotas.
  7. Sobrenadantes de transferência para tubos de ultracentrífuga e sobrenadantes underlay com 5 ml de sacarose a 30% diluído em tampão NTE (Tris 10 mM [pH 7,4], NaCl 100 mM, EDTA 1 mM). Equilibrar os tubos antes de ultracentrifugação e encher-se com PBS para atingir um volume final de 30 ml. Spin supernates em 112.398 xg (correspondente a 25.000 rpm durante um rotor SW28) durante 90 minutos em uma ultracentrífuga.
  8. Remova cuidadosamente o sobrenadante por pipetagem e mergulhar pellet vírus durante a noite a 4 ° C em 250 mL PBS. Ressuspender pellet pipetando cima e para baixo. Medir o teor de proteína do vírus purificado pelo ensaio de Bradford 15.
  9. Usar um kit de biotinilação para gerar biotinilado A / WSN / 33. Siga as instruções do fabricante.
  10. Em breve, adicionar a quantidade apropriada de biotina para o vírus purificado e incubar durante 2 horas em gelo. Transferir vírus para um tubo de ultracentrífuga e o tubo de enchimento se com PBS para atingir um volume final de 30 ml. Gire vírus a 112.389 xg durante 90 min em uma ultracentrífuga. Remover o sobrenadante por pipetagem e adicionar 250 ul de PBS. Soak pelete durante a noite a 4 ° C. Alíquotas e armazenar o vírus biotinilado armazenado a -80 ° C altura em que será estável durante pelo menos 24 meses.
    NOTA: Pode ser útil para determinar o título do biotinilado preparação de IAV por ensaio de placa padrão. No entanto, deve notar-se que o protocolo subsequente só irá medir partículas de vírus biotinilados. Restante partículas não biotiniladas devido à biotinilação incompleta irá contribuir para o título infeccioso por ensaio de placas, mas não para o sinal medido no ensaio de fixação / internalização.

2. Determinar a quantidade necessária de Biotinilado Virus

NOTA: Antes do ensaio de fixação / internalização é realizada, é importante para determinar a quantidade de vírus necessária para infectar biotinilado todas as células de uma amostra.

  1. Cultura e células A549 Trypsinize de acordo com as instruções do fabricante. Contar as células utilizando uma câmara de células. Pipeta células 200.000 A549 em FACS Deepwell tubos. Spin 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento com 200 ul de PBS. Células arrefecer em gelo durante 10 min.
  2. Prepare a 5 diluições em série do biotiestoque de vírus nylated em PBS-infecção.
  3. Rotação tubos contendo as células a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender pellet com 100 ul contendo vírus infecção-PBS. Como o uso de controle de infecção simulada-PBS sem vírus biotinilado. Incubar os tubos em gelo durante 1 hr.
  4. Tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 ul de PBS. Repita este passo mais uma vez.
  5. Para a fixação, tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 100 ul de 3,7% de paraformaldeído (PFA). Incubar durante 10 min à TA. Em seguida, repita o passo de lavagem descrito em 2.4).
  6. Para permeabilização, tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 100 ul de PBS contendo 0,5% de Triton X-100. Incubar durante 6 min à temperatura ambiente. Em seguida, repita o passo de lavagem descrito em 2.4).
  7. Tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender pellet em 50 ul 2% BSA diluído em PBS contendo STV-Cy3. (Por favor, note que a concentração adequada de STV-Cy3 deve ser determinado antes do início do experimento Comece com uma concentração de 1:. 200 e teste de diluições de 2 vezes até 1:. 2400 Em nossas mãos, uma diluição de 1: 1000 provou para ser óptima.)
  8. Incubar 1 hora no escuro à temperatura ambiente. Então, passo de lavagem de repetição descrito em 2.4, mas ressuspender o sedimento em 200 ul de BSA a 2% diluído em PBS.
  9. Analisar amostras por citometria de fluxo 16. Porta na população Cy3 positivo. Escolha a concentração mais baixa de vírus biotinilado resultante do número máximo de células positivas Cy3 na população A549.

3. Determinar a quantidade necessária de Streptavidin


NOTA: A eficiência de bloqueio o sinal obtido a partir do vírus extracelular determina o alcance de detecção do ensaio. Portanto, é importante para revogar o sinal STV-Cy3, tanto quanto possível. ºe quantidade necessária de STV necessário depende da quantidade de estoque de vírus biotinilado utilizado (determinado no ponto 2).

  1. Siga os passos 2,1-2,4, mas usar concentração de vírus determinado no ponto 2.
  2. Preparar diluições em série de cinco vezes de STV diluídos em PBS contendo BSA a 2% e azida de sódio a 0,1%.
  3. Tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender sedimento em 50 ul de diluição STV. Como o uso de controle simulado PBS contendo 2% de BSA e azida de sódio a 0,1%, sem STV. Incubar os tubos durante 30 min em gelo. Em seguida, repita o passo de lavagem descrito em 2.4.
  4. Siga os passos 2,5-2,9. Para o ensaio de internalização, escolher a concentração mais baixa de STV resultando numa forte bloco do sinal de Cy3 (em comparação com a amostra na qual não estava presente STV). Para isso, a percentagem de células positivas com Cy3 ou a intensidade de fluorescência média do sinal de Cy3 pode ser usado. Idealmente, o sinal de Cy3 de amostras tratadas-STV deve ser o mais próximo do sinal de falsamente infectadascélulas possível.

4. Fixação / Interiorização Assay


NOTA: Certifique-se de preparar todos os reagentes antes de iniciar o ensaio. Para os três grupos de controlo apresentados na seção de resultados (células infectadas simulados, células pré-tratadas neuraminidase e células azida de sódio tratados) pequenas alterações ao protocolo são obrigatórios.

  1. Preparar tubos de 16 poços profundos, cada um contendo 200.000 células A549. Ao lado do conjunto experimental que consiste em 4 tubos, há 3 condições de controle, cada um exigindo 4 tubos: células falsamente infectadas, neuraminidase (NA) -pretreated células e células tratadas com azida de sódio. Cada grupo é composto por 4 tubos rotulados como '0 min', '0 min + STV', '30 minutos ', '30 min + STV'.
  2. Tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 ul de PBS.
  3. Tubos de centrifugação a 4 ° C a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender pellet em 200 ul de DMEM contendo 0,3% de BSA, HEPES 20 mM e 1% de penicilina-estreptomicina (meio de incubação). Incubar durante 30 min a 37 ° C.
    NOTA: Para o controlo de neuraminidase: Utilização neuraminidase bacteriana (por exemplo sialidase a partir de Vibrio cholera) a uma concentração de 200 mU / ml diluído em meio de incubação para ressuspender as células.
  4. Tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 ul de PBS. Repetir este passo mais uma vez, em seguida, os tubos frescos para baixo sobre o gelo durante 10 min.
  5. Tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender pellet em 100 ul biotinilados vírus (use a concentração de vírus determinado no ponto 2 diluída em infecção-PBS). Incubar 1 hora em gelo. Em seguida, repita o passo de lavagem descrito em 2.4.
    NOTA: Para o mock-infectados controle: Use infecção-PBS sem vírus. Para o controlo de azida de sódio: A utilização de vírus diluída em PBS-infecção suplementado com azida de sódio a 0,1%.
  6. Prócessamento das amostras após a infecção em gelo:
    1. Para as amostras '0' mínimo, siga o passo 2.5 e armazenar amostras a 4 ° C até que as outras amostras são fixos.
    2. Para a '0 min + STV »amostras, tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em 50 ul STV (utilizar a concentração determinada no ponto 3) diluídos em PBS contendo BSA a 2% e azida de sódio a 0,1% (para evitar a internalização durante o manuseamento da amostra). Incubar 30 minutos em gelo. Siga o passo 2,4-2,5 e armazenar amostras a 4 ° C.
    3. Para as amostras '30 min ', tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 ul de PBS contendo BSA a 2%. Incubar 30 min a 37 ° C. Siga o passo 2,4-2,5 e armazenar amostras a 4 ° C.
      NOTA: Para o controle de azida de sódio: Utilização PBS suplementado com BSA a 2% e azida de sódio a 0,1% para os 30 min de incubação a 37 ° C.
    4. Para o '30 min + amostras STV 'girar tubos a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 ul de PBS contendo BSA a 2%. Incubar 30 min a 37 ° C. Em seguida, os tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em 50 ul STV (utilizar a concentração determinada no ponto 3) diluídos em PBS contendo BSA a 2% e azida de sódio a 0,1% (para evitar a internalização durante o manuseamento da amostra). Incubar 30 minutos em gelo. Siga o passo 2,4-2,5 e armazenar amostras a 4 ° C.
      NOTA: Para o controle de azida de sódio: Utilização PBS suplementado com BSA a 2% e azida de sódio a 0,1% para os 30 min de incubação a 37 ° C.
  7. Siga os passos 2,6-2,8 e analisar amostras por citometria de fluxo. Determinar a percentagem de células positivas Cy3 em cada amostra.
  8. Calcula-se a percentagem em anexo vírus e a quantidade relativa de vírus internalizado.
    1. Para calcular a quantidade de vírus anexado, use a percentagem de Cy3-positive células fechadas ou a intensidade de fluorescência média do sinal de Cy3. Para efeitos de comparação, não tratadas para definir células de 100% (Figura 4B).
      NOTA: O percentual do vírus ligado é descrita pela amostra "0 minutos".
    2. Para calcular a quantidade de vírus internalizado, levar a razão entre a "30 min + STV" amostra ao "30 minutos" de amostra (Figura 5B).
      NOTA: Como mencionado acima, a percentagem de células positivas fechado Cy3 ou a intensidade de fluorescência média do sinal de Cy3 pode ser usado.

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Resultados

Um desenho que descreve as quatro condições experimentais diferentes é mostrada na Figura 1 Os resultados de uma experiência representativa são apresentados nas Figuras 2 -. 5. Na amostra "0 minutos", vírus biotinilado é ligado a frio para células alvo que podem ser visualizadas através de coloração STV-Cy3 (Figuras 1 e 2). Quando um passo de bloqueio (no "0 min + STV" amo...

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Discussão

Nosso protocolo descreve uma maneira fácil de medir fixação e interiorização do vírus por citometria de fluxo. Ele permite a utilização de vírus do tipo selvagem marcado que imita de perto mais infecções por vírus em comparação com a utilização de partículas do tipo vírus (VLP). Enquanto nosso protocolo foi optimizado para medir a fixação e internalização de IAV que pode ser facilmente adaptada para outros vírus. Além disso, como a citometria de fluxo é utilizada para leitura, co-colorações po...

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Divulgações

The authors have nothing to disclose.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Fundação Swiss National Science (31003A_135278) à SST. MOP é o beneficiário de uma subvenção de doutorado do Fundo de Investigação AXA. Agradecemos Patricia Nigg para obter ajuda com o desenho da Figura 1.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMLife Technologies41966-052
FBSLife Technologies10270-106
Penicillin-StreptomycinLife Technologies15140-163
PBSLife Technologies14190-169  
BSAVWR Calbiochem126579
HEPESLife Technologies15630-100
D-SucroseFluka84100
TRISBiosolve BV20092391
EDTASigma-Aldrich3680
EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kitFisher ScientificW9971E 
Bio Rad Protein Bio AssayBio Rad500-0006
deepwell tubes (1.2 ml microtubes)Milian82 00 001
PFA Lucerna chem  Electron microscopy sciences15710
ultracentrifuge tubesHemotec HmbH253070
Triton X-100Fluka93420
STV-Cy3Life Technologies43-4315
STVLife Technologies43-4302
sodium azideFluka71290
bacterial neuraminidase/sialidaseSigma-AldrichN6514-1UN

Referências

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Reimpressões e Permissões

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