Измерение Вложений и интернализации вируса гриппа в клетках А549 методом проточной цитометрии

Резюме

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

Аннотация

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 °C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

Введение

Вступление вируса гриппа А (ИФО) является многоступенчатый процесс, который начинается с связывание вируса с рецепторами на плазматической мембране клеток-мишеней ^1. Рецептор IAV является сиаловой кислоты который присутствует на большом разнообразии гликопротеинов и гликолипидов. Гемагглютинина (HA), белок IAV который присутствует в вирусной оболочке связывается с сиаловой кислотой и тем самым опосредует прикрепление вирусных частиц в плазменной мембране клеток-мишеней ^2. Вирус проникает в клетки через клатрин эндоцитоза, но и альтернативные пути доступа, такие, как макропиноцитозом, были описаны ^3-6. Взаимодействие между НА и сиаловой кислоты оказывается достаточным для опосредования и, привязанность и запуска интернализации вирусных частиц ^7. Тем не менее, альтернативные рецепторы входа были предложены и их роли в IAV вступления в настоящее время расследуются ^1,8,9.

Дворняжкаrently, предпринимаются усилия для выявления факторов, принимающих, которые участвуют в жизненном цикле вируса с целью разработки крайне необходимых новых противовирусных лечения ^10-12. Вирус запись будет благоприятным шагом для таргетинга рост ИФО для того, чтобы блокировать вирусную инфекцию при первой точки. Измерение различные этапы IAV вступления экспериментально сложным, как правило, большое количество вируса требуется, чтобы обнаружить входящий вирус. Кроме того, дальность обнаружения изменений в записи вируса только линейные связи с отсутствием репликации вируса. Это подчеркивает необходимость для анализов с высокой чувствительностью.

Анализ приведем позволяет обнаруживать прикрепленной вируса на клеточной поверхности, а также обнаружение вируса интернализованной по отношению к общему количеству вируса клеточно-ассоциированного. Использование биотинилированного вируса дикого типа обеспечивает удобное измерение с помощью окрашивания СТВ-Cy3 и считывания с помощью проточной цитометрии. Биотинилированный вирус холодной границу к ячейкес, чтобы вложение, но предотвратить интернализацию вирусных частиц. Клетки могут быть фиксированной, проницаемыми и окрашивали STV-Cy3 для измерения прикрепленный вирус. Сигнал от внеклеточных вирионов, прикрепленных может быть отменен, если блокирующий шаг применяется до фиксации, при котором клетки инкубируют с немеченого стрептавидина (СТВ). На следующем этапе, после прикрепления биотинилированного IAV, температура сдвигается до 37 ° С и интернализации вирусных частиц дают проходить. Интернализованная частицы защищены от связывания СТВ тем самым позволяя дискриминацию между вне- и внутриклеточных вирусов.

За экспериментальных условиях, четыре образца требуется: '0 мин': Первый образец, обозначенный "0 мин", состоит в измерении вирус холодной переплете на клеточной поверхности. '0 мин + СТВ ": Второй образец, обозначенный" 0 мин + СТВ ", дает интенсивность сигнала линии эксперимента. Прикрепленный вирус заблокировал остроумиеч СТВ и сигнала после окрашивания STV-Cy3 должны быть значительно ниже, по сравнению с "0" мин образца. '30 Мин ": Третий образец, '30 мин 'содержит прилагается и внутреннюю вирус из-за температурного сдвига до 37 ° С в течение 30 мин. '30 Мин + СТВ ": Четвертый образец, '30 мин + STV 'меры внутриклеточный фракция вирусов. Блокирующий шаг СТВ наносится после 30 мин инкубационного периода. В результате вирусные частицы на поверхности клетки связаны СТВ оставив только интернализированные вирусы для окрашивания СТВ-Cy3. Относительное количество интернализованной вируса может быть вычислена как отношение интернализованной вируса (измеренной в '30 мин + СТВ 'образца), деленное на общее количество вируса (описываемой '30' мин образца).

В качестве контроля мы предлагаем включить макет-инфицированные клетки. Сигнал после СТВ-Cy3 окрашивания макет-инфицированных клеток дает фонПолученный от протокола окрашивания. Контрольную для крепления IAV является предварительная обработка клеток с бактериальной нейраминидазы (НА). NA отщепляет сиаловой кислоты от гликопротеинов, сотовых удаляя рецепторы крепления с клеточной поверхности. Азид натрия (SA) является мощным ингибитором метаболических и, таким образом, блоки ¹³ эндоцитоза. Клетки, обработанные азида натрия должен быть положительным для вируса связывания, но отрицательным для интернализации.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Примечание Перед запуском: капот использования ламинарного потока и соответствующего биоизоляции при работе с живым вирусом. Здесь мы опишем условия, подходящие для роста вируса гриппа штамма культуры A / WSN / 33. Множественность заражения (МВД) и инкубации раз могут варьироваться в зависимости от штамма вируса, используемого.

1. Получение биотинилированных A / WSN / 33 вируса

1. Клетки в T175 ^см 2 с использованием колбу Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина (Pen / Strep) Семя Madin Darby собак-kindey (MDCK). Культуры клеток при 37 ° С до приблизительно 70% слияния будет достигнута.
2. Перед инфекции, удалить среднего и промыть клетки с фосфатно-солевом буфере (PBS, pH7.0-7.3), добавив достаточно большой объем, чтобы покрыть клеточный монослой.
3. Удалить PBS и инфицировать клетки с A / WSN / 33 с МВД 10 ^-4. Развести вирус в PBS с добавлением 0,02 мг Mg ^2+, 0,01 мг ^Са 2+ ^</ SUP>, 0,3% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 1% Pen / Strep (инфекционно-PBS). Используйте посевной 4 мл для T175 ^см 2 колбу.
4. Инкубируйте клетки 1 часа при 37 ° С. Удалить инокулята аспирацией и пипеток 10 мл DMEM, дополненной 0,3% BSA, 20 мМ HEPES и 1% Pen / Strep в колбу.
5. Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение примерно 3 дней до цитопатического эффекта (CPE) не видна, а затем урожай супернатант. CPE может быть признан округление клеток с последующим отряда и смерти клеток ^14.
6. Спин супернатант при 450 х г в течение 5 мин, чтобы удалить клеточные остатки. Перевести супернатант в новую пробирку и сокола повторить этот шаг еще раз. Откажитесь от гранул.
7. Передача супернатанты в Ультрацентрифуга труб и подложкой из супернатантов с помощью 5 мл 30% сахарозы в разбавленных NTE буфере (10 мМ Трис [рН 7,4], 100 ммоль NaCl, 1 мМ ЭДТА). Баланс трубы, прежде чем ультрацентрифугированием и залейте PBS для достижения конечного объема 30 мл. Спин supernaTants на 112,398 мкг (что соответствует 25000 оборотов в минуту для ротора SW28 с) в течение 90 мин в ультрацентрифуге.
8. Осторожно снимите супернатант с помощью пипетки и замочить на ночь таблетку от вирусов при температуре 4 ° С в 250 мкл PBS. Ресуспендируют осадок с помощью пипетки вверх и вниз. Измерьте содержание белка очищенного вируса по Бредфорда ^15.
9. Использование комплекта биотинилирования генерировать биотинилированное A / WSN / 33. Следуйте инструкциям производителя.
10. Вкратце, добавить соответствующее количество биотина к очищенного вируса и инкубируют в течение 2 ч на льду. Передача вируса ультрацентрифужную пробирку и заполнить трубку с PBS, чтобы достичь конечного объема 30 мл. Спин вирус на 112,389 мкг в течение 90 мин в ультрацентрифуге. Удалить супернатант с помощью пипетки и добавить 250 мкл PBS. Замочите гранул в течение ночи при 4 ° С. Аликвоты и хранить вирус биотинилированного хранили при -80 ° С, где она будет стабильной в течение по крайней мере 24 месяцев.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть полезно для определения титра биотинилированной рвозмещение IAV стандартным методом бляшек. Тем не менее, следует отметить, что последующее протокол только измерить биотинилированных вирусные частицы. Оставшееся unbiotinylated частиц из-за неполного биотинилирования будет способствовать инфекционного титра по бляшек, но не измеряемого сигнала в привязанность / интернационализации анализа.

2. Определить необходимое количество Биотинилированный Касперского

Примечание: Перед присоединени / интернализации анализ проводят, важно, чтобы определить количество вируса биотинилированного необходимой для инфицирования все клетки образца.

1. Культура и Trypsinize А549 в соответствии с инструкциями изготовителя. Граф клеток с использованием клеточной камеру. Пипеток 200000 А549 в FACS в шахтах трубы. Спин 3 мин при 450 х г. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 200 мкл PBS. Холодные клетки вниз на льду в течение 10 мин.
2. Подготовка 5-кратным серийных разведений biotinylated вирус складе в инфекционно-PBS.
3. Спин пробирки, содержащие клетки при 4 ° С в течение 3 мин при 450 х г в. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок с 100 мкл вируссодержащей инфекции-PBS. Как макет управления использованием инфекцией PBS без биотинилированного вируса. Инкубируйте пробирки во льду в течение 1 часа.
4. Спин трубки при 4 ° С в течение 3 мин при 450 х г в. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 200 мкл PBS. Повторите этот шаг еще раз.
5. Для фиксации, спиновые трубки при 4 ° С в течение 3 мин при 450 х г в. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 100 мкл 3,7% параформальдегида (PFA). Инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем повторите стирки шаг, описанный в 2.4).
6. Для проницаемости, спиновые трубки при 4 ° С в течение 3 мин при 450 х г в. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 100 мкл PBS, содержащим 0,5% Тритон Х-100. Инкубировать в течение 6 мин при комнатной температуре. Затем повторите стирки шаг, описанный в 2.4).
7. Спин трубки при 4 ° С в течение 3 мин при 450 х г в. Удалить супернатант и ресуспендируют ПеллET 50 мкл в 2% BSA в PBS, разбавленном содержащий STV-Су3. (Пожалуйста, обратите внимание, что в соответствующей концентрации STV-Cy3 должны быть определены до начала эксперимента Начните с концентрацией 1:. 200 и тест-2-кратные разведения до 1:. 2400 В наших руках, разбавление 1: 1000 оказалось оптимальным.)
8. Выдержите 1 час в темноте при комнатной температуре. Затем повторите этап промывки описано в 2.4, но ресуспендируют осадок в 200 мкл 2% БСА в PBS, разбавленного.
9. Анализ образцов цитометрическим ^16. Ворота на Су3-положительного населения. Выбрать самую низкую концентрацию биотинилированного вируса, в результате чего максимальное количество Cy-3-позитивных клеток в популяции А549.

3. Определите необходимое количество стрептавидином

Примечание: Эффективность блокировать сигнал, полученный из внеклеточного вируса определяет диапазон детекции этого анализа в. Таким образом, важно, чтобы отменить сигнал СТВ-Cy3 как можно больше. Чте необходимое количество СТВ необходимо зависит от количества биотинилированного вируса складе используется (определяется в разделе 2).

1. Выполните шаги 2.1-2.4, но использовать концентрации вируса определяется в разделе 2.
2. Подготовьте пять раз серийных разведений СТВ разводили в PBS, содержащий 2% BSA и 0,1% азида натрия.
3. Спин трубки при 4 ° С в течение 3 мин при 450 х г в. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 50 мкл STV разбавления. В макете использования управления ФБР, содержащим 2% BSA и 0,1% азида натрия без СТВ. Инкубируйте пробирки в течение 30 мин на льду. Затем повторите шаг мыть описано в 2.4.
4. Выполните шаги 2,5-2,9. Для анализа интернализации, выбирают наименьшую концентрацию СТВ в результате сильного блока Cy-3 сигнала (по сравнению с образцом, в котором нет СТВ не присутствовал). Для этого, процент Cy3-позитивных клеток или средней интенсивности флуоресценции сигнала Cy3 могут быть использованы. В идеале, сигнал Су3 из STV-обработанных образцов должно быть как можно ближе к сигналу от макета-инфицированныхклетки, как это возможно.

4. Приложение / Интернализации Анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все реагенты подготовить перед началом анализа. За три контрольных групп представлены в разделе результатов (макет инфицированных клеток, нейраминидазы предварительно обработанных клеток и азид натрия обработанных клеток) небольшими изменениями в протоколе не требуется.

1. Подготовьте 16 в шахтах трубы друг, содержащие 200000 клеток А549. Рядом с экспериментальной установки, состоящей из 4 трубок, есть 3 условия управления, каждый из которых требует 4 трубы: макет-инфицированных клеток, нейраминидазы (NA) -pretreated клетки и азид-обработанных клетках натрия. Каждая группа состоит из 4 трубок помечены как '0 мин', '0 мин + СТВ », '30 минут', '30 минут '+ СТВ.
2. Спин трубки при 4 ° С в течение 3 мин при 450 х г в. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 200 мкл PBS.
3. Побочные трубки при 4 ° C при 450 х г. Удалить супернатант и ресуспендируют ПеллET в 200 мкл DMEM, содержащей 0,3% BSA, 20 мМ HEPES и 1% пенициллина-стрептомицина (инкубационной среды). Инкубируют в течение 30 мин при 37 ° С.
   Примечание: Для контроля нейраминидазы: Использование бактериальной нейраминидазы (например сиалидазы из Vibrio холеры) в концентрации 200 МЕ / мл, разбавленного в инкубационной среде для ресуспендирования клеток.
4. Спин трубки при 4 ° С в течение 3 мин при 450 х г в. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 200 мкл PBS. Повторите этот шаг еще раз, а затем прохладный трубы вниз на льду в течение 10 мин.
5. Спин трубки при 4 ° С в течение 3 мин при 450 х г в. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 100 мкл биотинилированных вирус (используйте концентрации вируса определяется в разделе 2, разведенного в PBS-инфекции). Инкубируют 1 час на льду. Затем повторите шаг мыть описано в 2.4.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для макета-инфицированных управления: Используйте инфекции-PBS без вируса. Для контроля азида натрия: Использование вируса, разбавленного в инфекционно-PBS с добавлением 0,1% азида натрия.
6. Заработка образцов после поражения на льду:
   1. Для «0 мин» образцов, выполните шаг 2,5 и хранить образцы при температуре 4 ° С до тех пор, другие образцы не будут исправлены.
   2. Для '0 мин + STV' образцов, спиновых труб при 4 ° С в течение 3 мин при 450 х г. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 50 мкл СТВ (использовать концентрацию определяется в разделе 3), разбавленного в PBS, содержащий 2% BSA и 0,1% азид натрия (для предотвращения интернализации при обращении образец). Инкубируют 30 минут на льду. Следуйте шаг 2.4-2.5 и хранения образцов при 4 ° С.
   3. Для '30 'мин образцов, спиновых труб при 4 ° С в течение 3 мин при 450 х г в. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 200 мкл PBS, содержащим 2% BSA. Инкубируют 30 минут при 37 ° С. Следуйте шаг 2.4-2.5 и хранения образцов при 4 ° С.
      Примечание: Для контроля азида натрия: Применение PBS с добавлением 2% BSA и 0,1% азида натрия для 30 мин инкубации при 37 ° С.
   4. Для «30 мин + образцы СТВ "спина трубки при 4 ° С в течение 3 мин при 450 х г в. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 200 мкл PBS, содержащим 2% BSA. Инкубируют 30 минут при 37 ° С. Затем спиновые трубки при 4 ° С в течение 3 мин при 450 х г в. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 50 мкл СТВ (использовать концентрацию определяется в разделе 3), разбавленного в PBS, содержащий 2% BSA и 0,1% азид натрия (для предотвращения интернализации при обращении образец). Инкубируют 30 минут на льду. Следуйте шаг 2.4-2.5 и хранения образцов при 4 ° С.
      Примечание: Для контроля азида натрия: Применение PBS с добавлением 2% BSA и 0,1% азида натрия для 30 мин инкубации при 37 ° С.
7. Выполните шаги 2.6-2.8 и анализировать образцы с помощью проточной цитометрии. Определить процент Cy-3-положительных клеток в каждой пробе.
8. Рассчитывают процент прикреплен вирус и относительное количество интернализованной вируса.
   1. Чтобы рассчитать количество присоединенных вируса, использовать процент Cy-3 positiве стробированные клеток или интенсивности флуоресценции среднее сигнала Cy3. Для сравнения, установить необработанных клеток на 100% (фиг.4В).
      Примечание: Процент прикрепленной вируса описывается "0" образец мин.
   2. Для расчета суммы интернализованной вируса, взять отношение "30 мин + STV" образца на "30 мин" образца (рис 5B).
      Примечание: Как уже упоминалось выше, процент положительных Cy3 закрытых ячеек или средней интенсивности флуоресценции сигнала Cy3 могут быть использованы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Мультфильм описания четырех различных экспериментальных условиях показано на рисунке 1 Результаты типичного эксперимента представлены на рисунках 2 -. 5. В "0" образец мин, биотинилированный вирус холодной связаны с клетками-мишенями, которые м?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Наш протокол описывает простой способ измерения вложение вирусов и интернализации с помощью проточной цитометрии. Это позволяет использование меченых вирус, который имитирует более близко вирусные инфекции по сравнению с использованием вирусоподобных частиц (VLP) дикого типа. В то вр?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Life Technologies	41966-052
FBS	Life Technologies	10270-106
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140-163
PBS	Life Technologies	14190-169
BSA	VWR Calbiochem	126579
HEPES	Life Technologies	15630-100
D-Sucrose	Fluka	84100
TRIS	Biosolve BV	20092391
EDTA	Sigma-Aldrich	3680
EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit	Fisher Scientific	W9971E
Bio Rad Protein Bio Assay	Bio Rad	500-0006
deepwell tubes (1.2 ml microtubes)	Milian	82 00 001
PFA	Lucerna chem  Electron microscopy sciences	15710
ultracentrifuge tubes	Hemotec HmbH	253070
Triton X-100	Fluka	93420
STV-Cy3	Life Technologies	43-4315
STV	Life Technologies	43-4302
sodium azide	Fluka	71290
bacterial neuraminidase/sialidase	Sigma-Aldrich	N6514-1UN