מדידה מצורף והפנמה של שפעת וירוס בתאי A549 על ידי cytometry הזרימה

Summary

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

Abstract

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 °C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

Introduction

הכניסה של וירוס שפעת (IAV) היא תהליך רב שלבים שמתחיל בכריכה של הווירוס לקולטנים על קרום הפלזמה של תאי המטרה ^1. קולט לIAV הוא חומצת sialic אשר קיים במגוון גדול של גליקופרוטאינים וglycolipids. חלבון hemagglutinin (HA) של IAV אשר שוהה במעטפת הנגיפית נקשר לחומצת sialic ובכך מתווך קובץ מצורף של החלקיקים הנגיפיים על קרום הפלזמה של תאי המטרה ^2. הווירוס נכנס לתאים באמצעות אנדוציטוזה תיווך clathrin אלא גם מסלולי כניסה חלופיים, כגון macropinocytosis, תוארו ^3-6. האינטראקציה בין HA וחומצת sialic נראית מספיק לתיווך שניהם, מצורף ומפעיל הפנמה של חלקיקים נגיפיים ^7. עם זאת, קולטני כניסה חלופית הוצעו ותפקידיהם בכניסת IAV כרגע נחקרים ^1,8,9.

כֶּלֶבrently, נעשים מאמצים לזהות גורמי מארח שמעורבים במחזור החיים של הנגיף במטרה לפתח טיפולים אנטי רומן צורך דחוף ^10-12. כניסת וירוס תהיה צעד חיובי עבור מיקוד צמיחת IAV כדי לחסום זיהום ויראלי בשלב המוקדם ביותר שלה. מדידת שלבים שונים של כניסת IAV ניסוי היא מאתגרת כמו כמויות גדולות של וירוס בדרך כלל נדרשות לזהות את הווירוס הנכנס. בנוסף, טווח גילוי לשינויים בכניסת וירוס הוא ליניארי רק בשל חוסר השכפול נגיפי. זה מדגיש את הצורך במבחנים עם רגישות גבוהה.

Assay אנו מציגים כאן מאפשר זיהוי של וירוס מצורף על פני השטח של התאים, כמו גם זיהוי של וירוס הפנים ביחס לסכום הכולל של הווירוס הקשורים תא. השימוש בוירוס wildtype biotinylated מאפשר מדידה נוחה באמצעות צביעה עם STV-Cy3 וreadout ידי cytometry זרימה. וירוס Biotinylated קר-קשור לתאים כדי לאפשר מצורף אבל למנוע הפנמה של חלקיקים נגיפיים. יכולים להיות קבועים תאים, permeabilized ומוכתמים בSTV-Cy3 למדוד וירוס מצורף. האות מvirions תאית, מצורף יכולה להיות מבוטלת אם צעד חסימה מיושם לפני הקיבעון שבו התאים הודגרו עם streptavidin ללא כותרת (STV). בשלב הבא, לאחר התקשרות של IAV biotinylated, טמפרטורה מוסטת עד 37 מעלות צלזיוס והפנמה של חלקיקים נגיפיים מותר לקחת מקום. חלקיקים הפנימו מוגנים מכריכה של STV ובכך מאפשר האפליה בין וירוסים שמחוץ ולתאיים.

לתנאי ניסוי, ארבע דגימות נדרשות: 'דק' 0 ': המדגם הראשון, שכותרתו' דק '0', הוא למדוד וירוס הנכנס קר על פני התא. 'דק' 0 + STV ': המדגם השני, שכותרתו' דק '0 + STV', נותן את עוצמת האות הבסיסית של הניסוי. וירוס מצורף חסום שנינותSTV שעות והצביעה הבא האות עם STV-Cy3 צריך להיות נמוכים בהרבה בהשוואה למדגם '0 דקות'. '30 דקות ': המדגם השלישי, '30 דקות' מכילה מצורפים והפנימו וירוס עקב שינוי הטמפרטורה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. '30 דקות + STV ': המדגם הרביעי, '30 דקות + STV' צעדי החלק תאיים של וירוסים. צעד חסימת STV מיושם לאחר תקופת הדגירה 30 דקות. כתוצאה מכך, חלקיקים נגיפיים בתא השטח כפופים STV עוזבים וירוסים רק הפנימו זמינים לצביעה עם STV-Cy3. הכמות היחסית של וירוס הפנים ניתן מחושבת כיחס של וירוס הפנים (נמדד בדקות '30 + STV 'המדגם) מחולק בסכום הכולל של וירוס (שתואר על ידי '30 דקות' לדוגמא).

כפקדים אנו מציעים לכלול תאים נגועים מדומים. האות הבאה מכתים STV-Cy3 של תאים נגועים מדומים נותנת רקעכתוצאה מהפרוטוקול מכתים. שליטה לקובץ מצורף IAV היא הטיפול מראש של תאים עם neuraminidase חיידקים (NA). דבק NA את חומצת sialic מגליקופרוטאינים סלולריים, ובכך להסיר קולטנים קובץ מצורף מתא השטח. אזיד הנתרן (SA) הוא מעכב חילוף חומרים חזק ובכך חוסם אנדוציטוזה ^13. תאים שטופלו עם אזיד הנתרן צריכים להיות חיוביים לוירוס מחייב אך שליליים להפנמה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

שים לב לפני התחלה: זרימה למינרית שימוש מכסה המנוע והביו-אטום המתאים בעת עבודה עם נגיף חי. כאן אנו מתארים תנאי גידול מתאימים ל/ WSN זן נגיף שפעת התרבות / 33. פעמים ריבוי של זיהום (משרד הפנים) ודגירה עשויות להשתנות בהתאם לזן נגיף בשימוש.

1. הכנת / WSN וירוס Biotinylated / 33

1. זרע מדין-דארבי kindey כלבים (MDCK) תאים לתוך בקבוק סנטימטר T175 ² באמצעות הנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% FBS ופניצילין, סטרפטומיצין 1% (עט / סטרפטוקוקוס). תאי תרבות על 37 מעלות צלזיוס עד confluency כ -70% הוא הגיע.
2. לפני הזיהום, להסיר בינוני ולשטוף תאים עם פוספט שנאגרו מלוח (PBS, pH7.0-7.3) על ידי הוספת נפח מספיק גדול כדי לכסות את monolayer התא.
3. הסר PBS ולהדביק תאים עם / WSN / 33 עם משרד הפנים של 10 ^-4. לדלל וירוס בPBS בתוספת 0.02 מ"ג Mg ^{2 +,} 0.01 מ"ג Ca ^{2 + <}/ Sup>, 0.3% אלבומין בסרום שור (BSA), ו -1% פן / סטרפטוקוקוס (זיהום-PBS). השתמש בבידוד של 4 מיליליטר לבקבוק סנטימטר T175 ^2.
4. דגירה תאים 1 שעה על 37 מעלות צלזיוס. הסר הבידוד על ידי מיליליטר DMEM 10 שאיפה ופיפטה בתוספת 0.3% BSA, 20 מ"מ HEPES, ו -1% פן / סטרפטוקוקוס לתוך הבקבוק.
5. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך כ 3 ימים עד השפעת cytopathic (CPE) הוא גלוי, ולאחר מכן supernatant קציר. יכול להיות מוכר כCPE עיגול של תאים ואחרי ניתוק ומוות של תאים ^14.
6. ספין supernatant ב 450 XG במשך 5 דקות כדי להסיר פסולת תא. העברת supernatant לתוך צינור בז חדש וחזור על שלב זה עוד פעם אחת. מחק את כדורים.
7. ההעברה supernatants לתוך צינורות ultracentrifuge וsupernatants יסוד עם 5 מיליליטר של סוכרוז 30% בדילול במאגר NTE (10 מ"מ טריס [pH 7.4], 100 מ"מ NaCl, 1 mM EDTA). לאזן צינורות לפני ultracentrifugation ולמלא את עם PBS להגיע סוף נפח של 30 מיליליטר. superna ספיןtants ב112398 XG (המקביל ל 25,000 סל"ד הרוטור SW28) למשך 90 דקות בultracentrifuge.
8. מוציא בזהירות supernatant ידי pipetting ולספוג גלולה וירוס הלילה ב 4 מעלות צלזיוס ב250 μl PBS. Resuspend גלולה ידי pipetting למעלה ולמטה. למדוד את תכולת חלבון של וירוס מטוהר על ידי assay ברדפורד ^15.
9. השתמש בערכת biotinylation ליצור biotinylated / WSN / 33. בצע את ההוראות של היצרן.
10. בקיצור, להוסיף את הכמות המתאימה של ביוטין לנגיף המטוהר ודגירה של 2H על קרח. העבר את הווירוס לצינור ultracentrifuge ולמלא את צינור עם PBS להגיע סוף נפח של 30 מיליליטר. ספין וירוס ב112389 XG במשך 90 דקות בultracentrifuge. הסר supernatant ידי pipetting ולהוסיף 250 μl PBS. משרים גלולה במשך הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. Aliquot ולאחסן את וירוס Biotinylated מאוחסן ב -80 ° C שבו יהיה יציב לפחות 24 חודשים.
    הערה: זה יכול להיות מועיל כדי לקבוע את כייל של p biotinylatedפיצוי של IAV ידי assay פלאק הסטנדרטי. עם זאת, יש לציין כי הפרוטוקול שלאחר מכן יהיה רק ​​למדוד חלקיקי נגיף biotinylated. נותר חלקיקי unbiotinylated בשל biotinylation שלם יתרום לכייל זיהומיות ידי assay פלאק אבל לא לאות שנמדדה בassay המצורף / ההפנמה.

2. לקבוע את הכמות הנדרשת של וירוס Biotinylated

הערה: לפני assay המצורף / ההפנמה מתבצע, זה חשוב כדי לקבוע את כמות נגיף biotinylated הנדרשת כדי להדביק את כל התאים של מדגם.

1. תרבות ותאי A549 trypsinize לפי הוראות היצרן. ספירת התאים באמצעות תא תא. תאי 200,000 A549 פיפטה לFACS deepwell צינורות. ספין 3 דקות ב 450 x גרם. הסר גלולה supernatant וגלולה עם 200 μl PBS. תאים להתקרר על קרח למשך 10 דקות.
2. הכן פי 5 דילולים סידוריים של biotiמניות וירוס nylated בזיהום-PBS.
3. צינורות ספין המכילים את התאים ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר supernatant וגלול גלול עם 100 המכיל וירוס זיהום-PBS μl. כשימוש שליטה מדומה זיהום-PBS ללא וירוס biotinylated. דגירה צינורות על קרח עבור שעה 1.
4. צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר גלולה supernatant וגלול ב200 μl PBS. חזור על פעולה זו עוד פעם אחת.
5. לקיבעון, צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר supernatant וגלול גלול בשל paraformaldehyde 3.7% (PFA) 100 μl. דגירה של 10 דקות ב RT. לאחר מכן, חזור על השלב לשטוף מתואר ב2.4).
6. לpermeabilization, צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר גלולה supernatant וגלול ב100 μl PBS המכיל 0.5% Triton X-100. דגירה של 6 דקות ב RT. לאחר מכן, חזור על השלב לשטוף מתואר ב2.4).
7. צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר פל supernatant והגלולאח בBSA 50 μl 2% בדילול מלא PBS המכיל STV-Cy3. (לתשומת לבך, את הריכוז המתאים של STV-Cy3 צריך להיקבע לפני תחילת הניסוי התחל עם ריכוז של 1:. 200 ובדיקת דילולים פי 2 עד 1:. 2,400 בידיים שלנו, דילול של 1: 1,000 הוכיח להיות אופטימלי.)
8. דגירה שעה 1 בחושך ב RT. ואז, צעד כביסה חוזרת מתואר ב2.4 אבל resuspend גלולה בBSA 200 μl 2% בדילול מלא PBS.
9. ניתוח דגימות על ידי cytometry זרימה ^16. שער על אוכלוסיית Cy3-החיובית. בחר את הריכוז הנמוך ביותר של וירוס biotinylated כתוצאה מהמספר המרבי של תאי Cy3-חיוביים באוכלוסיית A549.

3. לקבוע את הכמות הנדרשת של streptavidin

הערה: היעילות של חסימת האותות שמקורם וירוס תאי קובעת את טווח הגילוי של assay. לכן, חשוב לבטל את אות STV-Cy3 ככל האפשר. הדואר כמות הנדרשת של STV דרוש תלוי בכמות של מניות biotinylated וירוס משמשות (שנקבעו בסעיף 2).

1. בצע את שלבים 2.1-2.4, אבל להשתמש בריכוז וירוס שנקבע בסעיף 2.
2. הכן דילולים סידוריים פי חמישה של STV מדולל PBS המכיל BSA 2% ו -0.1% אזיד הנתרן.
3. צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר supernatant וגלול גלולים בדילול STV 50 μl. כשימוש שליטה מדומה PBS המכיל BSA 2% ו -0.1% אזיד הנתרן מבלי STV. דגירה צינורות במשך 30 דקות על קרח. לאחר מכן, שלב לשטוף חוזר מתואר ב2.4.
4. עקוב 2.5-2.9 צעדים. עבור assay ההפנמה, לבחור את הריכוז הנמוך ביותר של STV וכתוצאה מגוש חזק של Cy3-האות (בהשוואה למדגם שבו לא היה נוכח STV). לשם כך, ניתן להשתמש באחוז תאי CY3-חיובי או את עוצמת הקרינה הממוצעת של אות Cy3. באופן אידיאלי, אות Cy3 של דגימות שטופלו STV צריכה להיות קרובה לאות ממדומה נגועתאים ככל האפשר.

4. קובץ מצורף / ההפנמה Assay

הערה: הקפד להכין את כל חומרים כימיים לפני שמתחיל assay. לשלושת קבוצות הביקורת שהוצגו בסעיף התוצאות (תאים נגועים מדומים, תאים טרום שטופלו neuraminidase ותאים אזיד הנתרן שטופלו) שינויים קטנים לפרוטוקול נדרשים.

1. הכן 16 צינורות deepwell כל המכילים 200,000 תאי A549. בסמוך לסט הניסיוני בהיקף של 4 צינורות, יש 3 תנאי שליטה, כל 4 צינורות הדורשים: תאים נגועים מדומים, neuraminidase (NA) תאים -pretreated ותאים שטופלו אזיד הנתרן. כל קבוצה מורכבת מ -4 צינורות שכותרתו 'דק' 0 ',' דק '0 + STV', '30 דקות ', '30 דקות + STV'.
2. צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר גלולה supernatant וגלול ב200 μl PBS.
3. צינורות ספין בC ° 4 ב 450 x גרם. הסר פל supernatant והגלולet 200 DMEM μl המכיל 0.3% BSA, 20 מ"מ HEPES ו -1% (בינוני דגירה) פניצילין, סטרפטומיצין. דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: לשליטה neuraminidase: neuraminidase חיידקי השימוש (למשל sialidase מVibrio כולרה) בריכוז של 200 mU / מדולל מיליליטר במדיום דגירה לresuspend התאים.
4. צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר גלולה supernatant וגלול ב200 μl PBS. חזור על פעולה זו עוד פעם אחת, ולאחר מכן צינורות מגניבים על קרח למשך 10 דקות.
5. צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר supernatant וגלול גלול ב100 μl biotinylated וירוס (להשתמש בריכוז הווירוס שנקבע בסעיף 2 בדילול מלא בזיהום-PBS). דגירה שעה 1 על קרח. לאחר מכן, שלב לשטוף חוזר מתואר ב2.4.
   הערה: לשליטה נגועות מדומה: השתמש זיהום-PBS ללא וירוס. לשליטה נתרן אזיד: השתמש וירוס בדילול מלא בזיהום-PBS בתוספת 0.1% אזיד הנתרן.
6. Processing של הדגימות לאחר הזיהום על קרח:
   1. לדגימות '0 דקות', בצע את דגימות שלב 2.5 וחנות ב 4 מעלות צלזיוס עד דוגמאות אחרות הם קבועים.
   2. ל'דק '0 + STV' דגימות, צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר supernatant וגלול גלול בSTV μl 50 (להשתמש בריכוז שנקבע בסעיף 3) מדולל PBS המכיל BSA 2% ו -0.1% אזיד הנתרן (כדי למנוע הפנמה בזמן הטיפול לדוגמא). דגירה 30 דקות על קרח. עקוב דגימות צעד 2.4-2.5 וחנות ב 4 מעלות צלזיוס.
   3. לדגימות '30 דקות ', צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר supernatant וגלול גלול ב200 μl PBS המכיל BSA 2%. דגירה 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. עקוב דגימות צעד 2.4-2.5 וחנות ב 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: לשליטה אזיד הנתרן: השתמש PBS בתוספת BSA 2% ו -0.1% אזיד הנתרן לדגירת 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
   4. עבור '30 דקות + דגימות 'STV ספין צינורות ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר supernatant וגלול גלול ב200 μl PBS המכיל BSA 2%. דגירה 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. ואז, צינורות ספין על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ב 450 x גרם. הסר supernatant וגלול גלול בSTV μl 50 (להשתמש בריכוז שנקבע בסעיף 3) מדולל PBS המכיל BSA 2% ו -0.1% אזיד הנתרן (כדי למנוע הפנמה בזמן הטיפול לדוגמא). דגירה 30 דקות על קרח. עקוב דגימות צעד 2.4-2.5 וחנות ב 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: לשליטה אזיד הנתרן: השתמש PBS בתוספת BSA 2% ו -0.1% אזיד הנתרן לדגירת 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
7. בצע את השלבים 2.6-2.8 ולנתח דגימות על ידי cytometry זרימה. לקבוע את אחוז התאים Cy3-חיוביים בכל דגימה.
8. לחשב את וירוס אחוז מצורף וכמות היחסית של וירוס הפנים.
   1. כדי לחשב את כמות הנגיף מצורף, להשתמש באחוז Cy3-positiיש תאים מגודר או את עוצמת הקרינה הממוצעת של אות Cy3. לשם השוואה, להגדיר תאים שלא טופלו עד 100% (איור 4).
      הערה: אחוז הווירוס המצורף מתוארת על ידי המדגם "0 דקות".
   2. כדי לחשב את כמות הנגיף הפנים, לקחת את היחס של "30 דקות + STV" מדגם מדגם "30 דקות" (איור 5).
      הערה: כפי שצוין לעיל, אחוז תאי Cy3 החיוביים מגודרות או את עוצמת הקרינה הממוצעת של אות Cy3 ניתן להשתמש.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

קריקטורה המתארת ​​את ארבעת תנאי ניסוי שונים מוצגת באיור 1 תוצאות של ניסוי נציג מוצגות באיורים 2 -. 5. במדגם "0 דקות", וירוס biotinylated קר-מחויב למקד תאים שניתן דמיינו ידי מכתים STV-Cy3 (איורים 1 ו -2). כאשר צעד חסימה (ב" דקות 0 + ST...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הפרוטוקול שלנו מתאר את דרך קלה של מדידה מצורף וירוס והפנמה על ידי cytometry זרימה. זה מאפשר שימוש בוירוס wildtype שכותרת אשר מחקה באופן הדוק יותר זיהומי נגיף בהשוואה לשימוש בחלקיקים כמו וירוס (אן אל פי). בעוד הפרוטוקול שלנו כבר מותאם למדידה מצורף והפנמה של IAV זה יכול בקלות להיו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Life Technologies	41966-052
FBS	Life Technologies	10270-106
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140-163
PBS	Life Technologies	14190-169
BSA	VWR Calbiochem	126579
HEPES	Life Technologies	15630-100
D-Sucrose	Fluka	84100
TRIS	Biosolve BV	20092391
EDTA	Sigma-Aldrich	3680
EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit	Fisher Scientific	W9971E
Bio Rad Protein Bio Assay	Bio Rad	500-0006
deepwell tubes (1.2 ml microtubes)	Milian	82 00 001
PFA	Lucerna chem  Electron microscopy sciences	15710
ultracentrifuge tubes	Hemotec HmbH	253070
Triton X-100	Fluka	93420
STV-Cy3	Life Technologies	43-4315
STV	Life Technologies	43-4302
sodium azide	Fluka	71290
bacterial neuraminidase/sialidase	Sigma-Aldrich	N6514-1UN