Largo Plazo La cateterización de la linfa intestinal Tronco y colección de linfa en cerdos neonatales

Resumen

We present a surgical procedure to catheterize the intestinal lymph trunk in neonatal pigs to collect large quantities of lipid metabolism components from efferent lymph.

Resumen

Catheterization of the intestinal lymph trunk in neonatal pigs is a technique allowing for the long-term collection of large quantities of intestinal (central) efferent lymph. Importantly, the collection of central lymph from the intestine enables researchers to study both the mechanisms and lipid constitutes associated with lipid metabolism, intestinal inflammation and cancer metastasis, as well as cells involved in immune function and immunosurveillance. A ventral mid-line surgical approach permits excellent surgical exposure to the cranial abdomen and relatively easy access to the intestinal lymph trunk vessel that lies near the pancreas and the right ventral segment of the portal vein underneath the visceral aspect of the right liver lobe. The vessel is meticulously dissected and released from the surrounding fascia and then dilated with sutures allowing for insertion and subsequent securing of the catheter into the vessel. The catheter is exteriorized and approximately 1 L/24 hr of lymph is collected over a 7 day period. While this technique enables the collection of large quantities of central lymph over an extended period of time, the success depends on careful surgical dissection, tissue handling and close attention to proper surgical technique. This is particularly important with surgeries in young animals as the lymph vessels can easily tear, potentially leading to surgical and experimental failure. The video demonstrates an excellent surgical technique for the collection of intestinal lymph.

Introducción

El sistema linfático es un área poco estudiada de la fisiología. Los modelos preclínicos de cateterismo linfático se producen en diferentes especies animales ^1-8 y son utilizados por las industrias farmacéuticas e instituciones de investigación para investigar los mecanismos implicados en lípidos y metabolismo de los fármacos ^{8-12 13-15, 16} metástasis del cáncer con el tratamiento experimental de ^{17, 18} y la función inmune ^-26. Este estudio explora el uso de cateterismo intestinal linfático tronco en un modelo de cerdo doméstico para medir los componentes del metabolismo de las lipoproteínas. metabolismo de las lipoproteínas está implicada en la producción y secreción de quilomicrones, así como cambios en los lípidos asociados y proteína total. Estas consideraciones son importantes, ya que hay grandes diferencias en el metabolismo de los lípidos entre los modelos de roedores y humanos utilizados habitualmente y, como tal, empleando modelos porcinos para recoger la linfa intestinal podría proporcionar información comparable para el estudio de lípidos mímetabo- en las personas ^27-31.

Varias técnicas quirúrgicas se utilizan para recoger la linfa intestinal en grandes especies animales: un enfoque hombro craneal (es decir, torácica cateterización del conducto) ^5, una aproximación lateral flanco superior ^32-34, y una línea media ventral o enfoque paramedian ^22,35. Este video describe en detalle el procedimiento quirúrgico en los cerdos utilizando un enfoque quirúrgico línea media ventral para la cateterización del tronco linfático intestinal. Cuidadosas permisos técnica quirúrgica este método de cateterismo linfático para recoger grandes cantidades de la linfa y de sus componentes durante períodos prolongados de tiempo.

Esta técnica abre una gran variedad de aplicaciones en muchas disciplinas que examinan diversas funciones fisiológicas. Las aplicaciones podrían incluir, pero no se limitan a, las lipoproteínas de todo el cuerpo y el metabolismo de los lípidos, la inmunovigilancia, génesis tumoral y la metástasis, la función intestinal, y la DESARROLLOent y la progresión de la enfermedad inflamatoria intestinal.

Protocolo

Todos los procedimientos descritos en animales de experimentación, tanto en el video y el manuscrito fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional y siguieron las directrices establecidas por el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales.

1. La anestesia quirúrgica y la preparación quirúrgica de los cerdos recién nacidos

1. En una antesala separada, premedicar 25 kg cerdos cerca de la base del cuello con un cóctel de fármacos sedantes anestesia intramuscular que contiene: azaperona (0,3 mg / kg), clorhidrato de ketamina (10 mg / kg), la dexmedetomidina (15 mg / kg).
   Nota: Añadir buprenorfina (0,005-0,02 mg / kg) en el cóctel de fármacos preanestésica para un mejor control del dolor intraoperatorio.
2. Anestesiar a los cerdos con la inhalación de gas isoflurano inhalado (4-5% de isoflurano en 500 ml-1000 ml / min _{de O2)} usando una máscara facial. Visualizar las cuerdas vocales de la laringe usando un alcance de veterinaria (17-25 cm de longitud hoja recta), y aplicar un 10% de esterilización tópica de lidocaína al vocalcuerdas. Dejar que la lidocaína en aerosol para contactar las cuerdas vocales 30 a 60 seg antes de la intubación para reducir la posibilidad de espasmo de las cuerdas vocales y la obstrucción de las vías respiratorias.
3. Intubate los cerdos pasando un tubo endotraqueal con balón (5,0 a 7,0 mm de diámetro interno (ID)) entre las cuerdas vocales y mantener la anestesia con gas isoflurano (0,5 a 2,0% de isoflurano en 1.000-2.000 ml / min O ₂₎ utilizando un cerrado circuito de respiración del aire exhalado sistema de anestesia durante la cirugía. Evaluar el nivel de anestesia por el tono de la mandíbula, y las dos respuestas reflejas del pedal y palpebrales. gas anestésico espirado se compactarse y ventilado fuera de la sala de cirugía.
4. Limpiar la superficie exterior de la oreja con una solución de lavado quirúrgico 2,0% de clorhexidina seguido de un enjuague con alcohol isopropílico al 70%. Con un catéter intravenoso 20 G, sondar una vena de la oreja para proporcionar líquidos por vía intravenosa (solución de Ringer lactato; 5-10 ml / kg / h) durante la cirugía. Asegurar un oxímetro de pulso a la superficie mucosa de la lengua con medcinta de iCal para monitorear el ritmo cardíaco y la saturación de oxigenación de la sangre periférica _(SpO2).
5. Coloque el cerdo anestesiado en una posición de decúbito dorsal y afeitar el abdomen ventral desde la mitad del tórax caudalmente a la cara ventral del pubis. Limpiar esta área con dos alternando 2,0% de clorhexidina lavados quirúrgicos y lavados con agua estéril.
6. Transferir el cerdo anestesiado a la sala de cirugía y aplicar el lavado quirúrgico final de 70% de enjuague alcohol isopropílico, deje que se seque, y luego cubrir el animal.
7. Inserte una sonda de temperatura rectal aproximadamente 2-4 cm en el recto para controlar la temperatura del cuerpo. Coloque los cerdos de una almohadilla eléctrica de recirculación de agua para mantener la temperatura corporal normal (38-40 ° C) durante el procedimiento quirúrgico.
8. Coloque el cerdo con cuatro cortinas toallas colocadas en un patrón cuadrante suprayacente alrededor del abdomen. Coloque la primera cortina a través de xiphisternum, la segunda cortina a lo largo de la cara lateral de abdomen aproximadamente 5 cm lateral a la línea media abdominal. Coloque la tercera cubrir a través de la cresta ileal de la pelvis y el cuarto cortina, como el segundo paño (aunque en el lado opuesto), se coloca a lo largo de la cara lateral del abdomen aproximadamente 5 cm lateral a la línea media abdominal.
9. Coloque un paño de mesa, con una abertura de ranura que permite el acceso a la zona quirúrgica, a través de las cortinas de toallas subyacentes y cubrir el cerdo y toda mesa de operaciones. La caída final es un Steri-paño desechable colocado sobre la mesa de cortina grande.

2. Cirugía abdominal y la cateterización de la linfático intestinal Tronco

1. Hacer una incisión en la piel 20 cm con una cuchilla de escalpelo para exponer los músculos abdominales subyacentes. Incisión en las capas musculares abdominales con electrocauterio monopolar (20 ajuste de vatios) para exponer el peritoneo parietal. Abrir un segmento lineal de 20 cm de peritoneo parietal con tijeras Metzenbaum para acceder a las vísceras abdominales y vasos linfáticos.
2. Coloque un retractor en el aspecto craneal de la incisión quirúrgica para mantener la cavidad abdominal abierta para la duración de la cirugía.
3. Humedecer todos los tejidos con agua caliente (37 ° C) solución salina estéril durante todo el procedimiento quirúrgico. Levante suavemente un gran segmento de intestino incluyendo el colon, intestino ciego, íleon y el yeyuno de la cavidad abdominal y exteriorizar que el flanco izquierdo del cerdo para acceder a la parte superior del abdomen, el hígado y vasos linfáticos. Asegurar el intestino exteriorizado en posición con cortinas de toallas adicionales para formar un cabestrillo para apoyar suavemente el intestino.
4. Localizar el vaso linfático, que establece unos 4 cm craneal-medial de la vena renal derecha, 6 cm ventral caudal-medial- de los capataces cava y por debajo de la cara visceral del lóbulo hepático derecho, cerca del páncreas ^22,36,37. Identificar el vaso linfático como una estructura translúcida yuxtapuesto al segmento ventral derecha de la vena portal ^36,37.
5. Se separa la Vess linfáticoel de la fascia que rodean por las burlas suavemente el tejido adjunto con aplicadores Q-tip. Una vez que las caras laterales de recipiente se separan del tejido circundante, crear una abertura "túnel" bajo el buque con finas punta roma fórceps.
6. Pasar tres suturas de seda 2-0 debajo del vaso linfático con unas pinzas finas. Ligar la sutura más caudal primero para ocluir, dilatar y llenar el recipiente con la linfa. A propósito dejar los extremos de este hilo de sutura relativamente largo (4 cm) para asegurar el catéter al vaso linfático. Colocan otros dos suturas separadas 1,0 cm entre sí y son aproximadamente 1,0-1,5 cm craneales a la sutura caudal garantizado. Deje estas dos suturas con una 'sola lazo de ligadura floja' para permitir la obtención más rápida del catéter en el vaso.
   Nota: El segmento del vaso linfático situado entre la sutura de ligadura más caudal y la sutura media (de las dos suturas craneales) es el sitio para la cateterización. En cuanto a sutura de material, 2-0 poliglactina de sutura puede sustituir a 2-0 suturas de seda, si es necesario.
7. Corte un pequeño agujero en el vaso con tijeras iris y dilatar el vaso con unas pinzas finas romos. Inserto de aproximadamente 1,0 a 1,5 cm de tubo de catéter especializado (4,06 Diámetro exterior (OD) X 2,31 mm ID) con un extremo biselado en el recipiente y atar los dos suturas craneales para asegurar el catéter en su lugar. Usa los extremos de la sutura largos de la sutura caudal para asegurar el catéter al vaso.
8. Lavar el intestino exteriorizado con cantidades copiosas de solución salina tibia y suavemente volver a la cavidad abdominal asegurar el posicionamiento anatómica correcta del intestino.
9. Exteriorizar el catéter en la mitad del flanco izquierdo (5-10 cm ventral desde la fosa paralumbar). Hacer una incisión en la piel con un bisturí y pasar un trocar de la cavidad abdominal a la superficie de la piel para crear una abertura para la exteriorización del catéter. Utilizar una gran pinza de Kelly para exteriorizar el catéter del cav abdominaldad a través del orificio de un trócar.
10. Cerrar el peritoneo parietal con un simple patrón de sutura continua de 2-0 sutura de poliglactina con una aguja redonda (cónica). Cierre las capas musculares abdominales con un simple patrón de sutura interrumpida con una sutura de poliglactina 2-0 en una aguja redonda.
11. Cerrar la piel en un patrón subcuticular con 2-0 sutura de poliglactina en una aguja de corte. Asegurar el catéter exteriorizada a la piel con un patrón de sutura en bolsa de tabaco y una sutura 2-0 nylon en una aguja de corte.
12. Colocar una chaqueta especializado en el cerdo mientras que todavía anestesiado para facilitar su colocación y reducir el estrés del cerdo durante la recuperación.

3. La recuperación post-quirúrgica y la linfa Colección

1. Aproximadamente 10 minutos antes de la interrupción de la anestesia de inhalación, administrar bupenorphine (0,1 mg / kg) por vía intramuscular para proporcionar analgesia inmediata post-cirugía. Continuar bupenorphine (0,1 mg / kg) cada 12 h durante 24-48 horas para manteneranalgesia post-cirugía.
2. Monitorear los cerdos de complicaciones post-quirúrgicas cada 8-12 h durante un período de 7 días.
3. Recoger la linfa en botellas de 500 ml de lavado de polipropileno, revestidos con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), y suplementado con antibióticos; penicilina (6.000 UI), estreptomicina (6 mg) y anfotericina B (3 mg) cada 12 horas durante un período de 7 días.

4. Cuantificación de lipoproteína APOB48, triglicéridos, colesterol y proteínas totales Recogidos de linfa

1. Centrifugar la muestra de la linfa a 1.800 xg durante 5 min a 4 ° C. Recoger el sobrenadante y utilizarla para la cuantificación de triglicéridos, colesterol y proteínas totales.
2. Divida el sobrenadante en tres muestras: una muestra no diluida, un 1:20 de agua destilada muestra diluida y una muestra final se diluyó 1: 100 con agua destilada.
3. Usar el sobrenadante sin diluir para medir niveles de colesterol, con un kit disponible en el mercado.
4. Utilice la 1:20 y 1:100 muestras diluidas para medir niveles de triglicéridos y de proteína total con un kit disponible en el mercado y el ensayo de ácido bicinconínico total de proteína, respectivamente.

5. La cuantificación de la lipoproteína APOB48, recopilada a partir de nódulos ³⁸

1. Determinar la concentración de lipoproteínas de APOB48 con un método de Western Blotting inmune adaptado ^38. linfático total de separada con 3-8% de sodio dodecil electroforesis en gel de poliacrilamida con tris-etilo-(SDS-PAGE).
2. Transferir las proteínas separadas a una membrana de fluoruro de polivinilideno (0,45 micras) y se incuba con un anticuerpo policlonal de cabra a la ApoB (1: 4.000), y luego se unen con un anticuerpo secundario anti-cabra.
3. Cuantificar la lipoproteína APOB48 con quimioluminiscencia utilizando una comparación densitométrica lineal con el estándar de proteína APOB48 roedor purificada.

Resultados

cateterismo linfático del tronco linfático intestinal de cerdos recién nacidos permite colección de aproximadamente 1 l / 24 h de la linfa central sobre un período de 7 días. La linfa recogida en estos experimentos contenía componentes del metabolismo de los lípidos, la proteína es decir, total de la linfa, la lipoproteína de APOB48, triglicéridos, proteínas totales, y el colesterol. La Tabla 1 destaca cantidades representativas de estos componentes lipídicos de muestr...

Discusión

Recogida linfático intestinal es un excelente método para investigar los mecanismos que participan en los lípidos ^8-12 y ^13-15 de drogas metabolismo, metástasis de cáncer de ^16,17, el tráfico de células y la función inmune ^18-26, en varios modelos animales experimentales. De hecho, la capacidad para cosechar grandes cantidades de cualquiera periférica (aferente) y central (eferente y los grandes vasos del tronco) linfático durante un período prolongado ha sido espec...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Miller laryngoscope blade	Welch Allyn	68044	182 mm length
Surgivet advisor: Vital signs monitor	Surgivet	V9203
Rectal temperature probe	Surgivet	V3417
Mono-polar electrosurgery generator	Valley Lab
Metzenbaum scissors	Fine Science	14518-18
Tuffier retractor	Stevens	162-11-676
Mosquito forceps	Stevens	162-7-10
Kelly forceps-curved (14cm)	Stevens	162-7-38
Allis tissue forceps	Stevens	162-7-38
Forceps dressing-eye (10.2cm)	Stevens	162-18-780
Forceps dressing-Adison (12.1cm)	Stevens	162-17-2510
Needle Drivers	Stevens	162-V98-42
Iris scissors	Fine science	14058-11
Circulating water pump	Jorvet	J-783X
Maxitherm-Vinyl blanket	Jorvet	J-784C
Q tip applicators	Fisher Scientific	22-037-960
Catheterization  tubing (4.06 OD X 2.31 ID)	Braintree Scientific Inc.	MRE-160	Micro-Renethane implantation tubing
2-0 silk suture	Ethicon	LA556
2-0 polyglactin suture	Ethicon	J443H	2-0 vicryl
Large animal jacket	Lomir Biomedical Inc.	SSJ2YC
Polypropylene wash bottles	Fisher Scientific	03-409-22C	500 ml
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	D4333
EDTA	Sigma Aldrich	60-00-4
Amphotericin B	Sigma Aldrich	A2411
Azaperone	Elanco Animal Health		Stresnil
Dexmedetomidine hydrochloride	Zoetis	6295	Dexdomitor
Isoflurane	Abbott Animal  Health	05260-5	IsoFlo
Ketamine hydrochloride	Zoetis	2626	Ketaset
Bupenorphine hydrochloride	Champion Alstoe Animal Health		DIN:02347510
6 mm Endotracheal tube	Jorvet	J-165d
10% Lidocaine spray	AstraZeneca		DIN:02003767
4 % Chlorhexidine surgical scrub	Partnar Animal Health	PCH-011	Diluted: 2.0% solution
3M Surgical steri- drape	3M Health Care	1040
SDS page gel	Invitrogen	EA0375BOX	3-8 % tris acetate
Polyvinylidene fluoride membrane	Millipore	IPVH00010	0.45 μm pore size
ApoB antibody	EMD Millipore	AB742	1:4000 dilution
Donkey anti-goat IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnology	Sc-2304
ECL Prime Western Blotting Reagent	GE Healthcare LifeSciences	RPN2232
Triglyceride Kit	Wako Pure Chemicals	998-40391/994-40491
Total Cholesterol Kit	Wako Pure Chemicals	439-17501
Total Protein	Pierce	23225	Bicinchoninic Acid Assay