신생아 돼지에서 림프의 창자 림프 트렁크와 컬렉션의 장기 도관

요약

We present a surgical procedure to catheterize the intestinal lymph trunk in neonatal pigs to collect large quantities of lipid metabolism components from efferent lymph.

초록

Catheterization of the intestinal lymph trunk in neonatal pigs is a technique allowing for the long-term collection of large quantities of intestinal (central) efferent lymph. Importantly, the collection of central lymph from the intestine enables researchers to study both the mechanisms and lipid constitutes associated with lipid metabolism, intestinal inflammation and cancer metastasis, as well as cells involved in immune function and immunosurveillance. A ventral mid-line surgical approach permits excellent surgical exposure to the cranial abdomen and relatively easy access to the intestinal lymph trunk vessel that lies near the pancreas and the right ventral segment of the portal vein underneath the visceral aspect of the right liver lobe. The vessel is meticulously dissected and released from the surrounding fascia and then dilated with sutures allowing for insertion and subsequent securing of the catheter into the vessel. The catheter is exteriorized and approximately 1 L/24 hr of lymph is collected over a 7 day period. While this technique enables the collection of large quantities of central lymph over an extended period of time, the success depends on careful surgical dissection, tissue handling and close attention to proper surgical technique. This is particularly important with surgeries in young animals as the lymph vessels can easily tear, potentially leading to surgical and experimental failure. The video demonstrates an excellent surgical technique for the collection of intestinal lymph.

서문

림프 시스템은 생리학의 파악 하였다 영역입니다. 림프 카테터의 전임상 모델은 다른 동물 종 ^1-8에서 발생하는 지질 ^8-12 및 약물 대사 ^13-15, 실험적인 치료 ^(17)와 암 전이 ^(16)에 관여하는 메커니즘을 조사하기 위해 제약 산업 및 연구 기관에 의해 사용되며, 면역 기능 ^{(18) -26.} 본 연구는 지단백질 대사의 성분을 측정하는 돼지 모델에서 장 림프 트렁크 카테터의 사용을 탐구한다. 지단백질 대사는 생산과 분비 킬로 미크론의뿐만 아니라 연관된 지질 및 총 단백질의 변화에​​ 관여한다. 일반적으로 사용되는 설치류 모델과 인간 사이와 같은 지질 대사에 큰 차이가 있기 때문에이 날 지질 연구를 더 비교 정보를 제공 할 수있는 장 림프를 수집하기 위해 돼지 모델을 사용, 중요한 고려 사항입니다사람들 ^27-31에서 tabolism.

여러 가지 수술 기법은 많은 동물 종에서 장 림프 수집하는 데 사용됩니다 두개골 어깨 접근 방식 (즉, 흉부 덕트 카테터) ^(5), 측면 상부 측면의 접근 방식 ^32-34, 및 복부 정중선 또는 paramedian 접근 ^22,35. 이 동영상은 자세히 장 림프 줄기의 카테터를위한 복부 정중선 수술 방법을 사용하여 돼지의 수술 절차를 설명합니다. 조심 수술 기법의 허가 림프 카테터의이 방법은 장시간에 걸쳐 큰 림프의 수량과 그 구성 요소를 수집합니다.

이 기술은 다양한 생리적 기능을 검사 다양한 분야에 응용 프로그램의 무수를 엽니 다. 응용 프로그램이 포함될 수 있지만, 전신 지질 및 지단백질 대사 immunosurveillance 종양 기원 및 전이, 장 기능, developm, 이에 한정되지 않는다엔트과 장 염증 질환의 진행.

프로토콜

비디오와 원고 모두에 설명 된 실험 동물의 모든 절차는 동물 케어의 캐나다위원회가 설정 한 가이드 라인을 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 관찰 하였다.

1. 수술 마취 및 신생아 돼지의 수술 준비

1. 된 azaperone (0.3 ㎎ / ㎏), 케타민 하이드로 클로라이드 (10 ㎎ / ㎏), 덱스 메데 토미 딘 (15 μg의 / kg) : 분리 대기실에서 25kg에 포함 된 근육 진정 마취 약물 칵테일 목의 기지 근처에 돼지를 premedicate.
   참고 : 향상된 내 수술 통증 조절에 대한 사전 마취 약물 칵테일에 부 프레 노르 핀 (0.005-0.02 ㎎ / ㎏)를 추가합니다.
2. 안면 마스크를 사용하여 (500 ㎖-1000 ml / 분의 _O이 4-5 %의 이소 플루 란) 흡입 이소 플루 란 흡입 가스 돼지 마취. 수의학 후두 범위 (17~25cm 긴 직선 칼날)를 사용하여 성대 시각화 및 보컬 국소 10 % 리도카인 중성화 적용코듀로이 바지. 리도카인 스프레이 성대 경련 및기도 폐쇄의 가능성을 줄이기 위해 삽관에 30 ~ 60 초 전에 성대에 문의 할 수 있습니다.
3. 이소 플루 란 가스로 마취 성대 사이에 수갑을 차고 기관 내 튜브 (5.0-7.0 mm 내부 직경 (ID))를 전달하여 돼지를 삽관 및 유지 보수 (/ 1,000-2,000 ml의에서 0.5 ~ 2.0 %의 이소 플루 란을 분 O _2)를 사용하여 폐쇄 수술을 통해 마취 시스템을 재 호흡 회로. 턱 톤에 의한 마취의 수준, 두 페달과 눈꺼풀 반사 반응을 평가합니다. 만료 된 마취 가스는 소기 및 수술 스위트 외부에 배출된다.
4. 70 % 이소 프로필 알코올 린스 2.0 %의 클로르헥시딘 수술 스크럽 솔루션 귀의 외부 표면을 청소합니다. 수술하는 동안, 20 G 정맥 카테터, 정맥 유체 (5-10 ㎖ / kg / hr로 락 테이트 화 링거액)을 제공 귀 정맥 카테 테르를 꽂다. 의대와 혀의 점막 표면에 맥박 산소 측정기를 고정iCal의 테이프 심박수 및 말초 혈액의 산소 포화도 (SPO _2)를 모니터링한다.
5. 지느러미 누운 위치에 마취 된 돼지를 놓고 치골의 복부 측면에 중반 흉부 꼬리 쪽의 복부 복부를 면도. 이 2.0 %의 클로르헥시딘에게 외과 수술 및 멸균 세척을 교대로이 지역을 청소합니다.
6. 수술 스위트 마취 돼지를 전송하고 70 % 이소 프로필 알코올 린스의 최종 수술 스크럽을 적용, 그것은 건조 할 수 있도록하고 동물을 드레이프.
7. 체온을 모니터링 직장으로 직장 온도 프로브로부터 약 2 ~ 4 cm의 삽입. 수술 중 정상 체온 (38 ~ 40 °의 C)를 유지하기 위해 물 순환 가열 패드에 돼지를 놓습니다.
8. 복부 주위의 상부 사분면 패턴에 배치 네 수건 커튼와 돼지 드레이프. 복부 약 5 (c)의 좌우 측면을 따라, 흉부의 검상 부부를 통해 두 번째 드레이프를 처음 드레이프를 놓습니다복부 정중선에 m의 측면. (반대편에 있지만), 약 5 센티미터 복부 정중선 측 방향 복부의 측면 측면을 따라 배치되는 제 2 드레이프처럼 골반의 회장 크레스트와 네 번째 드레이프에서 세 번째 드레이프를 놓습니다.
9. 기본 수건 커튼을 통해, 수술 부위에 대한 액세스를 허용하는 슬릿 개구, 큰 테이블 드레이프를 놓고 돼지와 전체 수술 테이블 커버. 마지막 드레이프가 큰 테이블 드레이프에 둔 일회용 steri - 드레이프이다.

창자 림프 트렁크 2. 복부 수술 및 도관

1. 기본 복부 근육을 노출 메스 블레이드 20cm의 피부 절개를합니다. 정수리 복막을 노출 모노 폴라 전기 소 (20 와트 설정)으로 복근 층 절개. 복부 내장과 림프관에 액세스 할 수 Metzenbaum 가위와 정수리 복막의 20cm의 직선 세그먼트를 엽니 다.
2. 수술 기간 동안 열린 복강을 유지하기 위해 수술 절개의 두개골 측면에서 트랙터를 놓습니다.
3. 전체 수술 따뜻한 (37 ° C) 멸균 식염수로 모든 조직을 적셔. 조심스럽게 복강에서 결장, 맹장, 회장 및 공장을 포함한 대장의 큰 부분을 들어 올려 상단 복부, 간, 림프관에 액세스 할 돼지의 왼쪽 측면에 외면 화하다. 부드럽게 장을 지원하기 위해 슬링을 형성하기 위해 추가 수건 커튼과 위치에 표면화 소장을 고정합니다.
4. 림프관을 찾은는 약 4cm 오른쪽 신장 정맥, 6cm 꼬리-medial- 대정맥 반장의 복부 및 췌장 ^22,36,37 근처 오른쪽 간 엽의 내장 측면 아래의 두개골 - 중간을 낳는다. 포털 정맥 ^{(36, 37)의} 오른쪽 복부 세그먼트에 나란히 반투명 구조로 림프관을 확인합니다.
5. 림프의 VESS를 분리엘 부드럽게 Q 팁 어플리케이터와 함께 첨부 된 조직을 멀리 괴롭 히고하여 주변의 밴드에서. 용기의 측면 측면이 주변 조직으로부터 분리되면, 미세 무딘는 집게를 팁으로 용기 아래에 "터널"개방을 만들 수 있습니다.
6. 미세 집게로 림프관 아래에 세 2-0 실크 봉합사를 전달합니다. , 폐색 팽창과 림프와 혈관을 채우기 위해 먼저 대부분의 꼬리 봉합사를 결찰. 의도적으로 림프 혈관에 카테터를 확보하기 위해 상대적으로 긴이 봉합 (4cm)의 끝을 둡니다. 다른 두 봉합은 서로 1.0 cm를 분리하고 보안 꼬리 봉합에 두개골 1.0-1.5 cm 약입니다 놓습니다. 혈관에 카테터의 빠른 확보 할 수 있도록 '하나의 느슨한 끈 넥타이'로이 두 봉합을 둡니다.
   참고 : 대부분의 꼬리 결찰 봉합하고 (두 개의 두개골 봉합의) 중간 봉합 사이에있는 림프관의 세그먼트는 카테터를위한 사이트입니다. 스와 관련하여필요한 경우 스트럭처 재료는 2-0 polyglactin 봉합사 2-0 실크 봉합사를 대체 할 수있다.
7. 홍채 가위로 배에 작은 구멍을 잘라 잘 무딘 집게로 혈관을 팽창. 용기에 경 사진 단부와 전문 카테터 튜브 (4.06 외경 (OD) X 2.31 mm의 ID)의 약 1.0-1.5 cm를 삽입하고 제자리에 카테터를 고정하는 두 개의 두개골 봉합을 묶어. 용기에 카테터를 확보하기 위해 꼬리 봉합의 긴 봉합 끝을 사용합니다.
8. 따뜻한 식염수의 풍부한 양으로 표면화 장을 세척하고 부드럽게 창자의 정확한 해부학 적 위치를 확보 복강으로 돌아갑니다.
9. (paralumbar 포사에서 5-10cm 복부) 왼쪽 중간 측면에서 카테터를 외면 화하다. 메스 피부 절개를하고 카테터의 exteriorization위한 개구를 만들 피부 표면에 복강에서 투관침을 통과한다. 복부 CAV에서 카테터를 외면 화하다하기 위해 큰 켈리 집게를 사용하여투관침 개방을 통해 ITY.
10. 라운드 (테이퍼) 바늘 2-0 polyglactin 봉합의 간단한 연속 봉합 패턴 정수리 복막을 닫습니다. 둥근 바늘에 2-0 polyglactin 봉합과 간단한 중단 봉합 패턴으로 복부 근육 레이어를 닫습니다.
11. 절단 바늘에 2-0 polyglactin 봉합과 표피 하 패턴으로 피부를 닫습니다. 지갑 문자열 봉합 패턴 피부와 절단 바늘에 2-0 나일론 봉합사로 표면화 카테터를 고정합니다.
12. 여전히 배치를 용이하게하고 복구하는 동안 돼지의 스트레스를 줄이기 위해 마취 상태에서 돼지 전문 재킷을 놓습니다.

3. 포스트 수술 복구 및 림프 컬렉션

1. 이전에 흡입 마취의 중단에 약 10 분, 즉시 수술 후 진통제를 제공하기 위해 근육 bupenorphine (0.1 ㎎ / ㎏)을 관리 할 수​​ 있습니다. bupenorphine 계속 (0.1 ㎎ / ㎏) 24 ~ 48 시간 유지하기위한 모든 12 시간수술 후 진통제.
2. 수술 후 합병증에 대해 7 일 동안 매일 8 ~ 12 시간을 돼지를 모니터링합니다.
3. 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 코팅 및 항생제로 보충 된 500㎖의 폴리 프로필렌 세척 병 림프를 수집; 페니실린 (6000 IU), 스트렙토 마이신 (6 mg) 및 암포 테리 신 B (3 mg)을 7 일 동안 매 12 시간.

지단백질 ApoB48, 중성 지방, 콜레스테롤 및 총 단백질의 정량 4. 림프에서 수집

1. 4 ℃에서 5 분 동안 1,800 XG에서 림프 샘플을 원심 분리기. 상층 액을 수집하고 중성 지방, 콜레스테롤 및 총 단백질의 정량을 위해 사용합니다.
2. 희석 샘플, 샘플 희석 1시 20분 증류수와 1 희석 최종 샘플 : 증류수로 100 세 샘플로 뜨는을 나눈다.
3. 시판의 키트, 콜레스테롤 수준을 측정하는 희석 상등액을 사용한다.
4. 1시 20분 1:10 사용0 희석 된 샘플은 시판 키트 각각 bicinchoninic 산 총 단백질 분석과 트리글리 세라이드 및 총 단백질 수준을 측정 하였다.

림프 ^{(38)로부터} 수집 된 지단백 ApoB48 5. 정량,

1. 적응 면역 웨스턴 블로 팅 방법 ⁽³⁸⁾ 지질 단백질 ApoB48의 농도를 결정합니다. 3~8% 트리스 초산 나트륨 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)으로 분리 총 림프.
2. 항 - 염소 이차 항체로 바인딩 할 : 폴리 비닐 리덴 플루오 라이드 막 (0.45 μm의)로 분리 된 단백질을 옮기고 형 ApoB (4000 1)에 염소 폴리 클로 날 항체와이를 부화.
3. 정제 설치류 ApoB48 단백질 표준 선형 농도계 비교하여 화학 발광 지단백질 ApoB48 정량화.

결과

신생아 돼지의 창자 림프 트렁크의 림프 카테터는 7 일 동안 약 1 L 중앙 림프의 / 24 시간의 모음을 할 수 있습니다. 이 실험에서 수집 된 림프 지질 대사, 즉 총 림프 단백질, ApoB48 지단백, 중성 지방, 총 단백질, 콜레스테롤의 구성 요소가 포함되어 있습니다. 표 1 주요 세 돼지 풀 림프 샘플에서 이러한 지질 성분의 대표 양. 특히, 림프의 흐름과 지질 성분은 인라인 장 ?...

토론

장 림프를 수집하는 다양한 실험 동물 모델에서 지질 ^8-12 및 약물 ^13-15 대사, 암 전이 ^{16, 17,} 셀 인신 매매와 면역 기능 ^18-26에 관여하는 메커니즘을 조사 할 수있는 좋은 방법입니다. 실제로, 장기간에 걸쳐 어느 주연 (심성) 및 중앙 (원심성 큰 트렁크 용기) 림프 다량 수확 할 수있는 능력은 면역 변조 제 ^18-22을 가진 도전 다음 세포 집단에서 발생하는 시간 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Miller laryngoscope blade	Welch Allyn	68044	182 mm length
Surgivet advisor: Vital signs monitor	Surgivet	V9203
Rectal temperature probe	Surgivet	V3417
Mono-polar electrosurgery generator	Valley Lab
Metzenbaum scissors	Fine Science	14518-18
Tuffier retractor	Stevens	162-11-676
Mosquito forceps	Stevens	162-7-10
Kelly forceps-curved (14cm)	Stevens	162-7-38
Allis tissue forceps	Stevens	162-7-38
Forceps dressing-eye (10.2cm)	Stevens	162-18-780
Forceps dressing-Adison (12.1cm)	Stevens	162-17-2510
Needle Drivers	Stevens	162-V98-42
Iris scissors	Fine science	14058-11
Circulating water pump	Jorvet	J-783X
Maxitherm-Vinyl blanket	Jorvet	J-784C
Q tip applicators	Fisher Scientific	22-037-960
Catheterization  tubing (4.06 OD X 2.31 ID)	Braintree Scientific Inc.	MRE-160	Micro-Renethane implantation tubing
2-0 silk suture	Ethicon	LA556
2-0 polyglactin suture	Ethicon	J443H	2-0 vicryl
Large animal jacket	Lomir Biomedical Inc.	SSJ2YC
Polypropylene wash bottles	Fisher Scientific	03-409-22C	500 ml
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	D4333
EDTA	Sigma Aldrich	60-00-4
Amphotericin B	Sigma Aldrich	A2411
Azaperone	Elanco Animal Health		Stresnil
Dexmedetomidine hydrochloride	Zoetis	6295	Dexdomitor
Isoflurane	Abbott Animal  Health	05260-5	IsoFlo
Ketamine hydrochloride	Zoetis	2626	Ketaset
Bupenorphine hydrochloride	Champion Alstoe Animal Health		DIN:02347510
6 mm Endotracheal tube	Jorvet	J-165d
10% Lidocaine spray	AstraZeneca		DIN:02003767
4 % Chlorhexidine surgical scrub	Partnar Animal Health	PCH-011	Diluted: 2.0% solution
3M Surgical steri- drape	3M Health Care	1040
SDS page gel	Invitrogen	EA0375BOX	3-8 % tris acetate
Polyvinylidene fluoride membrane	Millipore	IPVH00010	0.45 μm pore size
ApoB antibody	EMD Millipore	AB742	1:4000 dilution
Donkey anti-goat IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnology	Sc-2304
ECL Prime Western Blotting Reagent	GE Healthcare LifeSciences	RPN2232
Triglyceride Kit	Wako Pure Chemicals	998-40391/994-40491
Total Cholesterol Kit	Wako Pure Chemicals	439-17501
Total Protein	Pierce	23225	Bicinchoninic Acid Assay