Leche Colección de la rata utilizando tubos capilares y Estimación del contenido de grasa de la leche por Creamatocrit

Resumen

Milk is a primary source of nutrition for the neonate. Analysis of milk components may provide insight into maternal factors that affect offspring health. This protocol describes a manual method of collecting milk samples from the lactating rat, which can then be used for further downstream analysis.

Resumen

Milk, as the sole source of nutrition for the newborn mammal, provides the necessary nutrients and energy for offspring growth and development. It also contains a vast number of bioactive compounds that greatly affect the development of the neonate. The analysis of milk components will help elucidate key factors that link maternal metabolism and health with offspring growth and development. The laboratory rat represents a popular model organism for maternal studies, and rat milk can be used to examine the effect of various maternal physiological, nutritional, and pharmacological interventions on milk components, which may then impact offspring health. Here a simple method of manually collecting milk from the lactating rat that can be performed by a single investigator, does not require specialized vacuum or suction equipment, and provides sufficient milk for subsequent downstream analysis is described. A method for estimating the fat content of milk by measuring the percentage of cream within the milk sample, known as the creamatocrit, is also presented. These methods can ultimately be used to increase insight into maternal-child health and to elucidate maternal factors that are involved in proper growth and development of offspring.

Introducción

La leche es la única fuente de nutrición para los mamíferos recién nacidos, el suministro de energía y nutrientes para el crecimiento infantil y desarrollo ^1,2. Mientras que la leche se compone principalmente de células, lípidos, y proteínas ^1, también contiene una gran cantidad de compuestos bioactivos que modulan el desarrollo primeros años de vida de la descendencia incluyendo enzimas, carbohidratos, hormonas, anticuerpos, factores de crecimiento, citoquinas, exosomas, microvesículas, y pequeños RNAs tales como microARN ^1,2. El papel fundamental de la leche materna en el establecimiento de inmune y la salud intestinal ³ crías, junto con la evidencia de que los lactantes amamantados son menos susceptibles a la enfermedad ^2, pone de relieve la importancia de identificar los componentes de la leche asociados a los procesos de enfermedad en la vida temprana y los mecanismos moleculares implicados en sus acciones. La rata en desarrollo es un modelo popular para investigar el efecto de diferentes nutricional, fisiológica, y las intervenciones químicas en principiosdesarrollo -life ^4. El análisis de la leche de rata puede, por tanto, proporcionar nuevos visión de la salud materna y la descendencia.

Los avances científicos actuales ofrecen ahora el aumento de oportunidades para investigaciones en profundidad de los efectos de los componentes de la leche específicos sobre la salud y la enfermedad. Por ejemplo, la secuencia de los perfiles de bacterias de la leche ha dilucidado su papel en la colonización intestinal temprana del intestino del bebé ^5, el análisis de espectrometría de masas de los oligosacáridos de la leche han proporcionado información sobre la alteración de los perfiles de oligosacáridos de la leche a través de la dieta materna ^6, y profundo secuenciación de microARN secretada en los glóbulos de grasa de la leche materna pone de manifiesto posibles funciones en la transcripción de genes, el metabolismo y la función inmune ^7.

Modelos de ratas representan uno de los organismos modelo más populares utilizados en los estudios maternos ^8,9. Una ventaja es sus períodos de gestación y lactancia cortas, solamente approximat duraderosely 21 días cada uno; Por lo tanto, el tiempo total desde el comienzo del embarazo para la lactancia representa un corto período de tiempo en el que los datos valiosos pueden ser generados. El mayor tamaño de las ratas en comparación con ratones, en el contexto de recogida de leche, puede proporcionar una ventaja significativa con respecto al volumen de leche y la facilidad de recolección de la leche; la producción de leche en el ratón, por ejemplo, parece ser depende del peso corporal total con los ratones más pesados ​​que producen más leche ^10.

Aquí, se proporciona una descripción general para la recolección manual de la leche de ratas lactantes. Este protocolo requiere un mínimo de equipo, es no invasivo, de bajo costo, y se puede utilizar para recoger volúmenes adecuados de la leche para análisis posteriores aguas abajo. En resumen, la presa se anestesia con isoflurano, la bajada de leche es estimulada por la oxitocina, y la leche se recoge en tubos capilares a través de la extracción manual de la leche. Por último, como dos componentes principales de la leche son grasas y proteínas, una breve descriptiose presenta n de estimar el contenido de grasa de la leche mediante mediciones creamatocrit ^{11 y} cuantificación de concentración de proteína total utilizando un ensayo de proteína estándar.

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Protocolo

Este protocolo fue aprobado por la Universidad de Comité de Cuidado de Animales de Calgary y conforme a la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Separe la presa de Offspring

1. Separar la presa de su descendencia por un mínimo de 5 minutos antes de ordeño ^12.
   NOTA: La presa puede ser ordeñada hasta 5-6 horas después de la separación ^1,6,13, sin embargo períodos de separación de más de 4 horas pueden alterar la composición de la leche ^14. Mientras que el tiempo de separación no parece afectar el volumen de recogida de leche ^12, se aconseja que un tiempo de separación consistente mantenerse durante todo el estudio. Composición de la leche pueden cambiar durante la lactancia ^15, por lo tanto, se debe hacer intentos para mantener el día de la recogida de leche consistente. Se sugiere la producción máxima de leche que se producen en días de lactancia 14 ^12.
2. Utilizando una cámara de calentamiento, asegúrese de que los cachorros son capaces de mantener temperatu de la carrocería adecuadare sin la presencia de su madre durante la duración del procedimiento de ordeño.
   NOTA: En el estudio se presenta a continuación, el ordeño se realizó en el destete, cuando las presas eran aproximadamente 22 semanas de edad y de las crías de 21 días de edad, se utilizó por lo tanto ninguna cámara de calentamiento.

2. Instalación y Preparación

1. Recoger todos los materiales necesarios para el procedimiento de ordeño.
   NOTA: Todos los materiales se pueden encontrar en la tabla de materiales y equipos.
2. Coloque una almohadilla térmica en el banco donde ordeño se llevará a cabo y para abarcar la almohadilla con un banco absorbente bajo-pad.
3. Configurar el sistema anestésico. Asegúrese de que el sistema tiene oxígeno e isoflurano antes de comenzar suficiente. Coloque la máscara de anestesia que se utilizará para la inducción de la anestesia inicial a la máquina. Coloque la máscara que se utilizará para el mantenimiento de la anestesia cercana si es diferente de la máscara de anestesia inicial.
4. Adjunte una aguja de 25 G a una jeringa de 1 ml de oxitocinainyección utilizando una técnica aséptica.
5. Encienda la almohadilla térmica de modo que se mantiene la temperatura del cuerpo de la madre durante el procedimiento de ordeño. NOTA: Controle la temperatura de la almohadilla térmica para asegurar la almohadilla no se convierta en demasiado caliente y causar quemaduras. Alternativamente, utilizar una fuente de calor, tal como una mesa quirúrgica calentada, que se puede ajustar a una temperatura específica.

3. Anestesiar la presa de Uso isoflurano

1. Abra el tanque de oxígeno y gire el flujo a 1 L (1000 cc) por min. Encienda el flujo de isoflurano y se puso a 5%. ATENCIÓN: Evitar la inhalación directa de anestesia y evitar la acumulación de vapores anestésicos.
2. Anestesiar la presa.
3. Cambiar a la máscara de mantenimiento, si es necesario, la colocación de la supina presa en la plataforma de banca absorbente. Confirme anestesia por la falta de reflejo de pedal.
4. Reducir el flujo de isoflurano al 2-3% para el mantenimiento de la anestesia. Monitorear continuamente presa durante todo el procedimiento para asegurarse depression de la respiración no se produce. NOTA: Una vez bajo anestesia, los ojos de la presa deben protegerse utilizando un lubricante ocular estéril para evitar que los ojos se sequen o se raye.

4. La oxitocina Inyección

1. Asegúrese de que la oxitocina (20 unidades USP / ml) no ha pasado su fecha de caducidad. Desinfectar el vial de oxitocina con un alcohol estéril limpie / almohadilla de limpieza de alcohol.
2. Utilizando una técnica aséptica, elaborar 2 UI (0,1 ml) de la oxitocina en la jeringa. Use una aguja y una jeringa para cada presa que se ordeñaba.
   NOTA: La oxitocina dosis varían generalmente de inyecciones únicas de 1 a 5 UI ^1,6,12,16. Alternativamente, una dosis de 4 UI / kg de peso corporal se puede utilizar ^12. Una sola dosis de 2 UI puede repetirse una vez si se encuentra dificultad de ordeño.
3. Inyectar la oxitocina por vía intraperitoneal. Inserte la aguja en el cuadrante inferior derecho del abdomen con la aguja apuntando hacia la cabeza, en un ángulode 15-30 °, aproximadamente 0,5 cm de profundidad.
4. Tire hacia atrás el émbolo para asegurarse de presión negativa antes de la inyección. Si cualquier líquido (sangre, orina, contenido intestinal, etc.) se aspira con la jeringa, retire la aguja e intentar la inyección con una aguja y jeringa. Si hay líquido se aspira inyectar la oxitocina y desechar la aguja y jeringa inmediatamente en un contenedor de riesgo biológico.
5. Espere aproximadamente 5 a 15 minutos para la oxitocina para estimular la bajada de la leche.

5. Preparación de Sitios de ordeño

1. Elija los sitios / los pezones de la que se obtuvo leche. La leche puede ser recogida desde cualquier tetina ^12.
2. Retire suavemente la piel alrededor de los pezones para ser ordeñadas con los trimmers, como la piel puede causar dificultad en la recolección de la muestra debido a la absorción de la leche. Sea amable - la piel alrededor de los pezones es extremadamente sensible y puede estar seca y, como tal, es susceptible a los rasguños y las lágrimas.
3. La esterilización de la i tetinas no es necesario, pero opcionalmente, limpiar el pezón con agua tibia después de retirar la piel. Preparar al menos dos sitios como más de un sitio puede ser necesaria para la recogida de leche.
   NOTA: Si el análisis de la leche incluye perfiles microbiana, el área del pezón puede requerir esterilización con yodo ^5.

6. Leche Colección

1. Apriete suavemente la base del pezón, expulsar manualmente la leche para la colección.
   NOTA: Si el análisis de la leche incluye perfiles microbiana, las primeras gotas de leche deben ser desechados.
2. Recoger las gotas de leche en un tubo capilar, llenando el tubo capilar. Tubos capilares que se adaptan a volúmenes más grandes (por ejemplo, 50 l) facilitar el proceso.
   NOTA: Si se encuentra dificultad en la recogida de la leche, una segunda dosis de oxitocina puede ser administrado. Se recomienda que la dosis sea superior a 4 UI totales.
3. Prescindir de la leche desde el tubo capilar en un tubo de microcentrífuga estériltocando el extremo del tubo que se utilizó para extraer la leche de la teta a un lado del tubo de microcentrífuga - observar la leche que se extrae del tubo capilar a través de la acción capilar.
   NOTA: 'Blow out' de la leche que no se introduce en el tubo usando una aguja de 18 G unida a una jeringa de 1 ml.
4. Monitorear continuamente la presa para detectar signos de dolor o depresión respiratoria y ajustar el flujo de isoflurano en consecuencia.
5. Continuar para recoger la leche como se describe en esta sección hasta suficiente leche se ha recogido para el análisis de la leche elegido. Para la determinación de la concentración creamatocrit y la proteína se describe a continuación, recoger 0,25 ml de leche.
   NOTA: Utilice un sitio de ordeño diferente si bajada de la leche disminuye o el sitio elegido no expulsa la leche suficiente. Un máximo de aproximadamente 2,5 ml de leche por animal puede ser recogida ^17, o hasta 0,5 ml por pezón. Los autores recomiendan que el tiempo total bajo anestesia se limitará a aproximadamente 45 a 60 minutos, or 45 min de ordeño.
6. Recogida de la leche en un tubo microhematocrito para la medición creamatocrit partir de muestras de leche fresca, y sellar el extremo del tubo con sellador de arcilla. Etiquetar el tubo microhematocrito con el ID de presa y almacenar la muestra de leche en posición vertical.
7. Cuando el ordeño es completa, apague el flujo de isoflurano y oxígeno. Retire la máscara de la presa y continuar monitoreando la presa hasta que despierto. Se recomienda que si no es plenamente consciente, la presa se debe colocar en una almohadilla absorbente banco durante el período de recuperación, en lugar de hacerlo directamente sobre la ropa de cama de la jaula, para evitar que la ropa de cama de ser aspirados o rascarse los ojos de la presa durante la recuperación.
   NOTA: No deje desatendida la presa hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener recumbancy esternal.
8. Si no se requieren nuevos análisis, congelar la leche a -80 ° C. Otros han sugerido que la leche se puede almacenar durante un máximo de 3 horas a 4 ° C o 5 meses a -20 ° C ^18.

7. Medición Creamatocrit

1. Estimar el contenido de grasa en la leche mediante el cálculo del creamatocrit leche (el porcentaje de la crema en la muestra de leche) ^19.
   NOTA: Las mediciones con la leche humana han demostrado que la leche ya sea fresco o congelado puede ser usado para una medición creamatocrit, sin embargo leche fresca es más altamente correlacionado (r = 0.92 r = 0,90 frente) con la concentración de lípidos ^11. El uso de leche fresca o congelada para mediciones creamatocrit debe mantenerse coherente en el estudio, como la leche descongelada se asocia con una pequeña disminución en los valores creamatocrit ^11.
2. Para la leche fresca, se recoge una muestra de leche de la teta en un tubo microhematocrito; rellenar al menos ¾ de su capacidad (aproximadamente 15-20 l). Alternativamente, dibujar leche fresca de la muestra recogida en el tubo capilar después de mezclar bien. Selle el extremo con sellador de arcilla.
3. Coloque el tubo capilar en el spinner hematocrito, con elextremo sellado apuntando hacia el exterior, asegurando la centrífuga es equilibrada.
4. Comience el spin hematocrito (120 segundos a 13.700 xg).
   NOTA: El tiempo de la vuelta o la velocidad pueden variar dependiendo del modelo de centrífuga utilizada.
5. Retire el tubo de la centrífuga después de la vuelta es completa y realizar las mediciones para calcular el creamatocrit. Observe la separación de la muestra en una capa de crema y una capa transparente.
6. Medir y registrar la longitud total de fluido en el tubo y la longitud de la grasa (crema) capa usando pinzas o una regla.
   NOTA: El creamatocrit se expresa como el porcentaje de la capa de crema dentro de la muestra de la leche ^19, calculado como (longitud de capa de crema / longitud total de la columna de la leche) x 100 (Figura 1A). Calcular los valores de concentración y la energía de grasa de la medición creamatocrit como sigue: concentración de grasa (g / L) = (creamatocrit (%) - 0.59) /0.146 (Figura 1B) ^19; Valor energético (kcAl / L) = 290 + (66,8 * creamatocrit (%) (Figura 1C) ^19.

8. Proteína Concentración Determinación

1. El uso de albúmina de suero bovino como un estándar de proteína, determinar la concentración total de proteína de la leche utilizando un ensayo estándar de la proteína, tal como una proteína ensayo de Lowry ^6.
   NOTA: La dilución de la leche puede ser necesario para las mediciones de proteína de leche que caigan dentro de la curva estándar del ensayo.

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Resultados

La leche se recogió como se describe en el destete de las presas Wistar (aproximadamente 22 semanas de edad, pesando 350 a 400 g) que consumió un control (AIN-93G, n = 5), alta en proteínas (40% de caseína p / p, n = 5) o alto contenido de fibra prebiótica (21,6% peso / peso, 1: 1 relación de oligofructosa e inulina, n = 4) dieta a lo largo embarazo y la lactancia. La dosis de oxitocina fue 2 IU. La leche se recogió usando tubos capilares, y un tubo se centrifugó utilizando una centrifugadora de hematocrito para...

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Discusión

Investigations into maternal milk components have increased as interest in early life development research rises. As the sole source of nutrition during the neonatal period, the bioactive compounds in milk are essential for ideal growth and development, especially in the context of intestinal and immune health³. The method presented here is a simple, non-invasive method of collecting milk from the lactating rat in amounts sufficient for downstream analysis, such as oligosaccharide profiling⁶. The me...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment - Milking
1 ml syringes	BD-Canada	309602
25 G needles	BD-Canada	305122
18 G needles	BD-Canada	305196
50 μl Microdispenser Capillary Tubes	Fisher Scientific	21-169D
Oxytocin (20 USP Units/ml)	Bimeda-MTC	1OXY015
PPC Vet Isoflurane Inhalation Anesthetic, 250 ml	Fresenius Kabi	M60302	Used on the order of a veterinarian
Sterile Alcohol Prep Pad	Dukal	853
Absorbent Bench Underpad	VWR	82020-845
Maxi-Therm Hyper/Hypothermia Blanket	Cincinnati Sub-Zero	274
Rodent Anesthesia Machine with Vaporizer	Benson Medical Industries Inc.		Subject to individual laboratory needs
Animal Masks	Benson Medical Industries Inc.	50100/50102
Microcentrifuge Tubes	Axygen	MCT-060-C
ChroMini Professional Trimmer	Wahl
Equipment - Creamatocrit
StatSpin SafeCrit Plastic Microhematocrit Tubes (Untreated)	Fisher Scientific	22-274-914
Critoseal Capillary Tube Sealant Tray	VWR	470161-478
StatSpin CritSpin Microhematocrit Centrifuge	Beckman Coulter, Inc	X00-004999-001