La collecte du lait dans le rat en utilisant tubes capillaires et estimation de la teneur du lait en matières grasses en Creamatocrit

Résumé

Milk is a primary source of nutrition for the neonate. Analysis of milk components may provide insight into maternal factors that affect offspring health. This protocol describes a manual method of collecting milk samples from the lactating rat, which can then be used for further downstream analysis.

Résumé

Milk, as the sole source of nutrition for the newborn mammal, provides the necessary nutrients and energy for offspring growth and development. It also contains a vast number of bioactive compounds that greatly affect the development of the neonate. The analysis of milk components will help elucidate key factors that link maternal metabolism and health with offspring growth and development. The laboratory rat represents a popular model organism for maternal studies, and rat milk can be used to examine the effect of various maternal physiological, nutritional, and pharmacological interventions on milk components, which may then impact offspring health. Here a simple method of manually collecting milk from the lactating rat that can be performed by a single investigator, does not require specialized vacuum or suction equipment, and provides sufficient milk for subsequent downstream analysis is described. A method for estimating the fat content of milk by measuring the percentage of cream within the milk sample, known as the creamatocrit, is also presented. These methods can ultimately be used to increase insight into maternal-child health and to elucidate maternal factors that are involved in proper growth and development of offspring.

Introduction

Le lait est la seule source de nutrition pour les mammifères nouveau-nés, la fourniture d'énergie et de nutriments pour la croissance du nourrisson et le développement ^1,2. Bien que le lait se compose principalement de cellules, des lipides et des protéines ^1, il contient également une pléthore de composés bioactifs qui modulent le développement du début de la vie de la progéniture y compris des enzymes, des glucides, des hormones, des anticorps, des facteurs de croissance, des cytokines, des exosomes, des microvésicules et de petits ARN tels comme microARN ^1,2. Le rôle fondamental du lait maternel dans l'établissement de la progéniture immunitaire et la santé intestinale ^3, couplée avec la preuve que allaités nourrissons sont moins sensibles à la maladie ^2, met en évidence l'importance d'identifier les constituants du lait associés aux processus de la maladie en début de vie et les mécanismes moléculaires impliqués dans leurs actions. Le rat est le développement d'un modèle populaire pour étudier l'effet de divers nutritionnelle, physiologique, et les interventions chimiques sur débutdéveloppement -life ^4. L'analyse du lait de rat peut donc fournir de nouvelles précisions sur la santé maternelle et la progéniture.

Avancées scientifiques actuelles prévoient maintenant accroître les possibilités d'enquêtes approfondies sur les effets des constituants du lait spécifiques sur la santé et la maladie. Par exemple, le séquençage des profils bactériennes du lait a élucidé leur rôle dans la colonisation intestinale au début de l'intestin du nourrisson ^5, masse analyse par spectrométrie d'oligosaccharides de lait ont donné un aperçu de la modification des profils d'oligosaccharides de lait par l'alimentation ^maternelle 6, et de séquençage profond des microARN sécrétée dans les globules de lait maternel de graisse met en évidence les rôles possibles dans la transcription des gènes, le métabolisme et la fonction immunitaire ^7.

Des modèles de rats représentent l'un des organismes modèles les plus populaires utilisés dans les études maternels ^8,9. Un avantage est leur période de gestation et de lactation courts, qui ne durent que approximatEly 21 jours chacune; par conséquent, le temps total depuis le début de la grossesse de lactation représente un court laps de temps dans lequel les données de valeur peuvent être générés. La plus grande taille de rats par rapport à des souris, dans le contexte de la collecte du lait, peut fournir un avantage significatif par rapport au volume de lait et de la facilité de collecte du lait; la production de lait chez la souris, par exemple, semble dépendre du poids total du corps avec des souris lourds produisant plus de lait ^10.

Ici, une description générale pour la collecte manuelle de lait de rates allaitantes est fourni. Ce protocole nécessite un minimum d'équipement, est non invasif, peu coûteux, et peut être utilisé pour collecter des volumes adéquats de lait pour d'autres analyses en aval. En bref, le barrage est anesthésié avec de l'isoflurane, la descente du lait est stimulée par l'ocytocine, et le lait est recueilli dans des tubes capillaires par l'intermédiaire de l'expression manuelle du lait. Enfin, comme deux composantes majeures de lait sont grasses et des protéines, une brève description de l'estimation de la teneur en graisse du lait en utilisant des mesures de creamatocrit ^{11 et} la quantification de la concentration totale en protéines en utilisant un dosage de protéine standard est présenté.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

Ce protocole a été approuvé par l'Université de Calgary Comité de protection des animaux et conforme à la Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.

1. Dam séparée de Offspring

1. Séparer le barrage de sa progéniture pour un minimum de 5 min avant la traite ^12.
   NOTE: Le barrage peut traire jusqu'à 5-6 h après la séparation ^1,6,13, mais les périodes de séparation de plus de 4 heures peuvent modifier la composition du lait ^14. Alors que le temps de la séparation ne semble pas influer sur le volume de collecte de lait ^12, il est conseillé que le temps de la séparation cohérente être maintenue pendant toute l'étude. La composition du lait peut changer au cours de l'allaitement ^15, donc il faut essayer de garder le jour de la collecte du lait conforme. La production maximale de lait est suggéré de se produire le jour de lactation 14 ^12.
2. En utilisant une chambre de réchauffement, assurer les chiots sont en mesure de maintenir tempéra du corps proprere sans la présence de leur mère pendant la durée de la procédure de traite.
   NOTE: Dans l'étude présentée ci-dessous, la traite a été effectuée au moment du sevrage, lorsque les barrages étaient âgés d'environ 22 semaines et vieux les descendants 21 jours, donc pas de chambre de réchauffement a été utilisé.

2. Mise en place et préparation

1. Recueillir tous les documents nécessaires à la procédure de traite.
   REMARQUE: Tous les matériaux peuvent être trouvés dans le matériel et l'équipement table.
2. Placez un coussin chauffant sur le banc où aura lieu la traite et de couvrir le tampon avec un banc absorbante sous-pad.
3. Mettre en place le système anesthésique. Assurez-vous que le système dispose de l'oxygène et de l'isoflurane avant début suffisante. Attacher le masque anesthésique qui sera utilisé pour l'anesthésie induction initiale de la machine. Placez le masque qui sera utilisé pour l'entretien de l'anesthésie à proximité si différente de celle du masque anesthésique initial.
4. Fixez une aiguille 25 G à une seringue de 1 ml de l'ocytocineinjection en utilisant une technique aseptique.
5. Mettez le coussin chauffant afin que la température du corps de la mère est maintenue au cours de la procédure de traite. REMARQUE: Surveiller la température du coussin chauffant pour assurer le pavé ne devienne pas trop chaud et causer des brûlures. En variante, utiliser une source de chaleur, telle qu'une table d'opération chauffée, qui peut être réglé à une température donnée.

3. Anesthésier le barrage à l'isoflurane

1. Ouvrez le réservoir d'oxygène et tourner le débit à 1 L (1000 cc) par minute. Tournez sur l'écoulement de l'isoflurane et mettre à 5%. ATTENTION: Éviter l'inhalation directe de l'anesthésie et de prévenir l'accumulation de vapeurs anesthésiques.
2. Anesthésier le barrage.
3. Basculer vers le masque de maintenance si nécessaire, en plaçant le décubitus dorsal de barrage sur le pad de banc absorbant. Confirmez anesthésie par le manque de pédale réflexe.
4. Réduire le débit de l'isoflurane à 2-3% pour l'entretien de l'anesthésie. Surveiller en permanence barrage long de la procédure afin d'assurer depression de respiration ne se produit pas. NOTE: Une fois sous anesthésie, les yeux du barrage devraient être protégés en utilisant un lubrifiant oculaire stérile pour éviter que les yeux de sécher ou devenir rayé.

4. L'ocytocine Injection

1. Assurer l'ocytocine (20 unités USP / ml) n'a pas passé sa date d'expiration. Désinfecter le flacon de l'ocytocine avec un alcool stérile essuyez / tampon d'alcool de nettoyage.
2. En utilisant une technique aseptique, élaborer 2 UI (0,1 ml) de l'ocytocine dans la seringue. Utilisez une nouvelle aiguille et la seringue pour chaque barrage qui sera traire.
   NOTE: L'ocytocine doses varient généralement de simples injections de 1 à 5 UI ^1,6,12,16. En variante, une dose de 4 UI / kg de poids corporel ¹² peut être utilisé. Une dose unique de 2 UI peut être répétée une fois si la difficulté traite est rencontré.
3. Injecter l'ocytocine par voie intrapéritonéale. Insérez l'aiguille dans le quadrant inférieur droit de l'abdomen avec le pointage de l'aiguille vers la tête, à un anglede 15-30 °, environ 0,5 cm de profondeur.
4. Tirez sur le piston pour assurer une pression négative avant l'injection. Si du fluide (sang, urine, le contenu intestinal, etc.) est aspiré dans la seringue, retirer l'aiguille et de tenter l'injection avec une nouvelle aiguille et la seringue. Si aucun fluide est aspiré injecter l'ocytocine et jeter l'aiguille et la seringue immédiatement dans un container prévu.
5. Attendez environ 5-15 min pour le ocytocine pour stimuler la descente du lait.

5. Préparation des sites à traire

1. Choisissez les sites / tétines du lait seront recueillis. Le lait peut être collecté de toute tétine ^12.
2. Retirez délicatement la fourrure autour du trayon à traire avec les tondeuses, comme la fourrure peut causer des difficultés dans la collecte de l'échantillon en raison de l'effet de mèche du lait. Soyez doux - la peau autour des trayons est extrêmement sensible et peut être sèche et en tant que telle est sensible aux rayures et aux larmes.
3. La stérilisation de la tétine is pas nécessaire, mais le cas échéant, nettoyer la tétine à l'eau tiède après la fourrure est enlevée. Préparer au moins deux sites que plus d'un site peut être nécessaire pour la collecte du lait.
   NOTE: Si l'analyse du lait comprend profilage microbienne, la zone de la tétine peut exiger la stérilisation avec de l'iode ^5.

6. Lait Collection

1. Pressez doucement la base de la tétine, l'expulsion manuellement le lait pour la collecte.
   NOTE: Si l'analyse du lait comprend profilage microbienne, les premières gouttes de lait doivent être jetés.
2. Recueillir les gouttelettes de lait dans un tube capillaire, le remplissage du tube capillaire. Les tubes capillaires qui peuvent accueillir de plus grands volumes (par exemple, 50 pi) de faciliter le processus.
   NOTE: Si la difficulté à recueillir le lait est rencontré, une deuxième dose d'ocytocine peut être administré. Il est recommandé de la dose dépasse pas 4 UI totale.
3. Verser le lait à partir du tube capillaire dans un tube de microcentrifugation stérile partoucher le bout du tube qui a été utilisé pour tirer du lait du trayon vers le côté du tube de microcentrifugeuse - observer le lait étant tiré hors du tube capillaire par action capillaire.
   NOTE: 'Blow out »le lait qui ne soit pas aspiré dans le tube à l'aide d'une aiguille 18 G attachée à une seringue de 1 ml.
4. Surveiller en permanence le barrage des signes de douleur ou de dépression respiratoire et de régler le débit de l'isoflurane en conséquence.
5. Continuer à la collecte du lait comme décrit dans cette section jusqu'à ce que suffisamment de lait ont été recueillis pour l'analyse du lait choisi. Pour la creamatocrit et de protéines détermination de la concentration décrite ci-dessous, de recueillir 0,25 ml de lait.
   REMARQUE: Utilisez un site de traite différente si la descente du lait ralentit ou le site choisi ne pas expulser le lait suffisamment. Un maximum d'environ 2,5 ml de lait par animal peut être recueillie à ^17, ou jusqu'à 0,5 ml par trayon. Les auteurs recommandent que le temps total sous anesthésie être limitée à environ 45-60 min, or 45 min de traite.
6. La collecte du lait dans un tube de microhématocrite pour la mesure de creamatocrit à partir d'échantillons de lait frais, et sceller l'extrémité du tube avec de l'argile étanchéité. Etiqueter le tube de microhématocrite avec l'ID de barrage et stocker l'échantillon de lait debout.
7. Lorsque la traite est terminée, éteignez le flux de l'isoflurane et de l'oxygène. Retirer le masque à partir du barrage et continuer à surveiller barrage jusqu'au réveil. Il est recommandé de ne pas pleinement conscient, le barrage doit être placé sur un coussin de banc absorbant au cours de la période de récupération, plutôt que directement sur la literie de la cage, pour empêcher la litière d'être aspiré ou de griffer les yeux du barrage lors de la récupération.
   REMARQUE: Ne laissez pas le barrage sans surveillance tant qu'il a repris conscience suffisante pour maintenir décubitus sternale.
8. Si aucune autre analyse sont nécessaires, congeler le lait à -80 ° C. D'autres ont suggéré que le lait peut être conservé jusqu'à 3 h à 4 ° C ou 5 mois à -20 ° C ^18.

7. Creamatocrit mesure

1. Estimer la teneur en matières grasses dans le lait en calculant la creamatocrit de lait (de la crème en pourcentage de l'échantillon de lait) ^19.
   REMARQUE: Les mesures avec le lait humain ont démontré que le lait frais ou congelé peut être utilisé pour une mesure de creamatocrit cependant lait frais est plus fortement corrélée (r = 0,92 par rapport r = 0,90) avec la concentration lipidique ^11. L'utilisation de lait frais ou congelés pour les mesures de creamatocrit doit être maintenue uniforme dans l'étude, que le lait décongelé est associée à une faible diminution de creamatocrit ¹¹ valeurs.
2. Pour le lait frais, de recueillir un échantillon de lait du trayon dans un tube de microhématocrite; remplir au moins ¾ pleine (environ 15-20 pi). Alternativement, tirer du lait frais de l'échantillon prélevé dans le tube capillaire après mélangeant bien. Sceller la fin avec de l'argile étanchéité.
3. Placer le tube capillaire dans la centrifugeuse de fibrage de l'hématocrite, de laextrémité fermée orientée vers l'extérieur, en assurant la centrifugeuse est équilibré.
4. Commencez le spin de l'hématocrite (120 secondes à 13 700 xg).
   REMARQUE: Le temps de Spin ou la vitesse peuvent varier selon le modèle de centrifugeuse utilisée.
5. Retirer le tube de la centrifugeuse après l'essorage est terminé et effectuer les mesures pour calculer la creamatocrit. Respecter la séparation de l'échantillon dans une couche de crème et une couche transparente.
6. Mesurer et enregistrer la longueur totale du fluide dans le tube et la longueur de la matière grasse (crème) ou couche à l'aide d'une règle étriers.
   REMARQUE: La creamatocrit est exprimé comme le pourcentage de la couche de crème à l'intérieur de l'échantillon de lait le ^19, comme calculé (longueur de couche de crème / longueur totale de la colonne de lait) x 100 (figure 1A). Calculer la concentration et de l'énergie des valeurs lipidiques provenant de la mesure de creamatocrit comme suit: la concentration de graisse (g / L) = (creamatocrit (%) - 0,59) /0.146 (figure 1B) ^19; Valeur énergétique (kcal / L) = 290 + (66,8 creamatocrit * (%) (Figure 1C) ^19.

8. Protéine Concentration Détermination

1. Utilisation de la sérumalbumine bovine comme étalon de protéines, de déterminer la concentration totale en protéines du lait en utilisant un essai de protéine standard, telle qu'une protéine dosage de Lowry ^6.
   REMARQUE: La dilution du lait peut être nécessaire pour les mesures de protéines du lait à l'intérieur de la courbe tombent norme de l'essai.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Lait a été recueilli comme décrit au sevrage des barrages Wistar (âgés d'environ 22 semaines, pesant 350 à 400 g) qui a consommé un contrôle (AIN-93G, n = 5), riche en protéines (40% de caséine poids / poids, n = 5) , ou de la fibre prébiotique élevé (21,6% en poids / poids, ratio 1: 1 d'oligofructose et l'inuline, n = 4) régime alimentaire pendant la grossesse et l'allaitement. La dose d'ocytocine était de 2 UI. Le lait a été collecté en utilisant des tubes capillaires, et un tube ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Investigations into maternal milk components have increased as interest in early life development research rises. As the sole source of nutrition during the neonatal period, the bioactive compounds in milk are essential for ideal growth and development, especially in the context of intestinal and immune health³. The method presented here is a simple, non-invasive method of collecting milk from the lactating rat in amounts sufficient for downstream analysis, such as oligosaccharide profiling⁶. The me...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment - Milking
1 ml syringes	BD-Canada	309602
25 G needles	BD-Canada	305122
18 G needles	BD-Canada	305196
50 μl Microdispenser Capillary Tubes	Fisher Scientific	21-169D
Oxytocin (20 USP Units/ml)	Bimeda-MTC	1OXY015
PPC Vet Isoflurane Inhalation Anesthetic, 250 ml	Fresenius Kabi	M60302	Used on the order of a veterinarian
Sterile Alcohol Prep Pad	Dukal	853
Absorbent Bench Underpad	VWR	82020-845
Maxi-Therm Hyper/Hypothermia Blanket	Cincinnati Sub-Zero	274
Rodent Anesthesia Machine with Vaporizer	Benson Medical Industries Inc.		Subject to individual laboratory needs
Animal Masks	Benson Medical Industries Inc.	50100/50102
Microcentrifuge Tubes	Axygen	MCT-060-C
ChroMini Professional Trimmer	Wahl
Equipment - Creamatocrit
StatSpin SafeCrit Plastic Microhematocrit Tubes (Untreated)	Fisher Scientific	22-274-914
Critoseal Capillary Tube Sealant Tray	VWR	470161-478
StatSpin CritSpin Microhematocrit Centrifuge	Beckman Coulter, Inc	X00-004999-001