Coleta de Leite no Rato Usando Capilar Tubos e Estimativa da gordura do leite por conteúdo crematócrito

Resumo

Milk is a primary source of nutrition for the neonate. Analysis of milk components may provide insight into maternal factors that affect offspring health. This protocol describes a manual method of collecting milk samples from the lactating rat, which can then be used for further downstream analysis.

Resumo

Milk, as the sole source of nutrition for the newborn mammal, provides the necessary nutrients and energy for offspring growth and development. It also contains a vast number of bioactive compounds that greatly affect the development of the neonate. The analysis of milk components will help elucidate key factors that link maternal metabolism and health with offspring growth and development. The laboratory rat represents a popular model organism for maternal studies, and rat milk can be used to examine the effect of various maternal physiological, nutritional, and pharmacological interventions on milk components, which may then impact offspring health. Here a simple method of manually collecting milk from the lactating rat that can be performed by a single investigator, does not require specialized vacuum or suction equipment, and provides sufficient milk for subsequent downstream analysis is described. A method for estimating the fat content of milk by measuring the percentage of cream within the milk sample, known as the creamatocrit, is also presented. These methods can ultimately be used to increase insight into maternal-child health and to elucidate maternal factors that are involved in proper growth and development of offspring.

Introdução

O leite é a única fonte de nutrição para mamíferos recém-nascidos, fornecendo energia e nutrientes para o crescimento e desenvolvimento infantil ^1,2. Quando o leite é constituído principalmente por células, lípidos e proteína ^1, que também contém uma pletora de compostos bioactivos que modulam o desenvolvimento vida precoce da descendência, incluindo enzimas, hidratos de carbono, hormonas, anticorpos, factores de crescimento, citocinas, exossomas, microvesículas, e pequenos RNAs tais como microARN ^1,2. O papel fundamental do leite materno na criação da prole imunitário e saúde intestinal ^3, juntamente com evidências de que crianças amamentadas são menos suscetíveis à doença ^2, destaca a importância de identificar os constituintes do leite associados a processos de doenças no início da vida e os mecanismos moleculares envolvidos em suas ações. O rato é o desenvolvimento de um modelo popular para investigar o efeito de vários nutricional, fisiológico e intervenções químicas no iníciodesenvolvimento -life ^4. A análise do leite do rato podem, portanto, proporcionar novos insights sobre a saúde materna e prole.

Avanços científicos atuais fornecem agora aumentar as oportunidades para investigações aprofundadas sobre os efeitos de constituintes do leite específicos na saúde e na doença. Por exemplo, a sequenciação de leite perfis bacterianas elucidou o seu papel na colonização intestinal precoce do intestino infantil ^5, análise de espectrometria de massa de oligossacarídeos do leite forneceram uma visão sobre a alteração dos perfis de oligossacarídeos do leite via dieta materna ^{6 e} profunda seqüenciamento de microRNA secretada em os glóbulos de gordura do leite materno destaca possíveis papéis na transcrição do gene, o metabolismo e a função imunológica ^7.

Modelos de ratos representam um dos organismos modelo mais populares usados ​​em estudos materno ^8,9. Uma vantagem é seus períodos de gestação e aleitamento curtas, durando apenas approximatEly 21 dias cada; Por conseguinte, o tempo total a partir do início da gravidez até lactação representa um curto período de tempo em que os dados valiosos podem ser gerados. Quanto maior o tamanho de ratos em comparação com os ratinhos, no contexto de recolha do leite, pode proporcionar uma vantagem significativa no que diz respeito ao volume de leite e facilidade de recolha do leite; produção de leite no rato, por exemplo, parece ser dependente do peso corporal total com os ratos mais pesados ​​que produzem mais leite ^10.

Aqui, uma descrição geral para a coleta manual de leite de ratas lactantes é fornecido. Este protocolo requer um equipamento mínimo, é não-invasiva e de baixo custo, e podem ser usadas para recolher os volumes adequados de leite para análises adicionais a jusante. Em breve, a barragem é anestesiados com isoflurano, a descida do leite é estimulada pela oxitocina, e de leite são recolhidas em tubos capilares por meio de extracção manual do leite. Finalmente, como dois principais componentes de leite são proteínas e gordura, uma breve description de estimar o teor de gordura do leite por meio de medidas crematócrito ^{11 e} quantificação da concentração total de proteínas usando um ensaio de proteína padrão é apresentada.

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Protocolo

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê da Universidade de Calgary Animal Care e conformado com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Dam Separe Offspring

1. Separa-se a barragem de sua prole para um mínimo de 5 min antes da ordenha ^12.
   NOTA: A represa pode ser ordenhadas até 5-6 horas após a separação ^1,6,13, no entanto períodos de separação mais do que 4 horas podem alterar a composição do leite ^14. Enquanto tempo de separação não parece afetar coleção volume de leite ^12, é aconselhável que um tempo de separação consistentes ser mantida durante todo o estudo. A composição do leite pode mudar ao longo da lactação ^15, portanto, devem ser feitas tentativas para manter o dia da coleta de leite consistente. Máxima produção de leite é sugerida para ocorrer no dia 14 de lactação ^12.
2. Usando uma câmara de aquecimento, garantir os filhotes são capazes de manter temperatu do corpo adequadare sem a presença da mãe durante a duração do procedimento de ordenha.
   NOTA: No estudo apresentado a seguir, ordenha foi realizada ao desmame, quando as barragens eram aproximadamente 22 semanas de idade e The Offspring 21 dias de idade, portanto, nenhuma câmara de aquecimento foi utilizado.

2. Set-up e Preparação

1. Colete todos os materiais necessários para o procedimento de ordenha.
   NOTA: Todos os materiais pode ser encontrada na tabela de materiais e equipamento.
2. Coloque uma almofada de aquecimento no banco onde a ordenha terá lugar e cobrir a almofada com um banco absorvente sob-pad.
3. Configure o sistema anestésico. Assegure-se que o sistema tem de oxigénio e isoflurano antes do início suficiente. Fixar o anestésico máscara que irá ser utilizada para a indução da anestesia inicial para a máquina. Coloque a máscara que irá ser utilizado para a manutenção da anestesia nas proximidades se for diferente do que a máscara de anestesia inicial.
4. Coloque uma agulha 25 G para uma seringa de 1 ml para ocitocinainjecção utilizando uma técnica asséptica.
5. Ligue a almofada de aquecimento para que a temperatura do corpo materno é mantida durante o processo de ordenha. NOTA: Monitorar a temperatura da almofada de aquecimento para assegurar a almofada não se torna muito quente e causar queimaduras. Em alternativa, usar uma fonte de calor, tal como uma mesa de operações aquecida, que pode ser ajustado para uma temperatura específica.

3. anestesiar o Dam Usando Isoflurane

1. Abra o tanque de oxigênio e virar o fluxo de 1 L (1000 cc) por min. Ligue o fluxo de isoflurano e ajustado para 5%. CUIDADO: Evite inalação direta de anestésico e evitar a acumulação de vapores anestésicos.
2. Anestesiar a barragem.
3. Mudar para a máscara de manutenção, se necessário, colocando o supino barragem no banco almofada absorvente. Confirme anesthetization por falta de pedal reflexo.
4. Reduzir o fluxo de isoflurano a 2-3% para manutenção da anestesia. Monitorar continuamente barragem durante todo o processo para garantir depressão da respiração não ocorre. NOTA: Uma vez sob anestesia, os olhos da represa devem ser protegidos com um lubrificante de olho estéril para evitar que os olhos sequem ou tornar-se riscado.

4. A oxitocina injeção

1. Garantir a ocitocina (20 USP Unidades / ml) não passou da data de validade. Desinfetar o frasco de ocitocina com um álcool estéril limpar / álcool de limpeza pad.
2. Utilizando uma técnica asséptica, elaborar 2 UI (0,1 ml) de ocitocina para a seringa. Utilize uma nova agulha e seringa para cada barragem que vai ser ordenhadas.
   NOTA: A oxitocina doses variam geralmente de injecções individuais de 1 a 5 IU ^1,6,12,16. Alternativamente, uma dose de 4 UI / kg de peso corporal pode ser utilizado ^12. Uma dose única de 2 Ul pode ser repetida uma vez, se a ordenha for encontrada dificuldade.
3. Injectar a oxitocina por via intraperitoneal. Insira a agulha no quadrante inferior direito do abdômen com a agulha apontando para a cabeça, em um ângulode 15-30 °, cerca de 0,5 cm de profundidade.
4. Puxe o êmbolo para garantir pressão negativa antes da injeção. Se qualquer líquido (sangue, urina, conteúdo intestinal, etc.) é aspirada para a seringa, a agulha e remover tentar a injecção com uma agulha e seringa. Se nenhum fluido é aspirado injetar a oxitocina e descarte a agulha e seringa imediatamente em um recipiente de risco biológico.
5. Aguarde cerca de 5-15 min para a ocitocina para estimular a descida do leite.

5. Preparação de Sites de ordenha

1. Escolha os sites / tetos de leite serão coletadas. O leite pode ser recolhida a partir de qualquer tetina ^12.
2. Remova suavemente a pele ao redor dos tetos de ser ordenhadas com os trimmers, como a pele pode causar dificuldade na coleta de amostra devido à absorção da do leite. Seja gentil - a pele ao redor dos bicos é extremamente sensível e pode ser seca e, como tal, é suscetível a arranhões e lágrimas.
3. Esterilização do i tetinaNão é necessário, mas opcionalmente, limpar a tetina com água morna após a pele é removida. Preparar pelo menos dois locais como mais do que um sítio possa ser necessária para a recolha de leite.
   NOTA: Se a análise do leite inclui perfis de microbiana, a área de tetina pode exigir a esterilização com iodo ^5.

Coleção 6. Leite

1. Espremer suavemente a base da teta, expulsando o leite manualmente para recolha.
   NOTA: Se a análise do leite inclui perfis de microbiana, as primeiras gotas de leite devem ser descartados.
2. Recolher as gotas de leite para um tubo capilar, o enchimento do tubo capilar. Tubos capilares, que podem acomodar volumes maiores (por exemplo, 50 ul) facilitar o processo.
   NOTA: Se houver dificuldade na coleta de leite é encontrado, uma segunda dose de oxitocina pode ser administrado. Recomenda-se a dose não deve exceder 4 IU total.
3. Repartir o leite a partir do tubo capilar para um tubo de microcentrífuga esterilizadotocar a extremidade do tubo que foi utilizado para desenhar a partir do leite da teta para o lado do tubo de microcentrífuga - observar o leite a ser desenhada para fora do tubo capilar por meio de acção capilar.
   NOTA: 'funda para fora "do leite que não é puxado para dentro do tubo, usando uma agulha de 18 G ligada a uma seringa de 1 ml.
4. Monitorar continuamente a barragem para sinais de dor ou depressão respiratória e ajustar o fluxo de isoflurano em conformidade.
5. Continuar a recolher o leite como descrito nesta seção até que o leite suficiente tiver sido coletado para a análise de leite escolhido. Para a determinação da concentração de proteína e crematócrito descrito abaixo, recolher 0,25 ml de leite.
   NOTA: Use um local de ordenha diferente se a descida do leite diminui ou o local escolhido não expulsar leite suficiente. Um máximo de cerca de 2,5 ml de leite por animais pode ser recolhida ^17, ou até 0,5 ml por tetina. Os autores recomendam que o tempo total sob anestesia ser limitado a aproximadamente 45-60 min, oR 45 min de ordenha.
6. Recolha do leite para um tubo de micro-hematócrito para medição crematócrito a partir de amostras de leite fresco, e vedar a extremidade do tubo com vedante argila. Rotular o tubo de microhematócrito com o ID barragem e armazenar a amostra de leite na posição vertical.
7. Quando a ordenha é completa, desligue o fluxo de isoflurano e oxigênio. Retire a máscara da barragem e continuará a acompanhar barragem até acordado. Recomenda-se que se não totalmente consciente, a barragem deve ser colocada sobre uma almofada absorvente banco durante o período de recuperação, ao invés de diretamente na cama gaiola, para evitar que a roupa de cama de ser aspirado ou coçar os olhos da represa durante a recuperação.
   NOTA: Não deixe a barragem autônoma até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter recumbancy esternal.
8. Se não forem necessárias análises adicionais, congelar o leite à temperatura de -80 ° C. Outros têm sugerido que o leite possa ser armazenado durante até 3 horas a 4 ° C ou 5 meses a -20 ° C ^18.

7. Medição crematócrito

1. Estimar o teor de gordura do leite por meio do cálculo do crematócrito leite (a percentagem de creme na amostra de leite) ^19.
   NOTA: As medições com leite humano demonstraram que o leite fresco ou congelado pode ser utilizado para uma medição crematócrito, no entanto leite fresco é mais altamente correlacionados (r = 0,92 versus R = 0,90) com a concentração lipídica ^11. O uso de leite fresco ou congelado para medições crematócrito deve ser mantido consistente em todo o estudo, como o leite descongelado está associado a uma pequena diminuição no crematócrito valores ^11.
2. Para o leite fresco, recolher uma amostra de leite da teta em um tubo de microhematócrito; preencher pelo menos ¾ cheio (cerca de 15-20 mL). Alternativamente, extrair leite fresco a partir da amostra recolhida para dentro do tubo capilar depois de misturar bem. Selar o fim com selante de barro.
3. Colocar o tubo capilar para hematócrito da fieira, com aextremidade vedada apontando para o exterior, garantindo a centrífuga é equilibrada.
4. Comece o spin hematócrito (120 segundos a 13.700 xg).
   NOTA: O tempo da rotação ou velocidade pode mudar, dependendo do modelo de centrífuga utilizada.
5. Remover o tubo da centrifugadora depois da rotação é completo e realizar as medições para calcular o crematócrito. Observar separação da amostra numa camada de creme e uma camada clara.
6. Medir e registar o comprimento total de fluido no tubo e o comprimento da gordura (creme) camada usando compassos de calibre ou uma régua.
   NOTA: O crematócrito é expressa como a percentagem da camada de creme na amostra de leite a ^19, calculada como (comprimento da camada de nata / comprimento total da coluna de leite) x 100 (Figura 1A). Calcular os valores de concentração e de energia a partir da medição de gordura crematócrito como se segue: concentração de gordura (g / L) = (crematócrito (%) - 0,59) /0.146 (Figura 1B) ^19; Valor energético (kcai / L) = 290 + (* crematócrito 66,8 (%) (Figura 1C) ^19.

8. Proteína Concentração Determinação

1. Utilizando albumina de soro bovino como padrão de proteína, determinar a concentração total de proteína do leite, utilizando um ensaio de proteína padrão, tal como ensaio de proteínas de Lowry um ^6.
   NOTA: A diluição do leite pode ser necessária para as medições de proteínas de leite a cair dentro da curva padrão do ensaio.

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Resultados

O leite foi recolhido como descrito no desmame de fêmeas Wistar (cerca de 22 semanas de idade, pesando 350 a 400 g) que consumiram um controlo (AIN-93G, n = 5), elevado teor de proteínas (40% de caseína p / p, n = 5) , ou alta fibra pré-biótica (21,6% p / p, 1: 1 razão de oligofrutose e inulina, n = 4) dieta durante a gravidez e lactação. A dose de oxitocina foi de 2 UI. O leite foi recolhido utilizando tubos capilares, e um tubo foi centrifugado usando um spinner hematócrito para determinar crematócrito

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Discussão

Investigations into maternal milk components have increased as interest in early life development research rises. As the sole source of nutrition during the neonatal period, the bioactive compounds in milk are essential for ideal growth and development, especially in the context of intestinal and immune health³. The method presented here is a simple, non-invasive method of collecting milk from the lactating rat in amounts sufficient for downstream analysis, such as oligosaccharide profiling⁶. The me...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment - Milking
1 ml syringes	BD-Canada	309602
25 G needles	BD-Canada	305122
18 G needles	BD-Canada	305196
50 μl Microdispenser Capillary Tubes	Fisher Scientific	21-169D
Oxytocin (20 USP Units/ml)	Bimeda-MTC	1OXY015
PPC Vet Isoflurane Inhalation Anesthetic, 250 ml	Fresenius Kabi	M60302	Used on the order of a veterinarian
Sterile Alcohol Prep Pad	Dukal	853
Absorbent Bench Underpad	VWR	82020-845
Maxi-Therm Hyper/Hypothermia Blanket	Cincinnati Sub-Zero	274
Rodent Anesthesia Machine with Vaporizer	Benson Medical Industries Inc.		Subject to individual laboratory needs
Animal Masks	Benson Medical Industries Inc.	50100/50102
Microcentrifuge Tubes	Axygen	MCT-060-C
ChroMini Professional Trimmer	Wahl
Equipment - Creamatocrit
StatSpin SafeCrit Plastic Microhematocrit Tubes (Untreated)	Fisher Scientific	22-274-914
Critoseal Capillary Tube Sealant Tray	VWR	470161-478
StatSpin CritSpin Microhematocrit Centrifuge	Beckman Coulter, Inc	X00-004999-001