Kılcal Tüpler ve Creamatocrit Süt Yağ İçeriğinin Tahmin kullanarak Rat Süt Toplama

Özet

Milk is a primary source of nutrition for the neonate. Analysis of milk components may provide insight into maternal factors that affect offspring health. This protocol describes a manual method of collecting milk samples from the lactating rat, which can then be used for further downstream analysis.

Özet

Milk, as the sole source of nutrition for the newborn mammal, provides the necessary nutrients and energy for offspring growth and development. It also contains a vast number of bioactive compounds that greatly affect the development of the neonate. The analysis of milk components will help elucidate key factors that link maternal metabolism and health with offspring growth and development. The laboratory rat represents a popular model organism for maternal studies, and rat milk can be used to examine the effect of various maternal physiological, nutritional, and pharmacological interventions on milk components, which may then impact offspring health. Here a simple method of manually collecting milk from the lactating rat that can be performed by a single investigator, does not require specialized vacuum or suction equipment, and provides sufficient milk for subsequent downstream analysis is described. A method for estimating the fat content of milk by measuring the percentage of cream within the milk sample, known as the creamatocrit, is also presented. These methods can ultimately be used to increase insight into maternal-child health and to elucidate maternal factors that are involved in proper growth and development of offspring.

Giriş

Süt yenidoğan memeliler, bebek büyüme ve gelişme ^1,2 için enerji ve besin sağlamak için beslenme tek kaynağıdır. Süt esas hücrelerde, lipid ve protein ¹ oluşur, aynı zamanda enzimler, karbohidratlar, hormonlar, antikorlar, büyüme faktörleri, sitokinler, eksozom, microvesicles ve küçük RNA'ların bu dahil olmak üzere, yavruların erken yaşam gelişmesini ayarlayabilen biyolojik olarak aktif bileşiklerin bir bolluk içerir microRNA ^1,2 olarak. Bebeklerin hastalığa ² daha az hassas olan anne sütüyle beslenen kanıtlarla ile birleştiğinde bağışıklık yavruları ve bağırsak sağlığı ³ kuruluşunda anne sütünün temel rolü, yaşamın erken döneminde hastalık süreçleri ile ilişkili süt bileşenleri ve ilgili moleküler mekanizmaları tanımlamanın önemini vurgulamaktadır eylemlerinde. Gelişmekte olan sıçan çeşitli beslenme, fizyolojik etkisini araştırmak için popüler bir modeldir ve erken kimyasal müdahaleler-Hayat gelişim ^4. Sıçan süt analizi, bu nedenle anne ve yavru sağlığı içine yeni bilgiler sağlayabilir.

Güncel bilimsel gelişmeler artık sağlık ve hastalık ile ilgili özel süt bileşenlerinin etkileri derinlemesine araştırmalar için olanaklarının artırılması sağlamak. Örneğin, süt bakteriyel profillerin dizi bebek gut ⁵ erken intestinal kolonizasyonunda kendi rolünü açıklamıştır, süt oligosakaritlerinin kütle spektrometresi analizi anne diyet ⁶ ve salgılanan microRNA derin sekanslama yoluyla süt oligosakarit profillerini değiştirilmesi fikir sağladı Anne sütünün yağ globülleri gen transkripsiyonu, metabolizma ve bağışıklık fonksiyonu ^7'de olası rollerini vurgular.

Sıçan modelleri anne çalışmalarda ^8,9 kullanılan en popüler model organizmaların birini temsil etmektedir. Bir avantajı sadece approximat süren kısa gebelik ve doğum dönemleri olduğunuely 21 gün, her; Bu nedenle emzirme gebelik başlangıcından itibaren toplam süresi değerli veriler elde edilebilir hangi kısa bir dönemi temsil eder. Farelere kıyasla farelerin büyük boyutlu, süt toplama bağlamında, süt ve süt toplama kolaylığı hacmine göre belirgin bir avantaj sağlayabilir; fare süt üretimi, örneğin, daha fazla süt üreten ¹⁰ ağır farelerin toplam vücut ağırlığına bağlı gibi görünüyor.

Burada, emziren sıçanların sütüne elle toplanması için genel bir açıklama sağlanır. Bu protokol, düşük ekipman gerektiren ucuz, invazif olmayan ve daha sonraki alt akış analizler için yeterli miktarda süt toplamak için kullanılabilir. Kısaca, baraj süt boşaltma oksitosin tarafından uyarılan, izofluran ile anestezi edilir ve süt süt el ekspresyonu yoluyla kılcal tüpler içine toplanır. Son olarak, süt iki temel bileşenleri olarak proteinler, kısa bir TANIMI şişman vecreamatocrit ölçümleri ¹¹ ve standart bir protein deneyi kullanılarak toplam protein konsantrasyonu ölçümü kullanılarak süt yağı içeriği tahmin n sunulmuştur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu protokol Calgary Hayvan Bakım Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanmış ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu conformed oldu.

Offspring 1. Ayrı Barajı

1. Önce ¹² sağma 5 dakika, en az onun soyundan gelen baraj ayırın.
   NOT: Baraj ancak uzun 4 saat daha ayrılık dönemleri süt bileşimini ¹⁴ değiştirebilir, ayrılık ^1,6,13 sonra 5-6 saat kadar Sağılan edilebilir. Ayırma zaman süt toplama hacmi ¹² darbe görünmüyor olsa da, tutarlı bir ayırma zamanı çalışma boyunca muhafaza edilmesi tavsiye edilir. Laktasyon ¹⁵ boyunca değişebilir Süt bileşimi, bu nedenle girişimleri tutarlı süt toplama gününü tutmak için yapılmalıdır. Maksimum süt üretimi laktasyon günde ¹⁴ 12 oluştuğu ileri sürülmektedir.
2. Bir ısınma odasını kullanarak, yavrular uygun vücut temperatu muhafaza edebiliyoruz sağlamaksağma prosedür süresince annelerinin olmaksızın yeniden.
   NOT: Aşağıda sunulan çalışmada, sağım nedenle hiçbir ısınma odası kullanıldı, barajlar yaklaşık 22 haftalık ve yavru 21 gün eski zaman, sütten gerçekleştirildi.

2. Set-up ve Hazırlık

1. Sağım işlemi için gerekli olan tüm malzemeleri toplayın.
   NOT: Tüm malzemeler malzeme ve ekipman tabloda bulunabilir.
2. Sağım gerçekleşecek ve altı-pad emici tezgah pedi kapsayacak bankta bir ısıtma yastığı yerleştirin.
3. Anestezik sistemini ayarlayın. Sistemi yeterli oksijen ve başlamadan önce izofluran olduğundan emin olun. Makineye ilk anestezi indüksiyonu için kullanılacak anestezi maskesi takın. Yakınlarda ilk anestezik maske farklı ise anestezi bakımı için kullanılacak maske yerleştirin.
4. Oksitosin için 1 ml şırınga 25 G iğne takınaseptik teknik kullanılarak enjeksiyonu.
5. Maternal vücut sıcaklığı sağma işlemi sırasında muhafaza edilir, böylece, ısıtma yastığı açın. NOT: Çok ısınırlar ve yanıklara neden olmaz pedi sağlamak için ısıtma pedi sıcaklığını izleyin. Alternatif olarak, belirli bir sıcaklık için ayarlanabilir bir ısıtılmış cerrahi tablosu olarak, bir ısı kaynağı kullanır.

3. Baraj kullanma izofluran anestezisi

1. Oksijen tankı açın ve min başına 1 L (1000 cc) akışını çevirin. Izofluran akışı açın ve% 5 olarak ayarlanmış. DİKKAT: anestetik doğrudan solumaktan kaçının ve anestezik buharların birikmesini önler.
2. Baraj anestezisi.
3. Gerekirse emici tezgah pad üzerinde baraj sırtüstü yerleştirerek, bakım maskesi üzerinden geçiş. Pedal refleksi eksikliği anesthetization onaylayın.
4. Anestezi idamesi için% 2-3 izofluran akışını azaltın. Sürekli de emin olmak için prosedür boyunca baraj izlemeksolunum pression oluşmaz. NOT: anestezi altında, barajın gözleri kuruma veya çizik olma gözleri önlemek için steril bir göz yağlama kullanılarak korunmalıdır kez.

4. Oksitosin Enjeksiyon

1. Oksitosin emin olun (20 USP Birimleri / ml) son kullanma tarihi geçmedi. / Alkol temizleme pedi silin steril alkol ile oksitosin flakon dezenfekte edin.
2. Aseptik teknik kullanarak, enjektöre oksitosin 2 IU (0.1 ml) hazırlamak. Sağılan olacak her baraj için yeni bir iğne ve şırınga kullanın.
   NOT: Oksitosin dozlar genellikle 1 tek enjeksiyondan 5 IU ^1,6,12,16 değişir. Alternatif olarak, 4 lU / kg vücut ağırlığı kadar bir doz ¹² kullanılabilir. Zorluk sağma karşılaşılırsa 2 IU tek bir dozu günde bir kez tekrar edilebilir.
3. Intraperitoneal oksitosinin enjekte edilir. Bir açıda, baş doğru iğne işaret ile karın sağ alt kadranda içine iğne takın15-30 °, 0.5 cm derinliğindedir.
4. Enjeksiyondan önce negatif basınç sağlamak için pistonu geri çekin. Herhangi bir sıvı (kan, idrar, bağırsak içeriği gibi) enjektöre aspire edilir ise, iğneyi çıkarın ve yeni bir iğne ve şırınga ile enjeksiyon girişimi. Hiçbir sıvı oksitosinin enjekte ve biyolojik tehlikeli kabına hemen iğne ve şırınga atmak aspire edilirse.
5. Süt boşaltma uyarma oksitosin yaklaşık 5-15 dakika bekleyin.

Sağım Siteleri 5. Hazırlık

1. Süt tahsil edilecektir hangi siteleri / emzikleri seçin. Süt herhangi emzik ¹² alınabilir.
2. Kürk numune toplama zorluk neden olabilir hafifçe nedeniyle süt fitilleme için, makasları ile Sağılan edilecek emzikleri etrafında kürk çıkarın. Nazik olun - emzikleri çevresindeki deri çok hassastır ve kuru olabilir ve gibi çizik ve gözyaşları duyarlıdır.
3. Meme i SterilizasyonGerekli değil, ancak kürk çıkarıldıktan sonra, isteğe bağlı olarak, ılık suyla emziği temizleyin. Birden fazla site süt toplama için gerekli olabilir, en az iki site hazırlayın.
   NOT: Süt analizi mikrobiyal profilleme içeriyorsa, emzik alan iyot ⁵ ile sterilizasyon gerekebilir.

6. Süt Toplama

1. Yavaşça elle toplama süt kovma, emzik tabanını sıkmak.
   NOT: Süt analizi mikrobiyal profilleme içeriyorsa, sütün ilk birkaç damla atılmalıdır.
2. Kılcal tüp dolum, bir kılcal tüp içine süt damlacıkları toplayın. Daha büyük hacimli (örneğin, 50 ul) sürecini kolaylaştırmak uyum Kılcal borular.
   Not: süt toplama zorluğu ile karşılaşılırsa, oksitosin ikinci bir doz uygulanabilir. Bu doz 4 IU toplam geçmemesi tavsiye edilir.
3. Steril bir mikrosantrifüj tüp ile içine kılcal tüpten süt koyunmikrosantrifüj tüpü yan meme sütü çekmek için kullanılan tüpün bitiş ucunu da dokunarak - Süt, kılcal hareket aracılığı kılcal tüp üzerinden çekilmesini dikkate alınmalıdır.
   NOT: 1 ml şırınga bağlı 18 G iğne kullanılarak tüp içine çekilir değil süt 'söndür'.
4. Sürekli ağrı veya solunum depresyonu belirtileri için baraj izlemek ve buna göre izofluran akışını ayarlamak.
5. Yeterli süt seçilen süt analizi için toplanan kadar bu bölümde tarif edildiği gibi süt toplamak için devam edin. Creamatocrit ve protein konsantrasyonu belirlenmesi için aşağıda tarif edilen, süt 0,25 ml toplar.
   NOT: Süt hayal kırıklığı yavaşlatır veya seçilen sitesi yeterince süt sınırdışı etmezse, farklı bir sağım sitesini kullanın. Hayvan başına süt, yaklaşık 2,5 ml en fazla ¹⁷ toplanabilir veya meme başına 0.5 ml'ye kadar olabilir. Yazarlar o anestezi altında toplam süresi yaklaşık 45-60 dakika ile sınırlı tavsiyer sağım 45 dk.
6. Taze süt örneklerinden creamatocrit ölçümü için bir mikrohematokrit tüp içine süt toplamak ve kil dolgu ile tüpün ucunu mühür. Baraj kimliği ile mikrohematokrit tüp Etiket ve dik süt örneği saklayın.
7. Sağma tamamlandığında, izofluran ve oksijen akışını kapatın. Baraj maskeyi çıkarın ve uyanık kadar baraj izlemeye devam. Tamamen bilinçli değilse, baraj, yerine doğrudan kafes yatak üzerinde daha iyileşme döneminde bir emici ped tezgah üzerine konulmalıdır aspire veya kurtarma sırasında baraj gözleri kaşıma olmaktan yatak önlemek için tavsiye edilir.
   NOT: sternum recumbancy korumak için yeterli bilinci yerine kadar sahipsiz baraj bırakmayın.
8. Başka analizler gerekiyorsa, -80 ° C süt dondurma. Diğer süt, -20 ° C ¹⁸ 'deki 3 saatin kadar 4 ° C de veya 5 ay boyunca saklanabilir olduğunu ileri sürmüşlerdir.

7. Creamatocrit Ölçümü

1. Süt creamatocrit (süt örneğinde krem yüzdesi) ¹⁹ hesaplayarak sütündeki yağ içeriği tahmin edin.
   NOT: insan sütü ile ölçümler taze veya dondurulmuş ya süt, ancak taze süt daha çok ilişkili olduğu, bir creamatocrit ölçümü için kullanılabilir olduğunu göstermiştir (r r = 0.90 = 0.92 karşı) lipit konsantrasyonuna ^11. Çözülmüş süt creamatocrit küçük bir azalma ile ilişkili olarak creamatocrit ölçümleri için taze veya dondurulmuş süt kullanımı ¹¹ değerleri, çalışma boyunca tutarlı olmalıdır.
2. Taze süt için, bir mikrohematokrit tüp içine emziğin süt örneği toplamak; En azından doldurun ¾ dolu (yaklaşık 15-20 ul). Alternatif olarak, iyi karıştırıldıktan sonra kılcal tüpe toplanan örnekten taze süt çizin. Kil dolgu ile sonuna mühür.
3. Ile, hematokrit spinere kapiller tüp yerleştirinmühürlü uç santrifüj sağlanması dışarıya bakacak dengelidir.
4. Hematokrit dönüşünü (13.700 xg'de 120 sn) başlayın.
   NOT: Sıkma süresi veya hız kullanılan santrifüj modeline bağlı olarak değişebilir.
5. Spin tamamlandıktan sonra santrifüj tüpü çıkarın ve creamatocrit hesaplanması için ölçümler yapmak. Bir krem ​​tabakası ve net bir tabaka haline numunenin ayrımını dikkate alınız.
6. Ölçüm ve akışkanın boru içindeki toplam uzunluğu ve yağ (krem) uzunluğunu çap pergeli ya bir cetvel kullanarak katman kaydedin.
   Not: creamatocrit olarak hesaplanan süt numunesi ¹⁹ olan krem tabakasının yüzdesi olarak ifade edilir (krem tabakanın uzunluk / süt sütununun toplam uzunluğu) 100 (Şekil 1A) x. Şöyle creamatocrit ölçümünden yağ konsantrasyon ve enerji değerlerini hesapla: Yağ konsantrasyonunun (g / L) = (creamatocrit (%) - 0.59) /0.146 (Şekil 1B) ^19; Enerji değeri (kcal / L) = 290 + (66,8 * creamatocrit (%) (Şekil 1C) ^19.

8. Protein Konsantrasyonu Tayini

1. Bir protein standardı olarak sığır serum albümini kullanılarak, örneğin, bir Lowry protein testi ⁶ gibi standart protein deneyi kullanılarak toplam süt protein konsantrasyonunu belirleyin.
   Not: Süt protein ölçümleri deneyde standart eğri içine düşmesi süt seyreltilmesi gerekli olabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Wistar baraj çıkışta tarif edildiği gibi süt toplandı, yüksek protein bir denetim tüketilen (5 AIN-93 g, n =) ki (ağırlığında yaklaşık 22 haftalık 350 ila 400 g) (% 40 kazein ağırlık / ağırlık, n = 5) ya da yüksek prebiyotik lif (% 21.6 wt / wt, 1: oligofruktoz ve inülin, n = 4: 1 oran), gebelik ve emzirme döneminde, diyet. Oksitosin dozu IU 2 oldu. Süt kılcal borular kullanılarak toplandı ve daha sonra bir boru göre yağ konsantrasyonu ve enerji değerini tahmin etmek için kullanıldı c...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Investigations into maternal milk components have increased as interest in early life development research rises. As the sole source of nutrition during the neonatal period, the bioactive compounds in milk are essential for ideal growth and development, especially in the context of intestinal and immune health³. The method presented here is a simple, non-invasive method of collecting milk from the lactating rat in amounts sufficient for downstream analysis, such as oligosaccharide profiling⁶. The me...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment - Milking
1 ml syringes	BD-Canada	309602
25 G needles	BD-Canada	305122
18 G needles	BD-Canada	305196
50 μl Microdispenser Capillary Tubes	Fisher Scientific	21-169D
Oxytocin (20 USP Units/ml)	Bimeda-MTC	1OXY015
PPC Vet Isoflurane Inhalation Anesthetic, 250 ml	Fresenius Kabi	M60302	Used on the order of a veterinarian
Sterile Alcohol Prep Pad	Dukal	853
Absorbent Bench Underpad	VWR	82020-845
Maxi-Therm Hyper/Hypothermia Blanket	Cincinnati Sub-Zero	274
Rodent Anesthesia Machine with Vaporizer	Benson Medical Industries Inc.		Subject to individual laboratory needs
Animal Masks	Benson Medical Industries Inc.	50100/50102
Microcentrifuge Tubes	Axygen	MCT-060-C
ChroMini Professional Trimmer	Wahl
Equipment - Creamatocrit
StatSpin SafeCrit Plastic Microhematocrit Tubes (Untreated)	Fisher Scientific	22-274-914
Critoseal Capillary Tube Sealant Tray	VWR	470161-478
StatSpin CritSpin Microhematocrit Centrifuge	Beckman Coulter, Inc	X00-004999-001