キャピラリーチューブ、Creamatocritによって乳脂肪含量の推定を用いたラットにおける牛乳コレクション

要約

Milk is a primary source of nutrition for the neonate. Analysis of milk components may provide insight into maternal factors that affect offspring health. This protocol describes a manual method of collecting milk samples from the lactating rat, which can then be used for further downstream analysis.

要約

Milk, as the sole source of nutrition for the newborn mammal, provides the necessary nutrients and energy for offspring growth and development. It also contains a vast number of bioactive compounds that greatly affect the development of the neonate. The analysis of milk components will help elucidate key factors that link maternal metabolism and health with offspring growth and development. The laboratory rat represents a popular model organism for maternal studies, and rat milk can be used to examine the effect of various maternal physiological, nutritional, and pharmacological interventions on milk components, which may then impact offspring health. Here a simple method of manually collecting milk from the lactating rat that can be performed by a single investigator, does not require specialized vacuum or suction equipment, and provides sufficient milk for subsequent downstream analysis is described. A method for estimating the fat content of milk by measuring the percentage of cream within the milk sample, known as the creamatocrit, is also presented. These methods can ultimately be used to increase insight into maternal-child health and to elucidate maternal factors that are involved in proper growth and development of offspring.

概要

ミルクは乳児の成長と発展の^1,2のためのエネルギーや栄養素を提供し、新生児の哺乳動物のための唯一の栄養源です。ミルクは、主に、細胞、脂質、およびタンパク質¹で構成されている間、それはまた、酵素、炭水化物、ホルモン、抗体、成長因子、サイトカイン、エキソソーム、マイクロベシクル、及びそのような低分子RNAを含む子孫の若年期の発達を調節する生物活性化合物の多数を含んでいますマイクロRNA ^1,2として。幼児は病気²を受けにくい母乳証拠と相まって免疫子孫と腸の健康³の確立に母乳の基本的な役割は、人生の早い段階で病気のプロセスに関連付けられたミルク成分と関与する分子メカニズムを識別することの重要性を強調して彼らの行動です。開発ラットは早い段階で、栄養様々な生理学的、および化学的介入の効果を調べるための人気モデルであります-Life開発^4。ラットのミルクの分析は、したがって、母体および子孫の健康に新たな洞察を提供してもよいです。

現在の科学の進歩は今健康と病気の特定の乳成分の効果の詳細な調査のための機会を増やしています。例えば、牛乳細菌プロファイルのシークエンスが幼児の腸⁵の初期の腸の植民地化におけるそれらの役割を解明した、ミルクオリゴ糖の質量分析は、母体の食事^6、中に分泌マイクロRNAの深いシーケンシングを介しミルクオリゴ糖プロフィールの変更への洞察を提供してきました母乳の脂肪球は、遺伝子転写、代謝、および免疫機能^7の可能な役割を強調しています。

ラットモデルは、母体の研究^8,9で使用される最も人気のあるモデル生物の1つを表します。一つの利点は、唯一approximat持続が短い妊娠及び授乳期間であり、エリー21日各;したがって、授乳に妊娠の開始からの合計時間は貴重なデータを生成することができる時間の短い期間を示します。マウスと比較してラットの大きなサイズは、ミルクのコレクションとの関連で、ミルクおよびミルクの収集の容易さの体積に対して有意な利点を提供し得ます。マウスでの牛乳の生産は、例えば、より多くのミルク^{10を生成する}重いマウスを用いた全体重に依存するように思われます。

ここでは、授乳中のラットからミルクを手動で収集するための一般的な説明が提供されています。このプロトコルは、最小限の設備を必要とする、非侵襲性で、安価で、さらに下流の分析のためにミルクの適切なボリュームを収集するために使用することができます。簡単に言えば、ダムはミルクレットダウンは、オキシトシンによって刺激され、イソフルランで麻酔され、ミルクはミルクのマニュアル発現によりキャピラリーチューブに回収されます。最後に、ミルクの2つの主要コンポーネントは、簡単なdescriptio脂肪とタンパク質であるとして、creamatocrit測定値¹¹及び標準的なタンパク質アッセイを使用して総タンパク質濃度の定量化を用いて、乳脂肪含有量を推定するnが示されています。

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プロトコル

このプロトコルは、カルガリー大学の動物実験委員会によって承認され、 実験動物の管理と使用に関する指針に準拠しました。

子孫から1.個別のダム

1. ^12を搾乳する前に、5分の最小のための彼女の子孫からダムを区切ります。
   注：ダムは、しかし長い4時間以上の分離の期間は、乳^組成物14 ^{を変更することができる} 、分離^1,6,13後5-6時間までに搾乳することができます。分離時間はミルク収集量^{12に影響を与える}ようには見えないが、それは、一貫した分離時間は、研究を通じて維持されることをお勧めします。授乳¹⁵全体に変更されることがあり乳組成物は、そのための試みは、一貫性のあるミルクのコレクションの一日を維持するためになされるべきです。最大の牛乳生産は、泌乳14日目¹²で発生することが示唆されています。
2. 温暖化室を使用して、子犬が適切な体を維持することができる確実temperatu搾乳手順の間、母親の存在なしに再。
   注：以下に示す研究では、搾乳は、したがって、何の温暖化室は使用されなかった、ダムは約22週齢で子孫21日齢時、離乳で実施しました。

2.セットアップと準備

1. 搾乳手順に必要なすべての材料を収集します。
   注：すべての材料は、材料や機器の表に記載されています。
2. 搾乳が行われ、アンダーパッド吸収性ベンチでパッドをカバーするベンチに加熱パッドを配置します。
3. 麻酔システムを設定します。システムに十分な酸素や開始前イソフルランを持っていることを確認してください。マシンへの最初の麻酔導入のために使用される麻酔マスクを取り付けます。近くの初期麻酔マスクと異なる場合、麻酔の維持のために使用されるマスクを配置します。
4. オキシトシン1 mlシリンジに、25G針を取り付け無菌技術を用いて注入。
5. 母体の体温は搾乳手順の間に維持されるように、加熱パッドをオンにします。注：あまりにも高温になり、やけどを起こさないパッドを確実にするために加熱パッドの温度を監視します。あるいは、特定の温度に設定することができる加熱手術台などの熱源を使用します。

3.イソフルランを使用してダムを麻酔

1. 酸素タンクを開き、毎分1リットル（千CC）への流れを向けます。イソフルランの流れをオンにして、5％に設定されています。注意：麻酔薬の直接吸入を避け、麻酔蒸気の蓄積を防ぎます。
2. ダムを麻酔。
3. 必要に応じて、吸収ベンチパッドの上にダム仰向けに配置し、メンテナンスマスクに切り替え。ペダル反射の欠如によって麻酔を確認してください。
4. 麻酔の維持のために2〜3％のイソフルランの流れを減らします。継続ドを確保するための手順を通じてダムを監視呼吸のPRESSIONは発生しません。注：一度麻酔下で、ダムの目が乾燥や傷​​になってから目を防ぐために、無菌の目の潤滑剤を使用して保護する必要があります。

4.オキシトシン注射液

1. オキシトシンを確認します（20 USP単位/ ml）を、その有効期限を経過していません。 /アルコールクレンジングパッドを拭き、滅菌アルコールでオキシトシンのバイアルを消毒します。
2. 無菌技術を使用して、シリンジ内にオキシトシンの2 IU（0.1 ml）を描きます。搾乳される各ダムのための新しい針と注射器を使用してください。
   注：オキシトシンの投与量は、一般的に1の単回注射から5 IU ^1,6,12,16の範囲。あるいは、4 IU / kg体重の投与量は^、12を使用することができます。難易搾乳が発生した場合2 IUの単回投与は、一回繰り返すことができます。
3. 腹腔内にオキシトシンを注入。角度で、針が頭の方を向いて腹部の右下の象限に針を挿入します15〜30°の、約0.5cmの深さです。
4. 注射前に、負圧を確保するために、プランジャーを後方に引いて。任意の流体（血液、尿、腸の内容物など ）が注射器内に吸引されている場合は、針を削除し、新しい針と注射器で注入を試みます。何の流体が吸引されていない場合はオキシトシンを注入し、すぐにバイオハザード容器に針と注射器を廃棄します。
5. ミルクレットダウンを刺激するオキシトシンのために約5〜15分待ちます。

搾乳サイトの5準備

1. 牛乳が収集されるからサイト/乳首を選択してください。乳は、任意の乳頭^12から回収することができます。
2. 毛皮は、牛乳の吸い上げによるサンプル収集の難しさを引き起こす可能性があるとして慎重に、トリマーで搾乳される乳首の周りに毛皮を削除します。穏やかな - 乳首の周りの皮膚は非常に敏感で、乾燥していてもよく、のような傷や涙の影響を受けやすいです。
3. 乳首iの滅菌必要じゃないが、毛を除去した後、必要に応じて、ぬるま湯で乳首をきれいに。複数のサイトのような少なくとも二つの部位を調製するミルクコレクションのために必要とされてもよいです。
   注：ミルク分析は、微生物プロファイリングが含まれる場合は、乳頭領域は、ヨウ素⁵に滅菌を必要とするかもしれません。

6.ミルクコレクション

1. 静かに手動でコレクションのミルクを排出、乳首の根元を絞ります。
   注：ミルク分析は、微生物プロファイリングが含まれている場合は、ミルクの最初の数滴は廃棄されるべきです。
2. 毛細管を充填し、毛細管内にミルク液滴を集めます。大容量（例えば、50μl）を収容するキャピラリーチューブは、プロセスを容易にします。
   注：ミルクを収集することが困難に遭遇した場合には、オキシトシンの第二の用量を投与することができます。これは、投与量は4 IUの合計を超えないことをお勧めします。
3. により滅菌マイクロチューブに毛細管からミルクを分配します毛管作用を介して毛細管から引き出されているミルクを観察する - マイクロ遠心チューブの側面に乳首からミルクを引き出すために使用された管の端部に触れます。
   注：1 mlシリンジに取り付けた18 G針を使用してチューブに引き込まれていないミルクを「吹き飛ばし」。
4. 継続的に痛みや呼吸抑制の兆候がダムを監視し、それに応じてイソフルランの流れを調整します。
5. このセクションで説明するように、十分なミルクが選ばれたミルク分析のために収集されるまで、ミルクを収集し続けます。 creamatocritとタンパク質濃度の決意は、以下に説明するために、ミルクの0.25ミリリットルを収集します。
   注：ミルクレットダウンが遅くなるか、選択したサイトが十分に牛乳を追放しない場合、別の搾乳サイトを使用してください。動物当たりの乳の約2.5 mlで最大^17、または乳頭あたり0.5 mlまで収集することができます。著者は、O、麻酔下の合計時間は約45〜60分に制限されることをお勧めします搾乳の45分rは。
6. 新鮮な牛乳サンプルからcreamatocrit測定用マイクロヘマトクリット管にミルクを収集し、粘土シーラントでチューブの端部をシールします。ダムIDでミクロヘマトクリットチューブにラベルを付け、直立ミルク試料を保存します。
7. 搾乳が完了すると、イソフルランと酸素の流れをオフにします。ダムからマスクを外し、目を覚ましまでダムの監視を継続します。それは完全に意識されていない場合、ダムが吸引さまたは復元中のダムの目を傷から寝具を防止するために、ケージの寝具ではなく直接よりも、回復期間中に、吸収ベンチパッドの上に置かれるべきであることをお勧めします。
   注：それは胸骨recumbancyを維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人ダムに放置しないでください。
8. 更なる分析が必要とされない場合は、-80℃でミルクを凍結。他の人はミルクが^-20℃18で3時間まで4℃で、または5ヶ月間保存することができることを示唆しています。

7. Creamatocrit測定

1. ミルクcreamatocrit（ミルク試料中のクリームの割合^{）19を計算することにより、}ミルク中の脂肪含量を推定します。
   注：母乳で測定が新鮮または凍結のいずれかミルクがcreamatocrit測定のために使用することができることを実証している、しかし、新鮮な牛乳は、より高度に脂質濃度^11（R = 0.90対R = 0.92）相関しています。解凍したミルクはcreamatocrit ^11値でわずかな減少と関連しているようcreamatocrit測定のための新鮮または凍結したミルクの使用は、研究全体の一貫性が保たれるべきです。
2. 新鮮な牛乳の場合、ミクロヘマトクリット管に乳首からミルクのサンプルを収集します。少なくとも¾フル（約15〜20μl）を記入してください。また、よく混合した後、キャピラリーチューブに採取した試料からの新鮮な牛乳を描きます。粘土シーラントで終了をシール。
3. で、ヘマトクリットスピナーに毛細管を配置密封端遠心機はバランスが取れて確保し、外側に向かって指しています。
4. ヘマトクリットスピン（13,700×gで120秒）を開始します。
   注：スピン時間や速度は使用遠心分離機のモデルに応じて変更されることがあります。
5. スピンが完了した後に遠心分離機からチューブを外し、creamatocritを算出するための測定を行います。クリーム層と透明層内に試料の分離を観察します。
6. 測定し、チューブ内の流体の合計の長さと脂肪（クリーム）の長さノギスや定規を使用したレイヤを記録します。
   注：（クリーム層/ミルク列の全長の長さ）として算出したミルク試料¹⁹内のクリーム層の割合は、100（ 図1A）xとcreamatocritが発現されます。次のようにcreamatocrit測定から脂肪濃度及びエネルギー値を計算する：脂肪濃度（g / L）=（creamatocrit（％） - 0.59）/0.146（ 図^1B）19。エネルギー値（KCアル/ L）+ 290（66.8 * creamatocrit（％）（ 図^{1C）= 19。}

8.タンパク質濃度の決意

1. タンパク質標準としてウシ血清アルブミンを用いて、例えば、ローリー法⁶のような標準的なタンパク質アッセイを用いて、全乳タンパク質の濃度を決定します。
   注：乳タンパク質の測定値がアッセイの標準曲線内に入るようにするためのミルクの希釈が必要であり得ます。

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結果

ミルクは、コントロールを消費しウィスターダム（約22週齢、350〜400グラムを秤量）（AIN-93G、n = 5）を、高タンパク質から離乳時に説明したように収集された（40％カゼイン重量/重量、N = 5）しました、または高いプレバイオティクス繊維（21.6％重量/重量、1：オリゴフルクトース及びイヌリンの1の比率、N = 4）妊娠中や授乳を通してダイエット。オキシトシン投与量は、IU 2でした。ミルク?...

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ディスカッション

Investigations into maternal milk components have increased as interest in early life development research rises. As the sole source of nutrition during the neonatal period, the bioactive compounds in milk are essential for ideal growth and development, especially in the context of intestinal and immune health³. The method presented here is a simple, non-invasive method of collecting milk from the lactating rat in amounts sufficient for downstream analysis, such as oligosaccharide profiling⁶. The me...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment - Milking
1 ml syringes	BD-Canada	309602
25 G needles	BD-Canada	305122
18 G needles	BD-Canada	305196
50 μl Microdispenser Capillary Tubes	Fisher Scientific	21-169D
Oxytocin (20 USP Units/ml)	Bimeda-MTC	1OXY015
PPC Vet Isoflurane Inhalation Anesthetic, 250 ml	Fresenius Kabi	M60302	Used on the order of a veterinarian
Sterile Alcohol Prep Pad	Dukal	853
Absorbent Bench Underpad	VWR	82020-845
Maxi-Therm Hyper/Hypothermia Blanket	Cincinnati Sub-Zero	274
Rodent Anesthesia Machine with Vaporizer	Benson Medical Industries Inc.		Subject to individual laboratory needs
Animal Masks	Benson Medical Industries Inc.	50100/50102
Microcentrifuge Tubes	Axygen	MCT-060-C
ChroMini Professional Trimmer	Wahl
Equipment - Creamatocrit
StatSpin SafeCrit Plastic Microhematocrit Tubes (Untreated)	Fisher Scientific	22-274-914
Critoseal Capillary Tube Sealant Tray	VWR	470161-478
StatSpin CritSpin Microhematocrit Centrifuge	Beckman Coulter, Inc	X00-004999-001