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Resumen

Fosfoinosítidos están señalando los lípidos cuya abundancia relativa cambia rápidamente en respuesta a diversos estímulos. Este artículo describe un método para medir la abundancia de fosfoinosítidos por las células metabólicamente etiquetado con 3 H- myo -inositol, seguido por extracción y desacilación. Glicero-inositides extraídos se separan luego por cromatografía líquida de alta resolución y cuantificados por centelleo de flujo.

Resumen

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Introducción

Phosphoinositides (PtdInsPs) are important signaling phospholipids that help regulate a variety of cellular functions, including signal transduction, membrane trafficking and gene expression, which then modulate higher-order cell behavior such as cell division, organelle identity and metabolic activity1-3. There are seven species of PtdInsPs that are derived from the phosphorylation of the 3, 4, and/or 5 positions of the inositol head group of phosphatidylinositol (PtdIns), the parent phospholipid. Importantly, the seven PtdInsPs are unequally distributed and the local concentration of each PtdInsP species can increase or decrease at specific subcellular sites where they bind to a distinct set of protein effectors, which together permits each PtdInsP to control the identity and function of its host membrane3,4. In addition, the levels of each PtdInsP need to be tightly controlled since this can significantly impact the signal intensityproduced by a PtdInsP. The localization and levels of each PtdInsP depends on the targeting and activity of numerous lipid kinases, phosphatases and phospholipases that mediate the synthesis and turnover of each PtdInsP3,4. Hence, misregulation of the PtdInsP regulatory machinery can perturb cell function, leading to diseases such as cancer and degenerative diseases2,5,6. To fully understand the roles and functions of PtdInsPs and their regulatory machinery, both microscopy-based and biochemical-based techniques have been developed to track and quantify PtdInsPs.

In many cases, PtdInsPs bind to their protein effectors via a specific protein domain7-9. These protein modules often retain their proper fold and lipid recognition properties when expressed separately from the entire protein. This gave rise to PtdInsP probes by fusing a specific PtdInsP-binding protein domain to a fluorescent protein (FP) like green fluorescent protein (GFP) for the subcellular detection of PtdInsPs by microscopy. Indeed, many studies have used FP-fused PtdInsP-binding protein modules to identify the localization and dynamics of specific PtdInsP species by live-cell imaging1,10. For example, the Pleckstrin homology (PH) domain of phospholipase C δ1 (PLCδ1) fused to GFP specifically recognizes the phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate [PtdIns(4,5)P2] on the plasma membrane, whereas tandem copies of the FYVE domain of early endosome antigen 1 (EEA1) has been employed to track phosphatidylinositol-3-phosphate (PtdIns3P) on endosomes10-13. Overall, microscopy-based techniques are great to visualize PtdInsP localization and dynamics, but there are several caveats including that PtdInsP-binding domains may also interact with additional factors other than the target PtdInsP species and that they cannot detect changes below cytosolic fluorescence of the FP-probes.

Biochemical techniques including thin-layer chromatography, mass spectrometry and radioisotope labeling can also be used to characterize and quantify the levels of each PtdInsP14-16. These methods require the isolation of lipids for the detection of cellular levels of PtdInsPs. Mass spectrometry can be used to characterize phospholipids from lipid extracts and is invaluable for determining the acyl chain composition of PtdInsPs14,17. However, mass spectrometry is mostly semi-quantitative and it remains difficult to resolve and concurrently quantify PtdInsP species of the same molecular weight14,17. In comparison, radioisotope labeling of PtdInsPs followed by high performance liquid chromatography (HPLC)-coupled flow scintillation is useful for the separation and concurrent quantification of all seven species of PtdInsPs18. The use of HPLC with a strong anion exchange (SAX) column achieves separation based on molecular weight, charge and shape, thus fractionating deacylated PtdInsPs (Gro-InsPs) even of the same molecular weight and charge. Coupling the HPLC eluent to a flow scintillator then generates radioactive-based signal peaks for each Gro-InsPs species relative to the original parent glycerol-inositol (Gro-Ins)18. This ultimately corresponds to relative levels of PtdInsPs in cells.

Radiolabeling of PtdInsPs and HPLC-coupled flow scintillation is a useful tool to investigate the regulation and function of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate [PtdIns(3,5)P2], a PtdInsP that only constitutes ~0.1-0.3% of PtdIns16,19,20. Synthesis of PtdIns(3,5)P2 is performed by the PtdIns3P 5-kinase called Fab1 in yeast and PIKfyve in mammals21. This reaction is counteracted by a PtdIns(3,5)P2 5-phosphatase called Fig4 in yeast or mFig4/Sac3 in mammals22-24. Interestingly, both PIKfyve/Fab1 and mFig4/Fig4/Sac3 exist in a single complex and are regulated by the scaffolding adaptor protein, Vac14 in yeast or mVac14/ArPIKfyve in mammals25,26. In VAC14-deleted yeast cells, Fab1 does not function efficiently leading to a 90% decrease in PtdIns(3,5)P2 levels27,28. On the other hand, Atg18 is a PtdIns(3,5)P2 effector protein that may control vacuolar fission 29. Atg18 is also a negative regulator of PtdIns(3,5)P2 since the deletion of its gene, ATG18, causes a 10 to 20-fold increase in PtdIns(3,5)P2 levels29,30. Overall, changes in the levels of PtdIns(3,5)P2 severely impacts the function of the yeast vacuole and the mammalian lysosomes, consequently affecting processes such as membrane trafficking, phagosome maturation, autophagy and ion transport 6,19,21,31.

This article describes the process of radioisotope labeling of PtdInsPs with 3H-myo-inositol in yeast to detect the relative levels of PtdIns(3,5)P2 in wild-type, vac14Δ and atg18Δ yeast strains. Using this as an example, the resolving capabilities of HPLC for the separation of individual PtdInsPs as well as the sensitivity of flow scintillation for detection of trace amount of 3H-myo-inositol is shown. We also elaborate on how one might optimize the methodology for labeling and separating 3H-labelled PtdInsPs from mammalian cells, whose samples tend to be more complex since these cells possess all seven PtdInsP species.

Protocolo

Nota: El texto a continuación describe en detalle un método para medir PtdInsPs en la levadura. Proporciona los datos experimentales para las células de etiquetado de levadura con 3 H- myo -inositol, extrayendo y desacilante lípidos y un protocolo de HPLC-elución para fraccionar y cuantificar PtdInsPs desacilados. Tenga en cuenta que el etiquetado, desacilación, resolución y cuantificación de PtdInsPs en células de mamíferos requieren optimización y perfiles HPLC-elución más largos. Estos detalles se pueden encontrar en otros lugares, aunque se discuten algunos de los aspectos de la discusión. En general, la metodología para extraer los lípidos, desacilar y extraer el Gro-InsPs soluble en agua se da a partir de la levadura y se ilustra en la Figura 1.

1. Protocolo para el etiquetado y Análisis de PtdInsPs en levadura

  1. Cultivo de células y radiomarcaje
    1. Crecer un cultivo líquido de 20 ml de la SEY6210 cepa de levadura a 30 ° C con agitación constante en completa sintéticamedios de comunicación para la fase semilogarítmica o una densidad óptica a 600 nm (OD 600) de aproximadamente 0,6-0,7.
      Nota: No utilice medios YPD ya que esto puede afectar a 3 H- myo -inositol incorporación. Este tamaño de la cultura debe proporcionar material suficiente para 2-3 series de HPLC.
    2. Sedimenten un total de 10-14 OD de las células de levadura (tenga en cuenta que 1 ml de cultivo con una DO 600 = 1 contiene ~ 1x10 7 células) mediante centrifugación a 800 xg durante 5 min en un tubo de 12 ml de fondo redondo. Resuspender con 2 ml de-inositol libre de los medios de comunicación (IFM) (véase la Tabla 1 para la composición IFM).
    3. Repetir la centrifugación y aspirar los medios de comunicación. Resuspender el precipitado con 440 l de IFM y se incuba a TA durante 15 min.
    4. Añadir 60 l de 3 H- myo -inositol (1 l = 1 Ci) a cada muestra y se incuba a la creciente temperatura de 30 ° C durante 1 a 3 horas con agitación constante.
      Precaución: 3 myo H- -inositol es un compañero radiactivorial que debe ser manejado después de una formación adecuada. Además, todos los consumibles que hacen contacto con el material que contiene 3-H deben desecharse de manera adecuada y designados como residuos radiactivos.
      Nota: La temperatura de crecimiento se puede cambiar según sea necesario, siempre y cuando todas las cepas que deben compararse se cultivan a la misma temperatura.
    5. Transferir la suspensión celular (500 l) a un tubo de microcentrífuga que contiene 500 l de ácido perclórico 9% y 200 l de ácido lavó perlas de vidrio. Mezclar por inversión y se incuba en hielo durante 5 min.
    6. Vortex la muestra a la velocidad máxima durante 10 min y transferir los lisados ​​a un nuevo tubo de microcentrífuga usando una punta de carga de gel para evitar las perlas de vidrio.
    7. Se precipitan la muestra a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C y aspirar el sobrenadante.
    8. Resuspender el precipitado por sonicación baño en 1 ml de EDTA mM enfriado con hielo 100. Pellet de nuevo como antes.
  2. La desacilación y la extracción
    1. Recién preparar 5,0 ml del reactivo de desacilación mediante la combinación de 2,3 ml de metanol, 1,3 ml de metilamina al 40%, 0,55 ml de 1-butanol y 0,80 ml de agua. Invertir para mezclar.
    2. Aspirar el EDTA y sonicar el precipitado en 50 l de agua.
    3. Añadir 500 l de reactivo de desacilación y sonicar para mezclar. Incubar a TA durante 20 min.
    4. Lípidos de calor durante 50 minutos a 53 ° C en un bloque de calor. Secar las muestras completamente por centrifugación al vacío durante 3 horas o O / N.
      1. Asegúrese de que una trampa química se instala entre el vacío de centrífuga y la bomba de vacío para evitar que los vapores entren en el aire.
    5. Resuspender el precipitado con 300 l de agua por sonicación baño y se incuba a TA durante 20 min. Secar las muestras mediante centrifugación al vacío durante 3 horas o O / N. Repita este paso una vez más.
    6. Sonicar el sedimento con 450 l de agua. Esta es la fase acuosa durante la extracción.
    7. Recién preparar 10 ml de la extraction reactivo mediante la adición de 8,0 ml de 1-butanol, 1,6 ml de éter etílico y 0,40 ml de formiato de etilo. Invertir para mezclar.
    8. Añadir 300 l de reactivo de extracción de la de la fase acuosa. Vortex la mezcla a velocidad máxima durante 5 min y se separan las capas mediante centrifugación a velocidad máxima (18.000 xg) durante 2 min.
    9. Recoger la capa acuosa inferior en un nuevo tubo de microcentrífuga evitando al mismo tiempo la capa superior orgánica, la interfaz, y el sedimento. Repetir la extracción de la fase acuosa dos veces más con reactivo de extracción fresco.
    10. Completamente seca la capa acuosa se recogió por centrifugación al vacío. Dispersar el precipitado en 50 l de agua por sonicación baño.
    11. Añadir 2 l de cada muestra a 4 ml de fluido de centelleo en un vial de centelleo de 6 ml de polietileno. Determinar el número de cuentas (en CPM) en cada muestra mediante centelleo líquido usando una ventana abierta.
    12. Almacenar las muestras a -20 ° C hasta el momento de HPLC.
  3. Separación de3 H-glicero-inositides por HPLC
    1. Preparar el tampón A mediante el filtrado de 1 L de agua ultrapura con una botella 0,22 micras parte superior del filtro de vacío, seguido por desgasificación.
    2. Preparar el tampón B al hacer una solución 1 L de 1 M de fosfato dibásico de amonio (APS, MW 132,06) en agua y ajustar el pH a 3,8 con ácido fosfórico. Filtrar el fosfato de amonio con una botella superior filtro de 0,22 micras de vacío, seguido de desgasificación.
    3. Montar el vial para inyección mediante el equipamiento de un vial de 2 ml con un pequeño volumen 250 l inserto de resorte. Carga de 10 millones de CPM y añadir agua para un volumen total de 55 l. Prepare un frasco blanco con 55 l de agua.
    4. Tapar los viales con tapones de rosca equipados con una septa de PTFE / silicona (lado rojo hacia el interior del vial). Coloque cada vial en la bandeja de auto-muestreo de la HPLC, comenzando con el vial de blanco.
    5. Utilice un HPLC y el software asociado que controla el flujo de amortiguamiento, desgasifica tampones y los controles de la muestra injectien. Utilice un centelleador de flujo en línea y su software asociado para regular el caudal de líquido de centelleo y para monitorizar la señal H-3 decadencia.
      1. Utilice una columna de cromatografía líquida SAX con unas dimensiones de 250 mm x 4,6 mm y que contiene 5 micras de resina de sílice en el HPLC. Equipar la columna con un guardia de la columna para evitar la inyección de contaminantes.
      2. Instalar una celda de flujo de 500 l compatible con H 3 en el centelleo de flujo.
        NOTA: El fraccionamiento se puede hacer con un sistema de HPLC Agilent 1200 series infinito controlado por software Chemstation o con otros sistemas de HPLC disponibles comercialmente. De centelleo de flujo del eluyente de HPLC se puede hacer con un centelleador flujo β-RAM controlado por el software Laura u otro centelleador de flujo disponible comercialmente o software compatible.
    6. Inicialice la bomba cuaternaria con un caudal de 1,0 ml / min con tampón A. 100%
    7. Configurar un perfil de equilibrio en la HPLCpara controlar el gradiente de tampones A y B (llamar a este "Protocolo A equilibración"): 1% de tampón B durante 5 min, 1-100% de B durante 5 min, 100% de B durante 5 min, 100 a 1% de B durante 5 min, 1% de B durante 20 min. Establecer el límite de presión de 400 bar, 1,0 ml / min de caudal y 30 minutos el tiempo de ejecución.
    8. Configurar un perfil de elución (Figura 2) en el HPLC para controlar el gradiente de tampones A y B (llamar a este "Protocolo A"): 1% de B durante 5 min, 1.20% de B durante 40 min, 20 a 100% B durante 10 min, 100% de B durante 5 min, 100-1% de B durante 20 min, 1% de B durante 10 min. Establecer el límite de presión de 400 bar, 1,0 ml / min de caudal y 90 minutos el tiempo de ejecución.
    9. Establecer un protocolo de detección en el centelleo de flujo (llamar a este "Protocolo A de detección") para una duración de 60 minutos, con un caudal de fluido de centelleo de 2,5 ml / min y un tiempo de permanencia 8,57 seg.
    10. Programar una secuencia de inyección automatizada en el HPLC para comenzar con el blanco de agua en "Protocolo A equilibrado", seguido de correoada radiactivamente muestra sobre "Protocolo A". Inicialice la secuencia cuando esté listo.
    11. Mientras que la marcha todavía está en el protocolo de equilibrado, crear un proceso por lotes en el centelleador flujo para medir todas las muestras con "Protocolo de una detección." La inyección de cada nueva muestra inicializará "Protocolo A" en el HPLC, mientras que la activación de la centelleador flujo para comenzar "Protocolo A detección."
    12. A la finalización de todas las carreras, lave la HPLC, la columna y centelleador fluir con 100% de tampón A durante 30 min a 1,0 ml / min de caudal.
  4. Análisis de los datos
    1. Utilice software de Laura o cualquier otro software que pueda cuantificar los espectros de cromatografía. Los pasos descritos en esta sección se muestran en la Figura 3.
    2. Abrir los archivos haciendo clic en "Archivo", "Abrir" y seleccione el archivo de datos brutos para cada muestra.
    3. En la pestaña "cromatogramas", una zoom en estirar cada uno de los picos menores (unos 1.000 recuentos [eje y]) mientras que conserva la resolución de tiempo. Zoom en cada pico individual si es necesario.
    4. Resalte cada uno de los picos para el análisis con la función "Añadir ROI". Identificar picos por el tiempo de elución: Parental Gro-ins a los 10 minutos, Gro-Ins3P a los 18 min, Gro-Ins4P a 20 min, Gro-Ins (3,5) P 2 en 29 min y Gro-Ins (4,5 ) P 2 a los 32 min.
    5. En la pestaña de "mesas de las regiones", grabar el "área (cuenta)" de cada pico. Tenga en cuenta el "start (mm: ss)" el ​​tiempo y "fin (mm: ss)" tiempo de cada pico.
    6. Para la sustracción del fondo, resalte una región adyacente al pico que abarca la misma cantidad de tiempo. Restar el número de cuentas desde el pico correspondiente.
    7. Normalizar el área de cada pico contra parental Gro-Ins (expresado como "% de PtdIns totales"). Entonces, normalizar cada uno de los picos en cada condición experimental contra la condición de control (expresado como "naumento -fold comparación con el control ").
      NOTA: La normalización de cada pico también se puede hacer contra los recuentos totales pero ya que el parental Gro-Ins es mucho más abundante que todos los demás PtdInsPs los resultados tienden a ser similares.
    8. Exportar los datos de los cromatógrafos pulsando en "Archivo", "Guardar como ..." y elija el "CSV (separados por comas)" formato de archivo. Trazar los datos en una hoja de cálculo y presentar, según sea necesario.

Resultados

Usando este método, PtdInsPs de levadura se marcaron metabólicamente con 3 H- myo -inositol. Después del marcaje, los fosfolípidos se precipitaron con ácido perclórico, seguido por desacilación fosfolípido y extracción de la Gro-InsPs soluble en agua (Figura 1). En esta etapa, es importante para cuantificar la señal radiactiva total asociado con el extraída Gro-InsPs por centelleo líquido para asegurar suficiente relación señal-ruido par...

Discusión

En este artículo se detalla el protocolo experimental necesaria para cuantificar los niveles celulares de PtdnsPs por HPLC acoplado centelleo de flujo de la levadura. La metodología permite el etiquetado metabólico de PtdInsPs con 3 H- myo -inositol, seguido por el procesamiento de lípidos y la extracción de 3 H-Gro-InsPs, fraccionamiento HPLC soluble en agua y análisis. Usando este método, los niveles relativos de PtdInsPs en las células en diversas condiciones pueden ser cuantifi...

Divulgaciones

The authors declare that they have no competing financial interests.

Agradecimientos

C.Y.H. was supported by an Ontario Graduate Scholarship from the Government of Ontario. This article was made possible by funding held by R.J.B. from the Natural Sciences and Engineering Research Council, the Canada Research Chairs Program and Ryerson University.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1-ButanolBiobasicBC1800Reagent grade
Ammonium phosphate dibasicBioshopAPD001ACS grade
Ammonium sulfateBiobasicADB0060Ultra Pure grade
AutosamplerAgilentG1329BAgilent 1260 infinity series
BiotinSigmaB4501
Boric acidBiobasicBB0044Molecular biology grade
Calcium ChlorideBiobasicCT1330Ahydrous, industrial grade
Calcium pantothenateSigmaC8731
Copper(II) sulfateSigma451657Anhydrous
D-GlucoseBiobasicGB0219Anhydrous, biotech grade
Dulbecco's modification of Eagle's MediumLife11995-065With 4.5 g/L glucose, 110 mg/L pyruate, L-glutamine
Dulbecco's modification of Eagle's MediumMP biomedicals0916429 With 4.5 g/L glucose, without L-gluatmine, without inositol
EDTABiobasicEB0107Acid free, ultra pure grade
Ethyl etherCaledon labs1/10/4700Anhydrous, reagent grade
Ethyl formateSigma112682Reagent grade
Fetal bovine serumWisent080-450US origin, premium quality, heat inactivated
Fetal Bovine Serum, DialyzedLife26400044US origin
FlowLogic ULabLogic Systems LtdSG-BXX-05Scintillation fluid for flow scintillation 
Folic acidBiobasicFB0466USP grade
HEPES buffer solutionLife156300801 M solution
Inositol, Myo-[2-3H(N)]Perkin ElmerNET114005MC9:1 ethanol to water
Insulin-Transferrin-Selenium-EthanolamineLife51500056100x solution
Iron(III) chlorideSigma157740Reagent grade
Laura - Chromatography data collection and analysis softwareLabLogic Systems LtdVersion 4.2.1.18Flow scintillator software
L-glutamineSigmaG7513200 mM, solution, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture
Magnesium ChlorideSigmaM8266Anhydrous
Manganese sulfateBiobasicMB0334Monohydrate, ACS grade
MethanolCaledon labs6701-7-40HPLC Grade
Methylamine solutionSigma42646640% (v/v)
Monopotassium phosphateBiobasicPB0445Anhydrous, ACS grade
Nicotinic acidBiobasicNB0660Reagent grade
OpenLAB CSD ChemStation AgilentRev. C.01.03 HPLC software
p-aminobenzoic acid (PABA)BioshopPAB001.100Free acid
Penicillin-StreptomycinSigmaP4333100X, liquid, stabilized, sterile-filtered, cell culture tested
Perchloric acidSigma244252ACS reagent, 70%
PhenoSpher SAX columnPhenomenex00G-315-E05 µm, 80 Å, 250 x 4.6 mm
Phosphoric acidCaledon labs1/29/8425Reagent grade
Potassium ChlorideBiobasicPB0440ACS grade
Potassium iodideBiobasicPB0443ACS grade
Pyridoxine hydrochlorideSigmaP9755
Quaternary pumpAgilentG1311CAgilent 1260 infinity series
RiboflavinBioshopRIB333.100USP grade
Sodium ChlorideBiobasicDB0483Biotech grade
Sodium molybdateSigma243655
Thermostatted Column CompartmentAgilentG1316AAgilent 1260 infinity series
Thiamine hydrochlorideSigmaT4625Reagent grade; make solution of 0.02% (w/v), forms a suspension. mix and freeze aliquots
Ultima GoldPerkin Elmer6013321Scintillation coctail for liquid scintillation counting
Zinc sulfateBiobasicZB2906Heptahydrate, reagent grade
β-RAM 4IN/US systemsModel 4Flow scintillator - 500 µl flow cell; alternative Radiomatic Flow Scintillator Analyser by Perkin Elmer 

Referencias

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