JoVE Logo
Autori
Contattaci

Accedi

È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Fosfoinositidi stanno segnalando lipidi la cui abbondanza relativa cambia rapidamente in risposta a vari stimoli. Questo articolo descrive un metodo per misurare l'abbondanza di fosfoinositidi dalle cellule metabolicamente marcatura con 3 H- myo-inositolo, seguita da estrazione e deacilazione. Estratti glycero-inositides sono quindi separati mediante cromatografia liquida ad alta prestazione e quantificati dal flusso scintillazione.

Abstract

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Introduzione

Phosphoinositides (PtdInsPs) are important signaling phospholipids that help regulate a variety of cellular functions, including signal transduction, membrane trafficking and gene expression, which then modulate higher-order cell behavior such as cell division, organelle identity and metabolic activity1-3. There are seven species of PtdInsPs that are derived from the phosphorylation of the 3, 4, and/or 5 positions of the inositol head group of phosphatidylinositol (PtdIns), the parent phospholipid. Importantly, the seven PtdInsPs are unequally distributed and the local concentration of each PtdInsP species can increase or decrease at specific subcellular sites where they bind to a distinct set of protein effectors, which together permits each PtdInsP to control the identity and function of its host membrane3,4. In addition, the levels of each PtdInsP need to be tightly controlled since this can significantly impact the signal intensityproduced by a PtdInsP. The localization and levels of each PtdInsP depends on the targeting and activity of numerous lipid kinases, phosphatases and phospholipases that mediate the synthesis and turnover of each PtdInsP3,4. Hence, misregulation of the PtdInsP regulatory machinery can perturb cell function, leading to diseases such as cancer and degenerative diseases2,5,6. To fully understand the roles and functions of PtdInsPs and their regulatory machinery, both microscopy-based and biochemical-based techniques have been developed to track and quantify PtdInsPs.

In many cases, PtdInsPs bind to their protein effectors via a specific protein domain7-9. These protein modules often retain their proper fold and lipid recognition properties when expressed separately from the entire protein. This gave rise to PtdInsP probes by fusing a specific PtdInsP-binding protein domain to a fluorescent protein (FP) like green fluorescent protein (GFP) for the subcellular detection of PtdInsPs by microscopy. Indeed, many studies have used FP-fused PtdInsP-binding protein modules to identify the localization and dynamics of specific PtdInsP species by live-cell imaging1,10. For example, the Pleckstrin homology (PH) domain of phospholipase C δ1 (PLCδ1) fused to GFP specifically recognizes the phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate [PtdIns(4,5)P2] on the plasma membrane, whereas tandem copies of the FYVE domain of early endosome antigen 1 (EEA1) has been employed to track phosphatidylinositol-3-phosphate (PtdIns3P) on endosomes10-13. Overall, microscopy-based techniques are great to visualize PtdInsP localization and dynamics, but there are several caveats including that PtdInsP-binding domains may also interact with additional factors other than the target PtdInsP species and that they cannot detect changes below cytosolic fluorescence of the FP-probes.

Biochemical techniques including thin-layer chromatography, mass spectrometry and radioisotope labeling can also be used to characterize and quantify the levels of each PtdInsP14-16. These methods require the isolation of lipids for the detection of cellular levels of PtdInsPs. Mass spectrometry can be used to characterize phospholipids from lipid extracts and is invaluable for determining the acyl chain composition of PtdInsPs14,17. However, mass spectrometry is mostly semi-quantitative and it remains difficult to resolve and concurrently quantify PtdInsP species of the same molecular weight14,17. In comparison, radioisotope labeling of PtdInsPs followed by high performance liquid chromatography (HPLC)-coupled flow scintillation is useful for the separation and concurrent quantification of all seven species of PtdInsPs18. The use of HPLC with a strong anion exchange (SAX) column achieves separation based on molecular weight, charge and shape, thus fractionating deacylated PtdInsPs (Gro-InsPs) even of the same molecular weight and charge. Coupling the HPLC eluent to a flow scintillator then generates radioactive-based signal peaks for each Gro-InsPs species relative to the original parent glycerol-inositol (Gro-Ins)18. This ultimately corresponds to relative levels of PtdInsPs in cells.

Radiolabeling of PtdInsPs and HPLC-coupled flow scintillation is a useful tool to investigate the regulation and function of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate [PtdIns(3,5)P2], a PtdInsP that only constitutes ~0.1-0.3% of PtdIns16,19,20. Synthesis of PtdIns(3,5)P2 is performed by the PtdIns3P 5-kinase called Fab1 in yeast and PIKfyve in mammals21. This reaction is counteracted by a PtdIns(3,5)P2 5-phosphatase called Fig4 in yeast or mFig4/Sac3 in mammals22-24. Interestingly, both PIKfyve/Fab1 and mFig4/Fig4/Sac3 exist in a single complex and are regulated by the scaffolding adaptor protein, Vac14 in yeast or mVac14/ArPIKfyve in mammals25,26. In VAC14-deleted yeast cells, Fab1 does not function efficiently leading to a 90% decrease in PtdIns(3,5)P2 levels27,28. On the other hand, Atg18 is a PtdIns(3,5)P2 effector protein that may control vacuolar fission 29. Atg18 is also a negative regulator of PtdIns(3,5)P2 since the deletion of its gene, ATG18, causes a 10 to 20-fold increase in PtdIns(3,5)P2 levels29,30. Overall, changes in the levels of PtdIns(3,5)P2 severely impacts the function of the yeast vacuole and the mammalian lysosomes, consequently affecting processes such as membrane trafficking, phagosome maturation, autophagy and ion transport 6,19,21,31.

This article describes the process of radioisotope labeling of PtdInsPs with 3H-myo-inositol in yeast to detect the relative levels of PtdIns(3,5)P2 in wild-type, vac14Δ and atg18Δ yeast strains. Using this as an example, the resolving capabilities of HPLC for the separation of individual PtdInsPs as well as the sensitivity of flow scintillation for detection of trace amount of 3H-myo-inositol is shown. We also elaborate on how one might optimize the methodology for labeling and separating 3H-labelled PtdInsPs from mammalian cells, whose samples tend to be more complex since these cells possess all seven PtdInsP species.

Protocollo

Nota: Il testo seguente descrive in dettaglio un metodo per misurare PtdInsPs in lievito. Esso fornisce i dettagli sperimentali per l'etichettatura cellule di lievito con 3 H- myo inositolo, estrazione e deacilante lipidi e un protocollo HPLC-eluizione di frazionare e quantificare PtdInsPs deacilati. Si prega di notare che l'etichettatura, deacilazione, la risoluzione e la quantificazione di PtdInsPs in cellule di mammifero richiedono ottimizzazione e più profili HPLC-eluizione. Questi dettagli possono essere trovati altrove, anche se si discute alcuni aspetti nella discussione. In generale, il metodo per estrarre lipidi, deacylate ed estrarre il idrosolubile Gro-InsPs dal lievito è dato ed è illustrato in figura 1.

1. Il protocollo per l'etichettatura e Analizzare PtdInsPs in lievito

  1. Colture cellulari e radiomarcatura
    1. Crescere un 20 ml coltura liquida del SEY6210 ceppo di lievito a 30 ° C con costante agitazione in completo sinteticomezzi di fase metà log o densità ottica a 600 nm (OD 600) di circa 0,6-0,7.
      Nota: Non utilizzare supporti YPD come questo può influenzare 3 H- myo-inositolo incorporazione. Questa dimensione culturale dovrebbe fornire materiale sufficiente per 2-3 corse HPLC.
    2. Pellet un totale di 10-14 OD delle cellule di lievito (notare che 1 ml di coltura con un OD 600 = 1 contiene ~ 1x10 7 cellule) mediante centrifugazione a 800 xg per 5 min in 12 ml a fondo rotondo tubo. Risospendere con 2 ml di media liberi-inositolo (IFM) (vedi Tabella 1 per la composizione IFM).
    3. Ripetere la centrifugazione e aspirare i media. Risospendere il pellet con 440 microlitri di IFM e incubare a temperatura ambiente per 15 min.
    4. Aggiungere 60 ml di 3 H- myo-inositolo (1 ml = 1 pCi) per ogni campione e incubare alla crescente temperatura di 30 ° C per 1 a 3 ore con agitazione costante.
      Attenzione: 3 H- myo-inositolo è un compagno radioattivoriale che deve essere maneggiato dopo una formazione adeguata. Inoltre, tutti i materiali di consumo che fanno contatto con il materiale 3-H contenente devono essere smaltiti in modo appropriato e designati come rifiuti radioattivi.
      Nota: La temperatura di crescita può essere modificata secondo necessità finché tutti i ceppi da confrontare sono cresciuti alla stessa temperatura.
    5. Trasferire la sospensione cellulare (500 microlitri) in una provetta contenente 500 ml di 9% di acido perclorico e 200 ml di acido lavato perline di vetro. Mescolare per capovolgimento e incubare in ghiaccio per 5 min.
    6. Agitare il campione alla massima velocità per 10 minuti e trasferire i lisati di una nuova provetta con una punta gel loading evitare le perline di vetro.
    7. Agglomerare il campione a 12.000 xg per 10 min a 4 ° C e aspirare il surnatante.
    8. Risospendere il pellet da bagno sonicazione in 1 ml di EDTA mM ghiacciato 100. Pellet di nuovo come prima.
  2. Deacilazione ed estrazione
    1. Appena preparare 5,0 ml di reagente deacilazione combinando 2,3 ml di metanolo, 1,3 ml di 40% metilammina, 0,55 ml di 1-butanolo e 0,80 ml di acqua. Miscelarlo.
    2. Aspirare il EDTA e sonicare il pellet in 50 ml di acqua.
    3. Aggiungere 500 ml di reagente deacilazione e sonicare per mescolare. Incubare a temperatura ambiente per 20 min.
    4. Lipidi calore per 50 min a 53 ° C in un blocco di calore. Asciugare i campioni mediante centrifugazione completamente vuoto su 3 ore o O / N.
      1. Assicurarsi che una trappola chimica viene installato tra il vuoto-centrifuga e la pompa del vuoto per evitare il rilascio di vapori nell'aria.
    5. Risospendere il pellet con 300 ml di acqua da bagno sonicazione e incubare a temperatura ambiente per 20 min. Asciugare i campioni per centrifugazione vuoto per 3 ore o O / N. Ripetere questo passaggio ancora una volta.
    6. Sonicare il pellet con 450 ml di acqua. Questa è la fase acquosa durante l'estrazione.
    7. Appena preparare 10 ml di extraction reagente aggiungendo 8,0 ml di 1-butanolo, 1,6 ml di etere etilico e 0,40 ml di etile formiato. Miscelarlo.
    8. Aggiungere 300 ml di reagente di estrazione alla fase acquosa. Vortex la miscela alla massima velocità per 5 minuti e separare gli strati per centrifugazione a velocità massima (18.000 xg) per 2 min.
    9. Raccogliere la fase acquosa inferiore in un nuovo tubo per microcentrifuga evitando lo strato superiore organico, l'interfaccia, ed il pellet. Ripetere l'estrazione della fase acquosa due volte con il reagente di estrazione fresca.
    10. Completamente asciugare lo strato acquoso raccolte mediante centrifugazione sotto vuoto. Disperdere il pellet in 50 ml di acqua per il bagno ultrasuoni.
    11. Aggiungere 2 ml di ogni campione 4 ml di liquido di scintillazione in 6 ml di polietilene scintillazione flaconcino. Determinare il numero di conteggi (in CPM) in ogni campione da scintillazione liquida utilizzando una finestra aperta.
    12. Conservare i campioni a -20 ° C fino al momento HPLC.
  3. Separazione3 H-glycero-inositides mediante HPLC
    1. Preparare tampone A filtrando 1 L di acqua ultrapura con una bottiglia superiore del filtro 0,22 micron di vuoto, seguita da degassaggio.
    2. Preparare tampone B facendo una soluzione di 1 L di 1 M di ammonio fosfato bibasico (APS, MW 132.06) in acqua e regolare il pH a 3,8 con acido fosforico. Filtrare il fosfato di ammonio con una bottiglia superiore del filtro 0,22 micron di vuoto, seguita da degassaggio.
    3. Montare il flaconcino da allestimento un flaconcino da 2 ml con una 250 microlitri inserto piccolo volume a molla. Caricare 10 milioni CPM e aggiungere acqua per un volume totale di 55 microlitri. Preparare una fiala vuota con 55 ml di acqua.
    4. Tappare le fiale con tappi a vite attrezzati con setti in PTFE / silicone (lato rosso rivolto verso l'interno del flaconcino). Mettete ogni fiala nel vassoio di auto-campionamento della HPLC, iniziando con il flaconcino vuoto.
    5. Utilizzare un HPLC e software associato che controlla il flusso di buffer, degassa tamponi e controlli campione iniezin data. Utilizzare un scintillatore flusso in linea e il suo software associato per regolare la portata scintillante e monitorare il segnale 3 H-decadimento.
      1. Utilizzare una colonna SAX cromatografia liquida con dimensioni di 250 mm x 4.6 mm e contenenti 5 micron resina silice nella HPLC. Allestire la colonna con una guardia colonna per evitare l'iniezione di contaminanti.
      2. Installare una cella di flusso 500 microlitri compatibile-H 3 in scintillatore flusso.
        NOTA: Il frazionamento può essere fatto con un sistema della serie 1200 Agilent sfioro HPLC controllato dal software Chemstation o con altri sistemi HPLC disponibili commercialmente. Scintillazione flusso dell'eluente HPLC può essere fatto con un flusso scintillatore β-RAM controllato dal software Laura o un'altra scintillatore flusso disponibile in commercio o software compatibile.
    6. Inizializzare la pompa quaternaria a una portata di 1,0 ml / min con 100% tampone A.
    7. Impostare un profilo di equilibrio in HPLCper controllare il gradiente di buffer A e B (chiamare questo "Protocollo A equilibrazione"): 1% Tampone B per 5 min, 1-100% B per 5 min, 100% B per 5 min, 100-1% B per 5 min, 1% B per 20 min. Impostare il limite di pressione di 400 bar, 1,0 ml / min, e 30 minuti il ​​tempo di esecuzione.
    8. Impostazione di un profilo di eluizione (figura 2) sulla HPLC per controllare il gradiente di buffer A e B (chiamare questo "Protocollo A"): 1% B per 5 min, 1-20% B per 40 min, 20-100% B per 10 min, 100% B per 5 min, 100-1% B per 20 minuti, 1% B per 10 min. Impostare il limite di pressione di 400 bar, 1,0 ml / min, e 90 minuti il ​​tempo di esecuzione.
    9. Impostare un protocollo di rilevazione sul flusso di scintillatore (chiamare questo "Protocollo A rilevamento") a correre per 60 minuti, con una portata di fluido di scintillazione di 2,5 ml / min e un tempo di sosta 8.57 sec.
    10. Programmare una sequenza di iniezione automatizzato sul HPLC per iniziare con il bianco acqua sul "Protocollo Un equilibrio", seguito da each radiomarcato campione sul "Protocollo A". Inizializzare la sequenza quando è pronto.
    11. Mentre la marcia è sempre sul protocollo equilibrazione, creare un lotto sulla scintillatore flusso per misurare tutti i campioni con "protocollo di rivelazione." L'iniezione di ogni nuovo campione verrà inizializzato "Protocollo A" sul HPLC mentre scattare l'scintillatore flusso per iniziare "Protocollo di rivelazione."
    12. Al completamento di tutte le corse, lavare l'HPLC, la colonna e il flusso scintillatore con 100% tampone A per 30 minuti a 1,0 ml / min di portata.
  4. Analisi dei dati
    1. Utilizzare il software Laura o qualsiasi altro software in grado di quantificare gli spettri cromatografia. I passaggi descritti in questa sezione sono descritte nella Figura 3.
    2. Aprire i file facendo clic su "File", "Apri", e selezionare il file di dati grezzi per ogni campione.
    3. Nella scheda "cromatogrammi", zoom per allungare ciascuno dei picchi minori (circa 1000 conteggi [y]) pur mantenendo la risoluzione temporale. Zoom in ogni singolo picco se necessario.
    4. Evidenziare ciascuno dei picchi per l'analisi tramite funzione "Aggiungi ROI". Identificare i picchi dal tempo di eluizione: Parental Gro-Ins a 10 min, Gro-Ins3P a 18 min, Gro-Ins4P a 20 min, Gro-Ins (3,5) P 2 a 29 min e Gro-Ins (4,5 ) P 2 a 32 min.
    5. Nella scheda "tabelle regioni", registrare la "zona (conta)" di ogni picco. Notare la "start (mm: ss)" il tempo e "finale (mm: ss)" tempo di ogni picco.
    6. Per sottrazione dello sfondo, evidenziare una regione adiacente al picco attraversa la stessa quantità di tempo. Sottrarre il numero di conteggi del picco corrispondente.
    7. Normalizzare l'area di ogni picco contro genitori Gro-Ins (espresso come "% del totale PtdIns"). Poi, normalizzare ciascuno dei picchi in ogni condizione sperimentale contro la condizione di controllo (espresso come "naumento -fold confrontato con il controllo ").
      NOTA: La normalizzazione di ogni picco può essere effettuata anche contro conteggi totali, ma dal momento che la genitori Gro-Ins è molto più abbondante di tutti gli altri PtdInsPs i risultati tendono ad essere simili.
    8. Esportare i dati per la cromatografia premendo il tasto "File", "Salva con nome ..." e scegliere il "CSV (separati da virgola)" formato di file. Tracciare i dati su un foglio di calcolo e presentare come necessario.

Risultati

Utilizzando questo metodo, PtdInsPs lievito sono state metabolicamente etichettati con 3 H- myo-inositolo. Dopo etichettatura, i fosfolipidi sono stati precipitati con acido perclorico, seguita da deacilazione fosfolipidi ed estrazione del Gro-InsPs idrosolubile (Figura 1). In questa fase, è importante quantificare il totale del segnale radioattivo associato al estratta Gro-InsPs scintillazione liquida per garantire una sufficiente rapporto segnale-r...

Discussione

Questo articolo descrive il protocollo sperimentale richiesta per quantificare i livelli cellulari di PtdnsPs mediante HPLC accoppiata flusso scintillazione dal lievito. La metodologia consente di marcatura metabolica di PtdInsPs con 3 H- myo-inositolo, seguite da trattamento di lipidi ed estrazione di solubile in acqua 3 H-Gro-InsPs, HPLC frazionamento e analisi. Utilizzando questo metodo, i relativi livelli di PtdInsPs nelle cellule in varie condizioni sono quantificabili, come dimostra ...

Divulgazioni

The authors declare that they have no competing financial interests.

Riconoscimenti

C.Y.H. was supported by an Ontario Graduate Scholarship from the Government of Ontario. This article was made possible by funding held by R.J.B. from the Natural Sciences and Engineering Research Council, the Canada Research Chairs Program and Ryerson University.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1-ButanolBiobasicBC1800Reagent grade
Ammonium phosphate dibasicBioshopAPD001ACS grade
Ammonium sulfateBiobasicADB0060Ultra Pure grade
AutosamplerAgilentG1329BAgilent 1260 infinity series
BiotinSigmaB4501
Boric acidBiobasicBB0044Molecular biology grade
Calcium ChlorideBiobasicCT1330Ahydrous, industrial grade
Calcium pantothenateSigmaC8731
Copper(II) sulfateSigma451657Anhydrous
D-GlucoseBiobasicGB0219Anhydrous, biotech grade
Dulbecco's modification of Eagle's MediumLife11995-065With 4.5 g/L glucose, 110 mg/L pyruate, L-glutamine
Dulbecco's modification of Eagle's MediumMP biomedicals0916429 With 4.5 g/L glucose, without L-gluatmine, without inositol
EDTABiobasicEB0107Acid free, ultra pure grade
Ethyl etherCaledon labs1/10/4700Anhydrous, reagent grade
Ethyl formateSigma112682Reagent grade
Fetal bovine serumWisent080-450US origin, premium quality, heat inactivated
Fetal Bovine Serum, DialyzedLife26400044US origin
FlowLogic ULabLogic Systems LtdSG-BXX-05Scintillation fluid for flow scintillation 
Folic acidBiobasicFB0466USP grade
HEPES buffer solutionLife156300801 M solution
Inositol, Myo-[2-3H(N)]Perkin ElmerNET114005MC9:1 ethanol to water
Insulin-Transferrin-Selenium-EthanolamineLife51500056100x solution
Iron(III) chlorideSigma157740Reagent grade
Laura - Chromatography data collection and analysis softwareLabLogic Systems LtdVersion 4.2.1.18Flow scintillator software
L-glutamineSigmaG7513200 mM, solution, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture
Magnesium ChlorideSigmaM8266Anhydrous
Manganese sulfateBiobasicMB0334Monohydrate, ACS grade
MethanolCaledon labs6701-7-40HPLC Grade
Methylamine solutionSigma42646640% (v/v)
Monopotassium phosphateBiobasicPB0445Anhydrous, ACS grade
Nicotinic acidBiobasicNB0660Reagent grade
OpenLAB CSD ChemStation AgilentRev. C.01.03 HPLC software
p-aminobenzoic acid (PABA)BioshopPAB001.100Free acid
Penicillin-StreptomycinSigmaP4333100X, liquid, stabilized, sterile-filtered, cell culture tested
Perchloric acidSigma244252ACS reagent, 70%
PhenoSpher SAX columnPhenomenex00G-315-E05 µm, 80 Å, 250 x 4.6 mm
Phosphoric acidCaledon labs1/29/8425Reagent grade
Potassium ChlorideBiobasicPB0440ACS grade
Potassium iodideBiobasicPB0443ACS grade
Pyridoxine hydrochlorideSigmaP9755
Quaternary pumpAgilentG1311CAgilent 1260 infinity series
RiboflavinBioshopRIB333.100USP grade
Sodium ChlorideBiobasicDB0483Biotech grade
Sodium molybdateSigma243655
Thermostatted Column CompartmentAgilentG1316AAgilent 1260 infinity series
Thiamine hydrochlorideSigmaT4625Reagent grade; make solution of 0.02% (w/v), forms a suspension. mix and freeze aliquots
Ultima GoldPerkin Elmer6013321Scintillation coctail for liquid scintillation counting
Zinc sulfateBiobasicZB2906Heptahydrate, reagent grade
β-RAM 4IN/US systemsModel 4Flow scintillator - 500 µl flow cell; alternative Radiomatic Flow Scintillator Analyser by Perkin Elmer 

Riferimenti

  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
  2. Bridges, D., Saltiel, A. R. Phosphoinositides and Disease. Curr. Top. Microbiol. Immuno. 362, 61-85 (2012).
  3. Botelho, R. J. Changing phosphoinositides "on the fly": How trafficking vesicles avoid an identity crisis. BioEssays. 31 (10), 1127-1136 (2009).
  4. Simonsen, A., Wurmser, A. E., Emr, S. D., Stenmark, H. The role of phosphoinositides in membrane transport. Curr. Opin. Cell. Biol. 13 (4), 485-492 (2001).
  5. Katso, R., Okkenhaug, K., Ahmadi, K., Timms, J., Waterfield, M. D. Cellular Function of Phosphoinositide 3-Kinases: Implications for Development, Immunity, Homeostasis, and Cancer. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 615-675 (2001).
  6. Lenk, G. M., Meisler, M. H. Mouse models of PI(3,5)P2 deficiency with impaired lysosome function. Methods. Enzymo. 534, (2014).
  7. Lemmon, M. A. Phosphoinositide recognition domains. Traffic. 4 (4), 201-213 (2003).
  8. Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains-their role in signalling and membrane trafficking. Curr. Biol. 11 (21), R882-R893 (2001).
  9. Balla, T. Inositol-lipid binding motifs: signal integrators through protein-lipid and protein-protein interactions. J. Cell. Sci. 118 (Pt 10), 2093-2104 (2005).
  10. Burd, C. G., Emr, S. D. Phosphatidylinositol(3)-phosphate signaling mediated by specific binding to RING FYVE domains. Mol. Cell. 2 (1), 157-162 (1998).
  11. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92 (23), 10472-10476 (1995).
  12. Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J. Cell. Biol. 169 (1), 139-149 (2005).
  13. Gillooly, D. J., et al. Localization of phosphatidylinositol 3-phosphate in yeast and mammalian cells. EMBO J. 19 (17), 4577-4588 (2000).
  14. Haag, M., Schmidt, A., Sachsenheimer, T., Brügger, B. Quantification of Signaling Lipids by Nano-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry (Nano-ESI MS/MS). Metabolites. 2 (1), 57-76 (2012).
  15. Furutani, M., Itoh, T., Ijuin, T., Tsujita, K., Takenawa, T. Thin layer chromatography-blotting, a novel method for the detection of phosphoinositides. J. Biochem. 139 (4), 663-670 (2006).
  16. Cooke, F. T., et al. The stress-activated phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinase Fab1p is essential for vacuole function in. 8 (22), 1219-1222 (1998).
  17. Milne, S. B., Ivanova, P. T., DeCamp, D., Hsueh, R. C., Brown, H. A. A targeted mass spectrometric analysis of phosphatidylinositol phosphate species. J. Lipid. Res. 46 (8), 1796-1802 (2005).
  18. Rusten, T. E., Stenmark, H. Analyzing phosphoinositides and their interacting proteins. Nat. methods. 3 (4), 251-258 (2006).
  19. Ho, C. Y., Alghamdi, T. A., Botelho, R. J. Phosphatidylinositol-3,5-bisphosphate: no longer the poor PIP2. Traffic. 13 (1), 1-8 (2012).
  20. Samie, M., et al. A TRP channel in the lysosome regulates large particle phagocytosis via focal exocytosis. Dev. Cel. 26 (5), 511-524 (2013).
  21. Shaw, J. D., Hama, H., Sohrabi, F., DeWald, D. B., Wendland, B. PtdIns(3,5)P2 is required for delivery of endocytic cargo into the multivesicular body. Traffic. 4 (7), 479-490 (2003).
  22. Botelho, R. J., Efe, J. A., Emr, S. D. Assembly of a Fab1 phosphoinositide kinase signaling complex requires the Fig4 phosphoinositide phosphatase. Mol. Biol. Cell. 19, 4273-4286 (2008).
  23. Rudge, S. A., Anderson, D. M., Emr, S. D. Vacuole size control: Regulation of PtdIns(3,5)P2 levels by the vacuole-associated Vac14-Fig4 complex, a PtdIns(3,5)P2-specific phosphatase. Mol. Biol. Cell. 15, 24-36 (2004).
  24. Sbrissa, D., et al. Core protein machinery for mammalian phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate synthesis and turnover that regulates the progression of endosomal transport: Novel Sac phosphatase joins the ArPIKfyve-PIKfyve complex. J. Biol. Chem. 282 (33), 23878-23891 (2007).
  25. Alghamdi, T. A., et al. Vac14 protein multimerization is a prerequisite step for Fab1 protein complex assembly and function. J. Biol. Chem. 288 (13), 9363-9372 (2013).
  26. Ikonomov, O. C., Sbrissa, D., Fenner, H., Shisheva, A. PIKfyve-ArPIKfyve-Sac3 core complex: Contact sites and their consequence for Sac3 phosphatase activity and endocytic membrane homeostasis. J. Biol. Chem. 284 (51), 35794-35806 (2009).
  27. Dove, S. K., et al. Vac14 controls PtdIns(3,5)P(2) synthesis and Fab1-dependent protein trafficking to the multivesicular body. Curr. Biol. 12 (11), 885-893 (2002).
  28. Bonangelino, C. J., et al. Osmotic stress-induced increase of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate requires Vac14p, an activator of the lipid kinase Fab1p. J. Cell. Biol. 156 (6), 1015-1028 (2002).
  29. Dove, S. K., et al. Svp1p defines a family of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate effectors. EMBO J. 23 (9), 1922-1933 (2004).
  30. Efe, J. A., Botelho, R. J., Emr, S. D. Atg18 regulates organelle morphology and Fab1 kinase activity independent of its membrane recruitment by phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate. Mol. Biol. Cell. 18 (1), 4232-4244 (2007).
  31. Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p Ptdlns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (6), 847-858 (1998).
  32. Duex, J. E., Nau, J. J., Kauffman, E. J., Weisman, L. S. Phosphoinositide 5-phosphatase Fig4p is required for both acute rise and subsequent fall in stress-induced phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate levels. Eukaryotic Cell. 5 (4), 723-731 (2006).
  33. Whiteford, C. C., Best, C., Kazlauskas, A., Ulug, E. T. D-3 phosphoinositide metabolism in cells treated with platelet-derived growth factor. Biochem J. 319 (3), 851-860 (1996).
  34. Murthy, P. P., et al. Evidence of two isomers of phosphatidylinositol in plant tissue. Plant physiology. 98 (4), 1498-1501 (1992).
  35. Zolov, S. N., et al. In vivo, Pikfyve generates PI(3,5)P2, which serves as both a signaling lipid and the major precursor for PI5P. Proc. 109 (43), 17472-17477 (2012).
  36. McEwen, R. K., et al. Complementation analysis in PtdInsP kinase-deficient yeast mutants demonstrates that Schizosaccharomyces pombe and murine Fab1p homologues are phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinases. J. Biol. Chem. 274 (48), 33905-33912 (1999).
  37. Tolias, K. F., et al. Type I phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinases synthesize the novel lipids phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate and phosphatidylinositol 5- phosphate. J. Biol. Chem. 273 (29), 18040-18046 (1998).
  38. Ikonomov, O. C., et al. The phosphoinositide kinase PIKfyve is vital in early embryonic development: preimplantation lethality of PIKfyve-/- embryos but normality of PIKfyve+/- mice. J. Biol. Chem. 286 (15), 13404-13413 (2011).
  39. Sarkes, D., Rameh, L. E. A Novel HPLC-Based Approach Makes Possible the Spatial Characterization of Cellular PtdIns5P and Other Phosphoinositides. Biochem J. 428 (3), 375-384 (2011).
  40. Sbrissa, D., Ikonomov, O. C., Filios, C., Delvecchio, K., Shisheva, A. Functional dissociation between PIKfyve-synthesized PtdIns5P and PtdIns(3,5)P2 by means of the PIKfyve inhibitor YM201636. Am. J. Physiol. Cel. Physiol. 303 (4), 436-446 (2012).
  41. D'Souza, K., Epand, R. M. Enrichment of phosphatidylinositols with specific acyl chains. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1838 (6), 1501-1508 (2014).
  42. Shulga, Y. V., Anderson, R. A., Topham, M. K., Epand, R. M. Phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase isoforms exhibit acyl chain selectivity for both substrate and lipid activator. J. Biol. Chem. 287 (43), 35953-35963 (2012).
  43. Pettitt, T. R., Dove, S. K., Lubben, A., Calaminus, S. D. J., Wakelam, M. J. O. Analysis of intact phosphoinositides in biological samples. J. Lipid. Res. 47 (7), 1588-1596 (2006).

Ristampe e Autorizzazioni

Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi Autorizzazione

Esplora altri articoli

ChimicaNumero 107fosfoinositidilipiditraffico di membranail flusso di scintillazionela trasduzione del segnaleradiomarcaturacromatografia liquida

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Riservatezza

Condizioni di utilizzo

Politiche

Contattaci

SUGGERISCI JOVE ALLA BIBLIOTECA

Newsletter di JoVE

Ricerca

Didattica

Autori

Personale delle biblioteche

CHI SIAMO

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati