Radiolabeling וכימות של רמות סלולריות של Phosphoinositides ידי נצנץ זרימה מצמיד כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים

Summary

Phosphoinositides מאותת שומנים שיחסית שפע במהירות משתנה בתגובה לגירויים שונים. מאמר זה מתאר שיטה למדידת השפע של phosphoinositides ידי תאים מטבולית תיוג עם -inositol מיו ³ H-, ואחרי חילוץ וdeacylation. glycero-inositides חולץ אז מופרדים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים ולכמת ידי זרימת נצנץ.

Abstract

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with ³H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble ³H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Introduction

Phosphoinositides (PtdInsPs) are important signaling phospholipids that help regulate a variety of cellular functions, including signal transduction, membrane trafficking and gene expression, which then modulate higher-order cell behavior such as cell division, organelle identity and metabolic activity^1-3. There are seven species of PtdInsPs that are derived from the phosphorylation of the 3, 4, and/or 5 positions of the inositol head group of phosphatidylinositol (PtdIns), the parent phospholipid. Importantly, the seven PtdInsPs are unequally distributed and the local concentration of each PtdInsP species can increase or decrease at specific subcellular sites where they bind to a distinct set of protein effectors, which together permits each PtdInsP to control the identity and function of its host membrane^3,4. In addition, the levels of each PtdInsP need to be tightly controlled since this can significantly impact the signal intensityproduced by a PtdInsP. The localization and levels of each PtdInsP depends on the targeting and activity of numerous lipid kinases, phosphatases and phospholipases that mediate the synthesis and turnover of each PtdInsP^3,4. Hence, misregulation of the PtdInsP regulatory machinery can perturb cell function, leading to diseases such as cancer and degenerative diseases^2,5,6. To fully understand the roles and functions of PtdInsPs and their regulatory machinery, both microscopy-based and biochemical-based techniques have been developed to track and quantify PtdInsPs.

In many cases, PtdInsPs bind to their protein effectors via a specific protein domain^7-9. These protein modules often retain their proper fold and lipid recognition properties when expressed separately from the entire protein. This gave rise to PtdInsP probes by fusing a specific PtdInsP-binding protein domain to a fluorescent protein (FP) like green fluorescent protein (GFP) for the subcellular detection of PtdInsPs by microscopy. Indeed, many studies have used FP-fused PtdInsP-binding protein modules to identify the localization and dynamics of specific PtdInsP species by live-cell imaging^1,10. For example, the Pleckstrin homology (PH) domain of phospholipase C δ1 (PLCδ1) fused to GFP specifically recognizes the phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate [PtdIns(4,5)P₂] on the plasma membrane, whereas tandem copies of the FYVE domain of early endosome antigen 1 (EEA1) has been employed to track phosphatidylinositol-3-phosphate (PtdIns3P) on endosomes^10-13. Overall, microscopy-based techniques are great to visualize PtdInsP localization and dynamics, but there are several caveats including that PtdInsP-binding domains may also interact with additional factors other than the target PtdInsP species and that they cannot detect changes below cytosolic fluorescence of the FP-probes.

Biochemical techniques including thin-layer chromatography, mass spectrometry and radioisotope labeling can also be used to characterize and quantify the levels of each PtdInsP^14-16. These methods require the isolation of lipids for the detection of cellular levels of PtdInsPs. Mass spectrometry can be used to characterize phospholipids from lipid extracts and is invaluable for determining the acyl chain composition of PtdInsPs^14,17. However, mass spectrometry is mostly semi-quantitative and it remains difficult to resolve and concurrently quantify PtdInsP species of the same molecular weight^14,17. In comparison, radioisotope labeling of PtdInsPs followed by high performance liquid chromatography (HPLC)-coupled flow scintillation is useful for the separation and concurrent quantification of all seven species of PtdInsPs¹⁸. The use of HPLC with a strong anion exchange (SAX) column achieves separation based on molecular weight, charge and shape, thus fractionating deacylated PtdInsPs (Gro-InsPs) even of the same molecular weight and charge. Coupling the HPLC eluent to a flow scintillator then generates radioactive-based signal peaks for each Gro-InsPs species relative to the original parent glycerol-inositol (Gro-Ins)¹⁸. This ultimately corresponds to relative levels of PtdInsPs in cells.

Radiolabeling of PtdInsPs and HPLC-coupled flow scintillation is a useful tool to investigate the regulation and function of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate [PtdIns(3,5)P₂], a PtdInsP that only constitutes ~0.1-0.3% of PtdIns^16,19,20. Synthesis of PtdIns(3,5)P₂ is performed by the PtdIns3P 5-kinase called Fab1 in yeast and PIKfyve in mammals²¹. This reaction is counteracted by a PtdIns(3,5)P₂ 5-phosphatase called Fig4 in yeast or mFig4/Sac3 in mammals^22-24. Interestingly, both PIKfyve/Fab1 and mFig4/Fig4/Sac3 exist in a single complex and are regulated by the scaffolding adaptor protein, Vac14 in yeast or mVac14/ArPIKfyve in mammals^25,26. In VAC14-deleted yeast cells, Fab1 does not function efficiently leading to a 90% decrease in PtdIns(3,5)P₂ levels^27,28. On the other hand, Atg18 is a PtdIns(3,5)P₂ effector protein that may control vacuolar fission ²⁹. Atg18 is also a negative regulator of PtdIns(3,5)P₂ since the deletion of its gene, ATG18, causes a 10 to 20-fold increase in PtdIns(3,5)P₂ levels^29,30. Overall, changes in the levels of PtdIns(3,5)P₂ severely impacts the function of the yeast vacuole and the mammalian lysosomes, consequently affecting processes such as membrane trafficking, phagosome maturation, autophagy and ion transport ^6,19,21,31.

This article describes the process of radioisotope labeling of PtdInsPs with ³H-myo-inositol in yeast to detect the relative levels of PtdIns(3,5)P₂ in wild-type, vac14Δ and atg18Δ yeast strains. Using this as an example, the resolving capabilities of HPLC for the separation of individual PtdInsPs as well as the sensitivity of flow scintillation for detection of trace amount of ³H-myo-inositol is shown. We also elaborate on how one might optimize the methodology for labeling and separating ³H-labelled PtdInsPs from mammalian cells, whose samples tend to be more complex since these cells possess all seven PtdInsP species.

Protocol

הערה: הטקסט למטה מתאר בפירוט שיטה למדידת PtdInsPs בשמרים. הוא מספק את הפרטים הניסיוניים לתאי תיוג שמרים עם -inositol מיו ³ H-, שומני חילוץ וdeacylating ופרוטוקול HPLC-elution לfractionate ולכמת PtdInsPs deacylated. שים לב שתיוג, deacylation, רזולוציה וכימות של PtdInsPs בתאי יונקים דורש אופטימיזציה ופרופילי HPLC-elution עוד. ניתן למצוא את הפרטים הללו במקום אחר, אם כי אנו דנים בחלק מהיבטים בדיון. בסך הכל, המתודולוגיה לחלץ שומנים, deacylate ולחלץ את מסיסים במים Gro-InsPs משמרים ניתן ומאויר באיור 1.

1. פרוטוקול PtdInsPs תיוג והניתוח בשמרים

1. תרבית תאים וradiolabeling
   1. לגדול תרבות נוזלית 20 מיליליטר של SEY6210 זן שמרים על 30 מעלות צלזיוס עם קבוע רועד בסינטטי מלאהתקשורת לשלב אמצע יומן-או צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD ₆₀₀₎ בסך של כ 0.6-0.7.
      הערה: אל תשתמש בתקשורת YPD זה עלול להשפיע ³ H- התאגדות מיו -inositol. גודל תרבות זה אמור לספק מספיק חומר במשך 2-3 ריצות HPLC.
   2. גלולה כוללת של 10-14 OD של תאי השמרים (שים לב שתרבות 1 מיליליטר עם OD ₆₀₀ = 1 מכילה ~ 1x10 ⁷ תאים) על ידי צנטריפוגה ב 800 XG במשך 5 דקות בצינור 12 מיליליטר מסביב לתחתית. Resuspend עם 2 מיליליטר של תקשורת חופשית אינוסיטול (IFM) (ראה טבלה 1 להרכב IFM).
   3. חזור צנטריפוגה ולשאוב את התקשורת. Resuspend גלולה עם 440 μl של IFM ולדגור על RT במשך 15 דקות.
   4. הוסף 60 μl של ³ H- מיו -inositol (μl 1 = μCi 1) לכל דגימה ודגירה בטמפרטורה הולך וגדל של 30 מעלות צלזיוס במשך 1-3 שעות עם רעד קבוע.
      זהירות: ³ -inositol מיו H- היא בן זוג רדיואקטיבייםריאל שצריך להיות מטופלים לאחר הכשרה מתאימה. בנוסף, כל החומרים המתכלים שליצור קשר עם ³ חומרים המכיל H צריכים להיות מסולקים כראוי ומיועדים כפסולת רדיואקטיבית.
      הערה: טמפרטורת הצמיחה ניתן לשנות בהתאם לצורך, כל עוד כל הזנים שגדלים בהשוואה באותה הטמפרטורה.
   5. מעבירים את ההשעיה התא (500 μl) לצינור microcentrifuge המכיל 500 μl של 9% חומצת perchloric ו -200 μl של חומצה שטף חרוזי זכוכית. מערבבים על ידי היפוך ודגירה על קרח למשך 5 דקות.
   6. מערבולת המדגם במהירות שיא במשך 10 דקות ולהעביר את lysates לצינור microcentrifuge חדש באמצעות קצה ג'ל טעינה כדי למנוע את חרוזי הזכוכית.
   7. גלולה המדגם ב XG 12,000 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולשאוב supernatant.
   8. Resuspend גלולה ידי sonication אמבטיה ב 1 מיליליטר של קר כקרח 100 מ"מ EDTA. גלולה שוב כמו קודם.
2. Deacylation וחילוץ
   1. טרי להכין 5.0 מיליליטר של מגיב deacylation על ידי שילוב של 2.3 מיליליטר של מתנול, 1.3 מיליליטר של methylamine 40%, 0.55 מיליליטר של 1-butanol ו0.80 מיליליטר של מים. הפוך לערבב.
   2. לשאוב EDTA וsonicate גלולה ב -50 μl של מים.
   3. הוסף 500 μl של מגיב deacylation וsonicate לערבב. לדגור על RT במשך 20 דקות.
   4. שומני חום במשך 50 דקות ב 53 מעלות צלזיוס בגוש חום. ייבש את הדגימות לחלוטין על ידי צנטריפוגה ואקום מעל 3 שעות או O / N.
      1. ודא שמלכודת כימית מותקנת בין הוואקום-צנטריפוגה ומשאבת הוואקום כדי למנוע אדים מלהיכנס לאוויר.
   5. Resuspend גלולה עם 300 μl של מים על ידי sonication אמבטיה ולדגור על RT במשך 20 דקות. ייבש את הדגימות על ידי צנטריפוגה ואקום במשך 3 שעות או O / N. חזור על פעולה זו פעם נוספת.
   6. Sonicate גלולה עם 450 μl של מים. זהו השלב המימי במהלך חילוץ.
   7. טרי להכין 10 מיליליטר של extractioמגיב n על ידי הוספת 8.0 מיליליטר של 1-butanol, 1.6 מיליליטר של אתר אתיל ו0.40 מיליליטר של formate אתיל. הפוך לערבב.
   8. להוסיף 300 μl של מגיב החילוץ לשלב המימי. מערבולת את התערובת במהירות שיא במשך 5 דקות ולהפריד את השכבות על ידי צנטריפוגה במהירות שיא (18,000 XG) במשך 2 דקות.
   9. לאסוף את השכבה המימית התחתונה לתוך צינור microfuge חדש, תוך הימנעות את השכבה העליונה אורגנית, הממשק, וגלול. חזור על חילוץ של השלב המימי עוד פעמיים עם מגיב חילוץ טרי.
   10. יבש לחלוטין את השכבה מימית שנאסף על ידי צנטריפוגה ואקום. לפזר את גלולה ב -50 μl של מים על ידי sonication אמבטיה.
   11. הוסף 2 μl של כל דגימה 4 מיליליטר של נוזל נצנץ בבקבוקון נצנץ 6 מיליליטר פוליאתילן. לקבוע את מספר הספירות (בCPM) בכל דגימה על ידי נצנץ נוזלי באמצעות חלון פתוח.
   12. אחסן את הדגימות ב -20 ° C עד מוכן לHPLC.
3. הפרדה³ H-glycero-inositides ידי HPLC
   1. הכן חיץ ידי סינון 1 ליטר של מים ultrapure עם בקבוק מסנן 0.22 מיקרומטר ואקום עליון, ואחרי סילוק גזים.
   2. הכן חיץ B על ידי ביצוע פתרון 1 ליטר של פוספט dibasic M אמוניום 1 (APS, MW 132.06) במים ולהתאים את ה- pH 3.8 עם חומצה זרחתית. סנן פוספט אמוניום עם בקבוק מסנן 0.22 מיקרומטר ואקום עליון, ואחרי סילוק גזים.
   3. להרכיב את הבקבוקון על ידי הזרקת זיווד 2 מיליליטר בקבוקון עם הוספת נפח קטן 250 μl קפיץ. לטעון 10 מיליון CPM ולהוסיף מים להיקף כולל של 55 μl. הכן בקבוקון ריק עם 55 μl של מים.
   4. מכסה את צלוחיות עם כובעי בורג לבוש עם septa PTFE / סיליקון (צד אדום מול בתוך הבקבוקון). מניחים כל בקבוקון במגש דגימה האוטומטי של HPLC, החל בבקבוקון הריק.
   5. השתמש HPLC ותוכנה הקשורים השולט זרימת חיץ, degasses מאגרים ובקרות להזריק מדגםעַל. השתמש בזרימת scintillator מקוון ותוכנה הקשורים אליו להסדיר את קצב זרימת הזוהרים ולפקח על אות ^H-3 הריקבון.
      1. השתמש בעמודת כרומטוגרפיה נוזלית SAX עם ממדים של 250 מ"מ x 4.6 מ"מ ומכיל 5 מיקרומטר שרף סיליקה בHPLC. לצייד את הטור עם שומר עמודה כדי למנוע הזרקה של חומרים מזהמים.
      2. התקן תא זרימה 500 μl ³ H-תואם בזרימת scintillator.
         הערה: פלזמה ניתן לעשות עם מערכת HPLC סדרת אינסוף Agilent 1,200 נשלטת על ידי תוכנת Chemstation או עם מערכות HPLC זמינות מסחרי אחרות. נצנץ זרימת eluent HPLC ניתן לעשות עם זרימת scintillator β-RAM נשלט על ידי תוכנת לורה או אחר זרימת scintillator זמין מסחרי או תוכנה תואמת.
   6. לאתחל את משאבת רבעוני בקצב זרימה של 1.0 מיליליטר / דקה עם 100% א חיץ
   7. הגדרת פרופיל איזון על HPLCכדי לשלוט בצבע של חוצצים ו- B (לקרוא "פרוטוקול איזון" זה): 1% הצפת B ל5 דקות, 1-100% B ל5 דקות, 100% B דקות 5, 100-1% B ל5 דקות, 1% B במשך 20 דקות. להגדיר את מגבלת הלחץ ב -400 בר, 1.0 מיליליטר / קצב זרימה דק ', ו -30 דקות זמן לרוץ.
   8. הגדרת פרופיל elution (איור 2) על HPLC לשלוט השיפוע של חוצצים ו- B (קורא לזה "פרוטוקול"): 1% ב 5 דקות ל, 1-20% ב 40 דקות, 20-100% B במשך 10 דקות, 100% B דקות 5, 100-1% B עבור 20 דקות, 1% ב 10 דקות. להגדיר את מגבלת הלחץ ב -400 בר, 1.0 מיליליטר / קצב זרימה דק ', ו -90 דקות זמן לרוץ.
   9. הגדר את פרוטוקול זיהוי על זרימת scintillator (קורא לזה "פרוטוקול זיהוי") לרוץ במשך 60 דקות, עם קצב זרימת נוזל נצנץ של 2.5 מיליליטר / דקה ולהתעכב זמן 8.57 שניות.
   10. לתכנת רצף הזרקה אוטומטית על HPLC להתחיל עם ריק מים על "פרוטוקול איזון", ואחריו בדואראח radiolabelled מדגם על "פרוטוקול". לאתחל את הרצף כאשר מוכן.
   11. בעוד הטווח הוא עדיין בפרוטוקול האיזון, ליצור אצווה על זרימת scintillator למדוד כל הדגימות עם "פרוטוקול זיהוי." ההזרקה של כל דגימה חדשה תהיה לאתחל "פרוטוקול" על HPLC תוך מפעילה את הזרימה scintillator להתחיל "פרוטוקול זיהוי."
   12. בסיום כל הריצות, לשטוף את HPLC, העמודה ולזרום scintillator עם 100% הצפת למשך 30 דקות ב 1.0 מיליליטר / קצב זרימה דק '.
4. ניתוח נתונים
   1. השתמש בתוכנת לורה או כל תוכנה אחרת שיכול לכמת את ספקטרום כרומטוגרפיה. השלבים מתוארים בסעיף זה מתוארים באיור 3.
   2. לפתוח את הקבצים על ידי לחיצה על "קובץ", "פתח", ובחר את קובץ הנתונים הגולמי עבור כל דגימה.
   3. בכרטיסייה "chromatograms", zoאום בלמתוח כל אחת מהפסגות פחותות (כ 1000 ספירה [ציר y]) תוך השמירה על הרזולוציה הזמן. זום לשיא כל פרט במידת צורך.
   4. סמן כל אחד מהפסגות לניתוח שימוש באפשרות "הוסף את ההחזר על ההשקעה". לזהות פסגות על ידי זמן של elution: Gro-Ins הורים ב 10 דקות, Gro-Ins3P ב 18 דקות, Gro-Ins4P ב 20 דקות, Gro-Ins P (3,5) ₂ ב -29 דקות וGro-Ins (4,5 P) ₂ ב 32 דקות.
   5. בכרטיסייה "שולחנות אזורים", להקליט "האזור (ספירות)" של כל שיא. הערה "להתחיל (mm: ss)" זמן ו: זמן של כל שיא "הסוף (מ"מ SS)".
   6. לחיסור רקע, להדגיש אזור סמוך לשיא פורש את אותה הכמות של זמן. הפחת את מספר הסעיפים מהשיא המקביל.
   7. לנרמל את השטח של כל שיא נגד Gro-Ins של הורים (המבוטא "% מPtdIns הכולל"). לאחר מכן, לנרמל כל אחד מהשיאים בכל תנאי ניסוי נגד מצב השליטה (המבוטא "nעליית -fold לעומת שליטה ").
      הערה: נורמליזציה של שיא כל יכולה להיעשות גם נגד ספירה כוללת אבל מאז Gro-Ins של ההורים הוא הרבה יותר עשיר מכל PtdInsPs האחר התוצאות נוטות להיות דומה.
   8. לייצא את הנתונים לchromatographs ידי לחיצה על "קובץ", "שמור בשם ...", ולבחור את "CSV (מופרד בפסיקים)" פורמט קובץ. העלילה נתונים על גיליון אלקטרוני ולהציג במידת צורך.

תוצאות

באמצעות שיטה זו, שמרי PtdInsPs תויגו מטבולית עם -inositol מיו ³ H-. לאחר תיוג, פוספוליפידים היו זירז עם חומצת perchloric, ואחריו deacylation וחילוץ של מסיסים במים Gro-InsPs (איור 1) פוספוליפידים. בשלב זה, חשוב לכמת את האות רדיואקטיבי הכוללת הקשורים Gro-InsPs שח?...

Discussion

מאמר זה מפרט את פרוטוקול הניסוי נדרש לכמת רמות סלולריות של PtdnsPs ידי זרימת נצנץ מצמידים HPLC משמרים. המתודולוגיה מאפשרת תיוג המטבולית של PtdInsPs עם -inositol מיו ³ H-, ואחריו עיבוד שומנים והפקה של ³ H-Gro-InsPs, חלוקה HPLC מסיס במים וניתוח. באמצעות שיטה זו, הרמות יחסי של Ptd...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Butanol	Biobasic	BC1800	Reagent grade
Ammonium phosphate dibasic	Bioshop	APD001	ACS grade
Ammonium sulfate	Biobasic	ADB0060	Ultra Pure grade
Autosampler	Agilent	G1329B	Agilent 1260 infinity series
Biotin	Sigma	B4501
Boric acid	Biobasic	BB0044	Molecular biology grade
Calcium Chloride	Biobasic	CT1330	Ahydrous, industrial grade
Calcium pantothenate	Sigma	C8731
Copper(II) sulfate	Sigma	451657	Anhydrous
D-Glucose	Biobasic	GB0219	Anhydrous, biotech grade
Dulbecco's modification of Eagle's Medium	Life	11995-065	With 4.5 g/L glucose, 110 mg/L pyruate, L-glutamine
Dulbecco's modification of Eagle's Medium	MP biomedicals	0916429	With 4.5 g/L glucose, without L-gluatmine, without inositol
EDTA	Biobasic	EB0107	Acid free, ultra pure grade
Ethyl ether	Caledon labs	1/10/4700	Anhydrous, reagent grade
Ethyl formate	Sigma	112682	Reagent grade
Fetal bovine serum	Wisent	080-450	US origin, premium quality, heat inactivated
Fetal Bovine Serum, Dialyzed	Life	26400044	US origin
FlowLogic U	LabLogic Systems Ltd	SG-BXX-05	Scintillation fluid for flow scintillation
Folic acid	Biobasic	FB0466	USP grade
HEPES buffer solution	Life	15630080	1 M solution
Inositol, Myo-[2-3H(N)]	Perkin Elmer	NET114005MC	9:1 ethanol to water
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine	Life	51500056	100x solution
Iron(III) chloride	Sigma	157740	Reagent grade
Laura - Chromatography data collection and analysis software	LabLogic Systems Ltd	Version 4.2.1.18	Flow scintillator software
L-glutamine	Sigma	G7513	200 mM, solution, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture
Magnesium Chloride	Sigma	M8266	Anhydrous
Manganese sulfate	Biobasic	MB0334	Monohydrate, ACS grade
Methanol	Caledon labs	6701-7-40	HPLC Grade
Methylamine solution	Sigma	426466	40% (v/v)
Monopotassium phosphate	Biobasic	PB0445	Anhydrous, ACS grade
Nicotinic acid	Biobasic	NB0660	Reagent grade
OpenLAB CSD ChemStation	Agilent	Rev. C.01.03	HPLC software
p-aminobenzoic acid (PABA)	Bioshop	PAB001.100	Free acid
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333	100X, liquid, stabilized, sterile-filtered, cell culture tested
Perchloric acid	Sigma	244252	ACS reagent, 70%
PhenoSpher SAX column	Phenomenex	00G-315-E0	5 µm, 80 Å, 250 x 4.6 mm
Phosphoric acid	Caledon labs	1/29/8425	Reagent grade
Potassium Chloride	Biobasic	PB0440	ACS grade
Potassium iodide	Biobasic	PB0443	ACS grade
Pyridoxine hydrochloride	Sigma	P9755
Quaternary pump	Agilent	G1311C	Agilent 1260 infinity series
Riboflavin	Bioshop	RIB333.100	USP grade
Sodium Chloride	Biobasic	DB0483	Biotech grade
Sodium molybdate	Sigma	243655
Thermostatted Column Compartment	Agilent	G1316A	Agilent 1260 infinity series
Thiamine hydrochloride	Sigma	T4625	Reagent grade; make solution of 0.02% (w/v), forms a suspension. mix and freeze aliquots
Ultima Gold	Perkin Elmer	6013321	Scintillation coctail for liquid scintillation counting
Zinc sulfate	Biobasic	ZB2906	Heptahydrate, reagent grade
β-RAM 4	IN/US systems	Model 4	Flow scintillator - 500 µl flow cell; alternative Radiomatic Flow Scintillator Analyser by Perkin Elmer