JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Фосфоинозитиды сигнализируют липиды, чья относительная численность быстро меняется в ответ на различные раздражители. Эта статья описывает метод измерения обилие фосфоинозитидов метаболически нумерующих клеток с 3 H-мио -inositol с последующей экстракцией и деацилирования. Извлеченные глицеро-inositides затем разделяют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и количественно с помощью проточной сцинтилляции.

Аннотация

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Введение

Phosphoinositides (PtdInsPs) are important signaling phospholipids that help regulate a variety of cellular functions, including signal transduction, membrane trafficking and gene expression, which then modulate higher-order cell behavior such as cell division, organelle identity and metabolic activity1-3. There are seven species of PtdInsPs that are derived from the phosphorylation of the 3, 4, and/or 5 positions of the inositol head group of phosphatidylinositol (PtdIns), the parent phospholipid. Importantly, the seven PtdInsPs are unequally distributed and the local concentration of each PtdInsP species can increase or decrease at specific subcellular sites where they bind to a distinct set of protein effectors, which together permits each PtdInsP to control the identity and function of its host membrane3,4. In addition, the levels of each PtdInsP need to be tightly controlled since this can significantly impact the signal intensityproduced by a PtdInsP. The localization and levels of each PtdInsP depends on the targeting and activity of numerous lipid kinases, phosphatases and phospholipases that mediate the synthesis and turnover of each PtdInsP3,4. Hence, misregulation of the PtdInsP regulatory machinery can perturb cell function, leading to diseases such as cancer and degenerative diseases2,5,6. To fully understand the roles and functions of PtdInsPs and their regulatory machinery, both microscopy-based and biochemical-based techniques have been developed to track and quantify PtdInsPs.

In many cases, PtdInsPs bind to their protein effectors via a specific protein domain7-9. These protein modules often retain their proper fold and lipid recognition properties when expressed separately from the entire protein. This gave rise to PtdInsP probes by fusing a specific PtdInsP-binding protein domain to a fluorescent protein (FP) like green fluorescent protein (GFP) for the subcellular detection of PtdInsPs by microscopy. Indeed, many studies have used FP-fused PtdInsP-binding protein modules to identify the localization and dynamics of specific PtdInsP species by live-cell imaging1,10. For example, the Pleckstrin homology (PH) domain of phospholipase C δ1 (PLCδ1) fused to GFP specifically recognizes the phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate [PtdIns(4,5)P2] on the plasma membrane, whereas tandem copies of the FYVE domain of early endosome antigen 1 (EEA1) has been employed to track phosphatidylinositol-3-phosphate (PtdIns3P) on endosomes10-13. Overall, microscopy-based techniques are great to visualize PtdInsP localization and dynamics, but there are several caveats including that PtdInsP-binding domains may also interact with additional factors other than the target PtdInsP species and that they cannot detect changes below cytosolic fluorescence of the FP-probes.

Biochemical techniques including thin-layer chromatography, mass spectrometry and radioisotope labeling can also be used to characterize and quantify the levels of each PtdInsP14-16. These methods require the isolation of lipids for the detection of cellular levels of PtdInsPs. Mass spectrometry can be used to characterize phospholipids from lipid extracts and is invaluable for determining the acyl chain composition of PtdInsPs14,17. However, mass spectrometry is mostly semi-quantitative and it remains difficult to resolve and concurrently quantify PtdInsP species of the same molecular weight14,17. In comparison, radioisotope labeling of PtdInsPs followed by high performance liquid chromatography (HPLC)-coupled flow scintillation is useful for the separation and concurrent quantification of all seven species of PtdInsPs18. The use of HPLC with a strong anion exchange (SAX) column achieves separation based on molecular weight, charge and shape, thus fractionating deacylated PtdInsPs (Gro-InsPs) even of the same molecular weight and charge. Coupling the HPLC eluent to a flow scintillator then generates radioactive-based signal peaks for each Gro-InsPs species relative to the original parent glycerol-inositol (Gro-Ins)18. This ultimately corresponds to relative levels of PtdInsPs in cells.

Radiolabeling of PtdInsPs and HPLC-coupled flow scintillation is a useful tool to investigate the regulation and function of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate [PtdIns(3,5)P2], a PtdInsP that only constitutes ~0.1-0.3% of PtdIns16,19,20. Synthesis of PtdIns(3,5)P2 is performed by the PtdIns3P 5-kinase called Fab1 in yeast and PIKfyve in mammals21. This reaction is counteracted by a PtdIns(3,5)P2 5-phosphatase called Fig4 in yeast or mFig4/Sac3 in mammals22-24. Interestingly, both PIKfyve/Fab1 and mFig4/Fig4/Sac3 exist in a single complex and are regulated by the scaffolding adaptor protein, Vac14 in yeast or mVac14/ArPIKfyve in mammals25,26. In VAC14-deleted yeast cells, Fab1 does not function efficiently leading to a 90% decrease in PtdIns(3,5)P2 levels27,28. On the other hand, Atg18 is a PtdIns(3,5)P2 effector protein that may control vacuolar fission 29. Atg18 is also a negative regulator of PtdIns(3,5)P2 since the deletion of its gene, ATG18, causes a 10 to 20-fold increase in PtdIns(3,5)P2 levels29,30. Overall, changes in the levels of PtdIns(3,5)P2 severely impacts the function of the yeast vacuole and the mammalian lysosomes, consequently affecting processes such as membrane trafficking, phagosome maturation, autophagy and ion transport 6,19,21,31.

This article describes the process of radioisotope labeling of PtdInsPs with 3H-myo-inositol in yeast to detect the relative levels of PtdIns(3,5)P2 in wild-type, vac14Δ and atg18Δ yeast strains. Using this as an example, the resolving capabilities of HPLC for the separation of individual PtdInsPs as well as the sensitivity of flow scintillation for detection of trace amount of 3H-myo-inositol is shown. We also elaborate on how one might optimize the methodology for labeling and separating 3H-labelled PtdInsPs from mammalian cells, whose samples tend to be more complex since these cells possess all seven PtdInsP species.

протокол

Примечание: Приведенный ниже текст подробно описывает метод измерения PtdInsPs в дрожжах. Она обеспечивает экспериментальные данные для маркировки клеток дрожжей с 3 H-мио -inositol, добывающих и deacylating липидов и протокола ВЭЖХ-элюции для фракционирования и количественно деацилированный PtdInsPs. Пожалуйста, обратите внимание, что маркировка, деацилирования, разрешение и количественное PtdInsPs в клетках млекопитающих требуют оптимизации и длинные профили ВЭЖХ-элюирования. Эти детали могут быть найдены в других местах, хотя мы обсудим некоторые аспектов в обсуждении. В целом, методика для извлечения липидов, deacylate и извлечь водорастворимые GRO-InsPs из дрожжевого дается и показано на фиг.1.

1. Протокол для маркировки и Анализ PtdInsPs в дрожжах

  1. Клеточная культура и радиоактивной
    1. Выращивают жидкой культуральной 20 мл дрожжевого штамма SEY6210 при 30 ° С с постоянном встряхивании в полном синтетическихСМИ середины логарифмической фазы или оптической плотности при 600 нм (OD 600) приблизительно 0,6-0,7 с.
      Примечание: Не используйте YPD СМИ, так как это может повлиять на 3 Н мио -inositol включение. Этот размер культура должна обеспечить достаточный материал для 2-3 ВЭЖХ трасс.
    2. Гранул в общей сложности 10-14 OD дрожжевых клеток (обратите внимание, что 1 мл культуры с OD 600 = 1 содержит около 1x10 7 клеток) центрифугированием при 800 х г в течение 5 мин в 12 мл с круглым дном трубки. Ресуспендируют с 2 мл инозитол-среды, свободной (IFM) (см таблицу 1 для IFM состава).
    3. Повторите центрифугирования и аспирации средства массовой информации. Ресуспендируют гранул с 440 мкл IFM и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин.
    4. Добавить 60 мкл 3 H-мио -inositol (1 мкл = 1 мкКи) к каждому образцу и инкубировать при растущей температуре 30 ° С в течение от 1 до 3 ч с постоянном встряхивании.
      Внимание: 3 Н мио -inositol является радиоактивным помощникриала, который должен быть обработан после соответствующей подготовки. Кроме того, все расходные материалы, которые делают контакт с 3 H-материал, содержащий должны быть утилизированы надлежащим образом и обозначается как радиоактивных отходов.
      Примечание: Температура роста может быть изменен в соответствии с требованиями тех пор, пока все штаммы в сравнении выращивают при той же температуре.
    5. Передача клеточной суспензии (500 мкл) в микроцентрифужных пробирку, содержащую 500 мкл 9% хлорной кислоты и 200 мкл кислоты промывали стеклянные шарики. Смешайте инверсии и инкубировать на льду в течение 5 мин.
    6. Vortex образца при максимальной скорости в течение 10 мин и передачи лизатов к новому трубки микроцентрифужных использованием гель-наливного наконечника, чтобы избежать стеклянные шарики.
    7. Гранул образца при 12000 х г в течение 10 мин при 4 ° С и аспирата супернатант.
    8. Ресуспендируют гранул путем обработки ультразвуком ванны в 1 мл охлажденного льдом 100 мМ EDTA. Гранул снова, как и прежде.
  2. Деацилирование и добыча
  3. Свежий подготовить 5,0 мл Деацилирование реагента путем объединения 2,3 мл метанола, 1,3 мл 40% раствора метиламина, 0,55 мл 1-бутанола и 0,80 мл воды. Обратить перемешать.
  4. Аспирируйте ЭДТА и разрушать ультразвуком осадок в 50 мкл воды.
  5. Добавить 500 мкл реагента деацилирования и разрушать ультразвуком перемешать. Инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин.
  6. Тепловые липидов в течение 50 мин при 53 ° С в нагревательный блок. Сушат образцы полностью вакуумным центрифугированием в течение 3 ч или O / N.
    1. Убедитесь, что химическая ловушка устанавливается между вакуумной центрифуге-и вакуумным насосом, чтобы предотвратить попадание паров в воздухе.
  7. Ресуспендируют гранул с 300 мкл воды ванны ультразвуком и инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин. Высушите образцы от вакуумного центрифугирования в течение 3 ч или O / N. Повторите этот шаг еще раз.
  8. Разрушать ультразвуком осадок с 450 мкл воды. Это водную фазу в процессе экстракции.
  9. Свежий подготовить 10 мл extractioп реагента добавлением 8,0 мл 1-бутанола, 1,6 мл этилового эфира и 0,40 мл этилового эфира муравьиной кислоты. Обратить перемешать.
  10. Добавить 300 мкл экстракционного реагента в водной фазе. Вихревой смесь на максимальной скорости в течение 5 мин и слои разделяют центрифугированием при максимальной скорости (18000 х г) в течение 2 мин.
  11. Собирают нижнюю водную фазу в новую пробирке, избегая при этом верхний органический слой, интерфейс и осадок. Повторите экстракцию водной фазы в два раза больше свежей экстракционной реагента.
  12. Полностью высушите собранную водный слой путем вакуумной центрифугирования. Дисперсные осадок в 50 мкл воды ванны ультразвуком.
  13. Добавьте 2 мкл каждого образца 4 мл сцинтилляционной жидкости в сцинтилляционный флакон 6 мл полиэтиленовую. Определить количество отсчетов (в КФМ) в каждом образце жидкой фазе, используя открытое окно.
  14. Не хранить образцы при -20 ° С до готовности для ВЭЖХ.
  • Разделение3 Н-глицеро-inositides методом ВЭЖХ
    1. Получают буфер A путем фильтрации 1 л воды высшей степени очистки с бутылкой сверху 0,22 мкм вакуум-фильтре с последующим дегазации.
    2. Получают буфер B, сделав 1 л раствора 1 М двухосновного фосфата аммония (APS, МВт 132,06) в воде и доведения рН до 3,8 с помощью фосфорной кислоты. Фильтр фосфат аммония с бутылкой сверху 0,22 мкм вакуум-фильтре с последующим дегазации.
    3. Соберите пузырек впрыска по оснащению 2 мл флакон с пружинным 250 мкл малого объема вставки. Загрузите 10 млн CPM и добавьте воду при общем объеме 55 мкл. Приготовьте чистый флакон с 55 мкл воды.
    4. Крышка флаконы с винтовой крышкой оборудованных с ПТФЭ / силиконовой перегородками (красный лицевой стороной внутрь флакона). Поместите каждый флакон в автоматической выборки лоток ВЭЖХ, начиная с пустой флакон.
    5. Используйте ВЭЖХ и соответствующее программное обеспечение, которое управляет буфера потока, дегазирует буферы и контролирует образец injectiна. Используйте онлайн сцинтиллятор потока и его соответствующее программное обеспечение для регулирования скорости потока искрящийся и контролировать сигнал на 3 Н-распада.
      1. Использование SAX жидкого хроматографическую колонку с размерами 250 мм х 4,6 мм и содержащую 5 мкм кремнезема смолы в ВЭЖХ. Экипировка столбец с колонки охранника, чтобы предотвратить введение примесей.
      2. Установите 3 Н-совместимого мобильного 500 мкл потока в сцинтиллятора потока.
        Примечание: Фракционирование может быть сделано с Agilent 1200 серии бесконечности ВЭЖХ системы контролируемого программного обеспечения Chemstation или с другими коммерчески доступных систем ВЭЖХ. Поток мерцание ВЭЖХ элюента может быть сделано с сцинтиллятора β-RAM потока контролируемой с помощью программного обеспечения или другого Лаура коммерчески доступного сцинтиллятора потока или совместимого программного обеспечения.
    6. Инициализировать четвертичного насоса, при скорости потока 1,0 мл / мин с 100% -ным буфером А.
    7. Настройка профиля уравновешивания на ВЭЖХконтролировать градиент буферов А и В (называем это "Протокол равновесия"): 1% буфера В в течение 5 мин, 1-100% B в течение 5 мин, 100% B в течение 5 мин, 100-1% B в течение 5 мин, 1% B в течение 20 мин. Установите предел давления в 400 бар, 1,0 мл / мин скорости потока, и 30 мин во время выполнения.
    8. Настройте профиль элюции (рисунок 2) на ВЭЖХ контролировать градиент буферов А и Б (называют это "Протокол"): 1% B в течение 5 мин, 1-20% B в течение 40 мин, 20-100% В течение 10 мин, 100% B в течение 5 мин, 100-1% B в течение 20 мин, 1% B в течение 10 мин. Установите предел давления в 400 бар, 1,0 мл / мин скорости потока, и 90 мин во время выполнения.
    9. Настройка протокола обнаружения на сцинтиллятора потока (называем это "протокол обнаружения"), чтобы запустить в течение 60 мин при скорости потока текучей среды сцинтилляционного 2,5 мл / мин и времени выдержки 8,57 сек.
    10. Программирование автоматизированной последовательности впрыска на ВЭЖХ начать с воды заготовки на "Протокол для уравновешивания", а затем по электроннойACH радиоактивным изотопом пробы на "Протокол". Инициализировать последовательность, когда будете готовы.
    11. В то время как вращение сохраняется в протоколе уравновешивания создать партию на сцинтиллятора для измерения расхода всех образцах с "Протокол обнаружения." Инъекция каждого нового образца будет инициализировать "Протокол" на ВЭЖХ, а запуск сцинтиллятор потока, чтобы начать "Протокол обнаружения."
    12. По завершении всех трасс, промыть ВЭЖХ, колонка и сцинтиллятор течь со 100% буфера А в течение 30 мин при 1,0 мл / мин скорости потока.
  • Анализ данных
    1. Используйте программное обеспечение Laura или любое другое программное обеспечение, которое может количественно спектры хроматографии. Шаги, описанные в этом разделе показаны на рисунке 3.
    2. Откройте файлы, нажав кнопку "Файл", "Открыть" и выберите файл исходных данных для каждого образца.
    3. На вкладке "хроматограммы", зоом, чтобы растянуть каждый из меньших пиков (около 1000 на счету [у-ось]), сохраняя разрешение по времени. Осмотрите каждого пика, если необходимо.
    4. Выделите каждый из пиков для анализа с помощью "Добавить ROI" инструмент. Определить пики по времени элюирования: Родительский GRO-Ins в 10 мин, Гро-Ins3P на 18 мин, Гро-Ins4P на 20 мин, Гро-Ins (3,5) P 2 на 29 мин и Гру-Ins (4,5 ) Р 2 при 32 мин.
    5. На вкладке "Регионы" таблицы, записывать "площадь (графов)» каждого пика. Обратите внимание на "Старт (мм: сс)" время и "конец (мм: сс)" времени каждого пика.
    6. Для вычитания фона, выделить области, примыкающей к вершине, охватывающей такое же количество времени. Вычитание число отсчетов из соответствующего пика.
    7. Нормализовать площадь каждого пика против родителей Гру-Ins (в виде "% от общего объема PtdIns"). Затем, нормализуют каждую из вершин в каждой экспериментальной состоянии по отношению к контрольной группы (в виде "п-кратно увеличение по сравнению с контролем ").
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нормализация каждого пика может быть сделано в отношении общего счета, но так как родительский Гру-Ins гораздо более обильные, чем всех других PtdInsPs результаты, как правило, похожи.
    8. Экспорт данных для хроматографов, нажав кнопку "Файл", "Сохранить как ..." и выберите "CSV (разделенные запятой)" формат файла. Участок данных в электронной таблице и представить по мере необходимости.

    • Результаты

    Используя этот метод, дрожжи PtdInsPs были метаболически метили с 3 H-мио -inositol. После маркировки, фосфолипиды осаждают хлорной кислотой, а затем фосфолипидов деацилирования и извлечения водорастворимого Gro-InsPs (фиг.1). На этом этапе важно, чтобы определит...

    Обсуждение

    Эта статья подробно описывает экспериментальный протокол, необходимый для количественного клеточные уровни PtdnsPs с помощью ВЭЖХ связью потока мерцаний от дрожжей. Методика дает возможность обмена веществ маркировки PtdInsPs с 3 H-мио -inositol с последующей обработкой липидов и извл...

    Раскрытие информации

    The authors declare that they have no competing financial interests.

    Благодарности

    C.Y.H. was supported by an Ontario Graduate Scholarship from the Government of Ontario. This article was made possible by funding held by R.J.B. from the Natural Sciences and Engineering Research Council, the Canada Research Chairs Program and Ryerson University.

    Материалы

    NameCompanyCatalog NumberComments
    1-ButanolBiobasicBC1800Reagent grade
    Ammonium phosphate dibasicBioshopAPD001ACS grade
    Ammonium sulfateBiobasicADB0060Ultra Pure grade
    AutosamplerAgilentG1329BAgilent 1260 infinity series
    BiotinSigmaB4501
    Boric acidBiobasicBB0044Molecular biology grade
    Calcium ChlorideBiobasicCT1330Ahydrous, industrial grade
    Calcium pantothenateSigmaC8731
    Copper(II) sulfateSigma451657Anhydrous
    D-GlucoseBiobasicGB0219Anhydrous, biotech grade
    Dulbecco's modification of Eagle's MediumLife11995-065With 4.5 g/L glucose, 110 mg/L pyruate, L-glutamine
    Dulbecco's modification of Eagle's MediumMP biomedicals0916429 With 4.5 g/L glucose, without L-gluatmine, without inositol
    EDTABiobasicEB0107Acid free, ultra pure grade
    Ethyl etherCaledon labs1/10/4700Anhydrous, reagent grade
    Ethyl formateSigma112682Reagent grade
    Fetal bovine serumWisent080-450US origin, premium quality, heat inactivated
    Fetal Bovine Serum, DialyzedLife26400044US origin
    FlowLogic ULabLogic Systems LtdSG-BXX-05Scintillation fluid for flow scintillation 
    Folic acidBiobasicFB0466USP grade
    HEPES buffer solutionLife156300801 M solution
    Inositol, Myo-[2-3H(N)]Perkin ElmerNET114005MC9:1 ethanol to water
    Insulin-Transferrin-Selenium-EthanolamineLife51500056100x solution
    Iron(III) chlorideSigma157740Reagent grade
    Laura - Chromatography data collection and analysis softwareLabLogic Systems LtdVersion 4.2.1.18Flow scintillator software
    L-glutamineSigmaG7513200 mM, solution, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture
    Magnesium ChlorideSigmaM8266Anhydrous
    Manganese sulfateBiobasicMB0334Monohydrate, ACS grade
    MethanolCaledon labs6701-7-40HPLC Grade
    Methylamine solutionSigma42646640% (v/v)
    Monopotassium phosphateBiobasicPB0445Anhydrous, ACS grade
    Nicotinic acidBiobasicNB0660Reagent grade
    OpenLAB CSD ChemStation AgilentRev. C.01.03 HPLC software
    p-aminobenzoic acid (PABA)BioshopPAB001.100Free acid
    Penicillin-StreptomycinSigmaP4333100X, liquid, stabilized, sterile-filtered, cell culture tested
    Perchloric acidSigma244252ACS reagent, 70%
    PhenoSpher SAX columnPhenomenex00G-315-E05 µm, 80 Å, 250 x 4.6 mm
    Phosphoric acidCaledon labs1/29/8425Reagent grade
    Potassium ChlorideBiobasicPB0440ACS grade
    Potassium iodideBiobasicPB0443ACS grade
    Pyridoxine hydrochlorideSigmaP9755
    Quaternary pumpAgilentG1311CAgilent 1260 infinity series
    RiboflavinBioshopRIB333.100USP grade
    Sodium ChlorideBiobasicDB0483Biotech grade
    Sodium molybdateSigma243655
    Thermostatted Column CompartmentAgilentG1316AAgilent 1260 infinity series
    Thiamine hydrochlorideSigmaT4625Reagent grade; make solution of 0.02% (w/v), forms a suspension. mix and freeze aliquots
    Ultima GoldPerkin Elmer6013321Scintillation coctail for liquid scintillation counting
    Zinc sulfateBiobasicZB2906Heptahydrate, reagent grade
    β-RAM 4IN/US systemsModel 4Flow scintillator - 500 µl flow cell; alternative Radiomatic Flow Scintillator Analyser by Perkin Elmer 

    Ссылки

    1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
    2. Bridges, D., Saltiel, A. R. Phosphoinositides and Disease. Curr. Top. Microbiol. Immuno. 362, 61-85 (2012).
    3. Botelho, R. J. Changing phosphoinositides "on the fly": How trafficking vesicles avoid an identity crisis. BioEssays. 31 (10), 1127-1136 (2009).
    4. Simonsen, A., Wurmser, A. E., Emr, S. D., Stenmark, H. The role of phosphoinositides in membrane transport. Curr. Opin. Cell. Biol. 13 (4), 485-492 (2001).
    5. Katso, R., Okkenhaug, K., Ahmadi, K., Timms, J., Waterfield, M. D. Cellular Function of Phosphoinositide 3-Kinases: Implications for Development, Immunity, Homeostasis, and Cancer. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 615-675 (2001).
    6. Lenk, G. M., Meisler, M. H. Mouse models of PI(3,5)P2 deficiency with impaired lysosome function. Methods. Enzymo. 534, (2014).
    7. Lemmon, M. A. Phosphoinositide recognition domains. Traffic. 4 (4), 201-213 (2003).
    8. Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains-their role in signalling and membrane trafficking. Curr. Biol. 11 (21), R882-R893 (2001).
    9. Balla, T. Inositol-lipid binding motifs: signal integrators through protein-lipid and protein-protein interactions. J. Cell. Sci. 118 (Pt 10), 2093-2104 (2005).
    10. Burd, C. G., Emr, S. D. Phosphatidylinositol(3)-phosphate signaling mediated by specific binding to RING FYVE domains. Mol. Cell. 2 (1), 157-162 (1998).
    11. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92 (23), 10472-10476 (1995).
    12. Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J. Cell. Biol. 169 (1), 139-149 (2005).
    13. Gillooly, D. J., et al. Localization of phosphatidylinositol 3-phosphate in yeast and mammalian cells. EMBO J. 19 (17), 4577-4588 (2000).
    14. Haag, M., Schmidt, A., Sachsenheimer, T., Brügger, B. Quantification of Signaling Lipids by Nano-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry (Nano-ESI MS/MS). Metabolites. 2 (1), 57-76 (2012).
    15. Furutani, M., Itoh, T., Ijuin, T., Tsujita, K., Takenawa, T. Thin layer chromatography-blotting, a novel method for the detection of phosphoinositides. J. Biochem. 139 (4), 663-670 (2006).
    16. Cooke, F. T., et al. The stress-activated phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinase Fab1p is essential for vacuole function in. 8 (22), 1219-1222 (1998).
    17. Milne, S. B., Ivanova, P. T., DeCamp, D., Hsueh, R. C., Brown, H. A. A targeted mass spectrometric analysis of phosphatidylinositol phosphate species. J. Lipid. Res. 46 (8), 1796-1802 (2005).
    18. Rusten, T. E., Stenmark, H. Analyzing phosphoinositides and their interacting proteins. Nat. methods. 3 (4), 251-258 (2006).
    19. Ho, C. Y., Alghamdi, T. A., Botelho, R. J. Phosphatidylinositol-3,5-bisphosphate: no longer the poor PIP2. Traffic. 13 (1), 1-8 (2012).
    20. Samie, M., et al. A TRP channel in the lysosome regulates large particle phagocytosis via focal exocytosis. Dev. Cel. 26 (5), 511-524 (2013).
    21. Shaw, J. D., Hama, H., Sohrabi, F., DeWald, D. B., Wendland, B. PtdIns(3,5)P2 is required for delivery of endocytic cargo into the multivesicular body. Traffic. 4 (7), 479-490 (2003).
    22. Botelho, R. J., Efe, J. A., Emr, S. D. Assembly of a Fab1 phosphoinositide kinase signaling complex requires the Fig4 phosphoinositide phosphatase. Mol. Biol. Cell. 19, 4273-4286 (2008).
    23. Rudge, S. A., Anderson, D. M., Emr, S. D. Vacuole size control: Regulation of PtdIns(3,5)P2 levels by the vacuole-associated Vac14-Fig4 complex, a PtdIns(3,5)P2-specific phosphatase. Mol. Biol. Cell. 15, 24-36 (2004).
    24. Sbrissa, D., et al. Core protein machinery for mammalian phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate synthesis and turnover that regulates the progression of endosomal transport: Novel Sac phosphatase joins the ArPIKfyve-PIKfyve complex. J. Biol. Chem. 282 (33), 23878-23891 (2007).
    25. Alghamdi, T. A., et al. Vac14 protein multimerization is a prerequisite step for Fab1 protein complex assembly and function. J. Biol. Chem. 288 (13), 9363-9372 (2013).
    26. Ikonomov, O. C., Sbrissa, D., Fenner, H., Shisheva, A. PIKfyve-ArPIKfyve-Sac3 core complex: Contact sites and their consequence for Sac3 phosphatase activity and endocytic membrane homeostasis. J. Biol. Chem. 284 (51), 35794-35806 (2009).
    27. Dove, S. K., et al. Vac14 controls PtdIns(3,5)P(2) synthesis and Fab1-dependent protein trafficking to the multivesicular body. Curr. Biol. 12 (11), 885-893 (2002).
    28. Bonangelino, C. J., et al. Osmotic stress-induced increase of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate requires Vac14p, an activator of the lipid kinase Fab1p. J. Cell. Biol. 156 (6), 1015-1028 (2002).
    29. Dove, S. K., et al. Svp1p defines a family of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate effectors. EMBO J. 23 (9), 1922-1933 (2004).
    30. Efe, J. A., Botelho, R. J., Emr, S. D. Atg18 regulates organelle morphology and Fab1 kinase activity independent of its membrane recruitment by phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate. Mol. Biol. Cell. 18 (1), 4232-4244 (2007).
    31. Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p Ptdlns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (6), 847-858 (1998).
    32. Duex, J. E., Nau, J. J., Kauffman, E. J., Weisman, L. S. Phosphoinositide 5-phosphatase Fig4p is required for both acute rise and subsequent fall in stress-induced phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate levels. Eukaryotic Cell. 5 (4), 723-731 (2006).
    33. Whiteford, C. C., Best, C., Kazlauskas, A., Ulug, E. T. D-3 phosphoinositide metabolism in cells treated with platelet-derived growth factor. Biochem J. 319 (3), 851-860 (1996).
    34. Murthy, P. P., et al. Evidence of two isomers of phosphatidylinositol in plant tissue. Plant physiology. 98 (4), 1498-1501 (1992).
    35. Zolov, S. N., et al. In vivo, Pikfyve generates PI(3,5)P2, which serves as both a signaling lipid and the major precursor for PI5P. Proc. 109 (43), 17472-17477 (2012).
    36. McEwen, R. K., et al. Complementation analysis in PtdInsP kinase-deficient yeast mutants demonstrates that Schizosaccharomyces pombe and murine Fab1p homologues are phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinases. J. Biol. Chem. 274 (48), 33905-33912 (1999).
    37. Tolias, K. F., et al. Type I phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinases synthesize the novel lipids phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate and phosphatidylinositol 5- phosphate. J. Biol. Chem. 273 (29), 18040-18046 (1998).
    38. Ikonomov, O. C., et al. The phosphoinositide kinase PIKfyve is vital in early embryonic development: preimplantation lethality of PIKfyve-/- embryos but normality of PIKfyve+/- mice. J. Biol. Chem. 286 (15), 13404-13413 (2011).
    39. Sarkes, D., Rameh, L. E. A Novel HPLC-Based Approach Makes Possible the Spatial Characterization of Cellular PtdIns5P and Other Phosphoinositides. Biochem J. 428 (3), 375-384 (2011).
    40. Sbrissa, D., Ikonomov, O. C., Filios, C., Delvecchio, K., Shisheva, A. Functional dissociation between PIKfyve-synthesized PtdIns5P and PtdIns(3,5)P2 by means of the PIKfyve inhibitor YM201636. Am. J. Physiol. Cel. Physiol. 303 (4), 436-446 (2012).
    41. D'Souza, K., Epand, R. M. Enrichment of phosphatidylinositols with specific acyl chains. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1838 (6), 1501-1508 (2014).
    42. Shulga, Y. V., Anderson, R. A., Topham, M. K., Epand, R. M. Phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase isoforms exhibit acyl chain selectivity for both substrate and lipid activator. J. Biol. Chem. 287 (43), 35953-35963 (2012).
    43. Pettitt, T. R., Dove, S. K., Lubben, A., Calaminus, S. D. J., Wakelam, M. J. O. Analysis of intact phosphoinositides in biological samples. J. Lipid. Res. 47 (7), 1588-1596 (2006).

    Перепечатки и разрешения

    Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

    Запросить разрешение

    Смотреть дополнительные статьи

    107

    This article has been published

    Video Coming Soon

    JoVE Logo

    Конфиденциальность

    Условия эксплуатации

    Политика

    СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

    РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

    НОВОСТИ JoVE

    Исследования

    Образование

    АВТОРЫ

    Библиотекарь

    О JoVE

    Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены