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要約

ホスホイノシチドは、その相対的存在量急速に様々な刺激に応答して変化するシグナル伝達脂質ています。この記事では、代謝的に抽出し、脱アシル化に続いて3 H- ミオ -イノシトールの 、で細胞を標識することによりホスホイノシチドの豊かさを測定する方法について説明します。抽出グリセロinositidesは次に高速液体クロマトグラフィーにより分離し、フローシンチレーションによって定量化されます。

要約

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

概要

Phosphoinositides (PtdInsPs) are important signaling phospholipids that help regulate a variety of cellular functions, including signal transduction, membrane trafficking and gene expression, which then modulate higher-order cell behavior such as cell division, organelle identity and metabolic activity1-3. There are seven species of PtdInsPs that are derived from the phosphorylation of the 3, 4, and/or 5 positions of the inositol head group of phosphatidylinositol (PtdIns), the parent phospholipid. Importantly, the seven PtdInsPs are unequally distributed and the local concentration of each PtdInsP species can increase or decrease at specific subcellular sites where they bind to a distinct set of protein effectors, which together permits each PtdInsP to control the identity and function of its host membrane3,4. In addition, the levels of each PtdInsP need to be tightly controlled since this can significantly impact the signal intensityproduced by a PtdInsP. The localization and levels of each PtdInsP depends on the targeting and activity of numerous lipid kinases, phosphatases and phospholipases that mediate the synthesis and turnover of each PtdInsP3,4. Hence, misregulation of the PtdInsP regulatory machinery can perturb cell function, leading to diseases such as cancer and degenerative diseases2,5,6. To fully understand the roles and functions of PtdInsPs and their regulatory machinery, both microscopy-based and biochemical-based techniques have been developed to track and quantify PtdInsPs.

In many cases, PtdInsPs bind to their protein effectors via a specific protein domain7-9. These protein modules often retain their proper fold and lipid recognition properties when expressed separately from the entire protein. This gave rise to PtdInsP probes by fusing a specific PtdInsP-binding protein domain to a fluorescent protein (FP) like green fluorescent protein (GFP) for the subcellular detection of PtdInsPs by microscopy. Indeed, many studies have used FP-fused PtdInsP-binding protein modules to identify the localization and dynamics of specific PtdInsP species by live-cell imaging1,10. For example, the Pleckstrin homology (PH) domain of phospholipase C δ1 (PLCδ1) fused to GFP specifically recognizes the phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate [PtdIns(4,5)P2] on the plasma membrane, whereas tandem copies of the FYVE domain of early endosome antigen 1 (EEA1) has been employed to track phosphatidylinositol-3-phosphate (PtdIns3P) on endosomes10-13. Overall, microscopy-based techniques are great to visualize PtdInsP localization and dynamics, but there are several caveats including that PtdInsP-binding domains may also interact with additional factors other than the target PtdInsP species and that they cannot detect changes below cytosolic fluorescence of the FP-probes.

Biochemical techniques including thin-layer chromatography, mass spectrometry and radioisotope labeling can also be used to characterize and quantify the levels of each PtdInsP14-16. These methods require the isolation of lipids for the detection of cellular levels of PtdInsPs. Mass spectrometry can be used to characterize phospholipids from lipid extracts and is invaluable for determining the acyl chain composition of PtdInsPs14,17. However, mass spectrometry is mostly semi-quantitative and it remains difficult to resolve and concurrently quantify PtdInsP species of the same molecular weight14,17. In comparison, radioisotope labeling of PtdInsPs followed by high performance liquid chromatography (HPLC)-coupled flow scintillation is useful for the separation and concurrent quantification of all seven species of PtdInsPs18. The use of HPLC with a strong anion exchange (SAX) column achieves separation based on molecular weight, charge and shape, thus fractionating deacylated PtdInsPs (Gro-InsPs) even of the same molecular weight and charge. Coupling the HPLC eluent to a flow scintillator then generates radioactive-based signal peaks for each Gro-InsPs species relative to the original parent glycerol-inositol (Gro-Ins)18. This ultimately corresponds to relative levels of PtdInsPs in cells.

Radiolabeling of PtdInsPs and HPLC-coupled flow scintillation is a useful tool to investigate the regulation and function of phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate [PtdIns(3,5)P2], a PtdInsP that only constitutes ~0.1-0.3% of PtdIns16,19,20. Synthesis of PtdIns(3,5)P2 is performed by the PtdIns3P 5-kinase called Fab1 in yeast and PIKfyve in mammals21. This reaction is counteracted by a PtdIns(3,5)P2 5-phosphatase called Fig4 in yeast or mFig4/Sac3 in mammals22-24. Interestingly, both PIKfyve/Fab1 and mFig4/Fig4/Sac3 exist in a single complex and are regulated by the scaffolding adaptor protein, Vac14 in yeast or mVac14/ArPIKfyve in mammals25,26. In VAC14-deleted yeast cells, Fab1 does not function efficiently leading to a 90% decrease in PtdIns(3,5)P2 levels27,28. On the other hand, Atg18 is a PtdIns(3,5)P2 effector protein that may control vacuolar fission 29. Atg18 is also a negative regulator of PtdIns(3,5)P2 since the deletion of its gene, ATG18, causes a 10 to 20-fold increase in PtdIns(3,5)P2 levels29,30. Overall, changes in the levels of PtdIns(3,5)P2 severely impacts the function of the yeast vacuole and the mammalian lysosomes, consequently affecting processes such as membrane trafficking, phagosome maturation, autophagy and ion transport 6,19,21,31.

This article describes the process of radioisotope labeling of PtdInsPs with 3H-myo-inositol in yeast to detect the relative levels of PtdIns(3,5)P2 in wild-type, vac14Δ and atg18Δ yeast strains. Using this as an example, the resolving capabilities of HPLC for the separation of individual PtdInsPs as well as the sensitivity of flow scintillation for detection of trace amount of 3H-myo-inositol is shown. We also elaborate on how one might optimize the methodology for labeling and separating 3H-labelled PtdInsPs from mammalian cells, whose samples tend to be more complex since these cells possess all seven PtdInsP species.

プロトコル

注：テキストは、以下に詳細に酵母でPtdInsPsを測定する方法について説明します。これは、3 H- ミオ -イノシトールの 、脂質を抽出し、脱アシル化及び脱アシル化PtdInsPsを分別し、定量化するためのHPLC溶出プロトコルで標識する酵母細胞のための実験の詳細を提供します。最適化と長いHPLC溶出プロファイルを必要とする哺乳動物細胞におけるPtdInsPsのラベリング、脱アシル化、解像度および定量に注意してください。我々は議論中の側面のいくつかを議論してもこれらの詳細は、他の場所で見つけることができます。全体的に、脂質を抽出しアシル基を除去すると、酵母から水溶性GRO-InsPsを抽出する方法が与えられ、 図1に示されています。

酵母におけるラベル付けとの解析法PtdInsPs 1.プロトコル

  1. 細胞培養および放射性標識
    1. 定数は完全に合成で振とうしながら30℃で酵母株SEY6210 20mlの培養液を成長させます対数期中期または約0.6〜0.7の600 nmの（OD 600）での光学密度のメディア。
      注：これは3 H- ミオ -イノシトールの取り込みに影響を与える可能性があるとして、YPDメディアを使用しないでください。この培養サイズは2-3のHPLCの実行のために十分な材料を提供する必要があります。
    2. 12ミリリットル丸底チューブ中で5分間800×gで遠心分離することによって（OD 600 = 1で1mlの文化が〜1×10 7個の細胞が含まれていることに注意してください）酵母細胞の10〜14 ODの合計をペレット化。イノシトールを含まない培地（IFM）の2mlで再懸濁（IFM組成については表1を参照）。
    3. 遠心分離を繰り返し、メディアを吸引除去します。 IFMの440μlのペレットを再懸濁し、室温で15分間インキュベートします。
    4. 各試料に3 H- ミオ -イノシトール（1μL=1μCiの）の60μlを添加して、振盪しながら1〜3時間、30℃の成長温度でインキュベートします。
      注意：3 H- ミオ -イノシトールのは、放射性メイトであります適切なトレーニングの後に処理されるべきであるリアル。また、3 H含有材料と接触するすべての消耗品が適切に配置されるべきであり、放射性廃棄物として指定されました。
      注：成長温度を変化させることができる限り、全ての株が、同じ温度で成長され比較されるように、必要に応じ。
    5. 9％過塩素酸500μlのを含むマイクロ遠心チューブに細胞懸濁液（500μl）を転送し、酸200μlのガラスビーズを洗浄しました。反転によって混合し、5分間氷上でインキュベートします。
    6. 10分間最高速度でサンプルをボルテックスし、ガラスビーズを回避するために、ゲルローディングチップを使用して、新しいマイクロ遠心チューブに溶解物を移します。
    7. 4℃で10分間12,000×gで試料をペレット化し、上清を吸引します。
    8. 氷冷100 mMのEDTA、1mlのバス超音波処理によってペレットを再懸濁。以前のように再びペレット化します。
  2. 脱アシル化および抽出
    1. たてのメタノールを2.3ミリリットル、40％のメチルアミンの1.3ミリリットル、1-ブタノールと水の0.80ミリリットルの0.55ミリリットルを組み合わせることにより、脱アシル化試薬5.0mlのを準備します。混合するために反転します。
    2. EDTAを吸引し、50μlの水にペレットを超音波処理します。
    3. 脱アシル化試薬の500μlを添加して、混合する超音波処理。室温で20分間インキュベートします。
    4. ヒートブロック中で53℃で50分間熱脂質。 3時間またはO / Nを介して真空遠心分離によって完全にサンプルを乾燥させます。
      1. 化学トラップは空気が入るの蒸気を防ぐために、真空遠心分離機と真空ポンプとの間に設置されていることを確認します。
    5. 風呂超音波処理によって水300μlのペレットを再懸濁し、室温で20分間インキュベートします。 3時間またはO / Nのための真空遠心分離によりサンプルを乾燥させます。もう一度この手順を繰り返します。
    6. 水450μlのペレットを超音波処理。これは、抽出時の水相です。
    7. たてextractioの10ミリリットルを準備1-ブタノールの8.0 mlの、エチルエーテル、ギ酸エチル0.40 mlの1.6 mlで添加することにより、n個の試薬。混合するために反転します。
    8. 水相に抽出試薬を300μlを追加します。 5分間トップスピードでボルテックス混合物を、2分間、最高速度（18,000 XG）で遠心分離して層を分離します。
    9. トップ有機層、インターフェース、およびペレットを避けながら、新しいマイクロチューブに底部の水層を収集します。新鮮な抽出試薬で二回以上の水性相の抽出を繰り返します。
    10. 完全真空遠心分離によって収集し、水層を乾燥させます。風呂超音波処理によって水50μlにペレットを分散させます。
    11. 6ミリリットルのポリエチレンシンチレーションバイアルにシンチレーション液4mlのに各2μlのサンプルを追加します。開いているウィンドウを使用して、液体シンチレーションにより各サンプルにおける（CPM）でカウント数を決定します。
    12. HPLCの準備が整うまで-20℃でサンプルを保管してください。
  3. の分離HPLCによる3 H-グリセロinositides
    1. 脱気に続いて、ボトル上部0.22μmの真空フィルター、と超純水1Lをフィルタリングすることにより、緩衝液Aを準備します。
    2. 水に、1Mリン酸アンモニウム二塩基（APS、MW 132.06）の1 L溶液を作ることによってバッファBを準備し、リン酸でpHを3.8に調整します。脱気に続いて、ボトル上部0.22μmの真空フィルター、とリン酸アンモニウムをフィルタリングします。
    3. バネ付き250μlの小容量インサートを2ミリリットルバイアルを艤装によって注射バイアルを組み立てます。千万インプレッションをロードし、55μlの総体積のために水を追加します。水55μlのブランクバイアルを準備します。
    4. PTFE /シリコンセプタムを装備し、スクリューキャップ付きバイアルに蓋（バイアルの内側に面した赤側）。ブランクバイアルから始まる、HPLCの自動サンプリングトレイに各バイアルを置きます。
    5. 、バッファの流れを制御し、HPLCと関連ソフトウェアを使用して、バッファおよびコントロールサンプルinjectiを脱ガスに。シンチラント流量を調節するために、オンラインフローシンチレータおよびその関連ソフトウェアを使用して、3 H-減衰信号を監視します。
      1. X 4.6ミリメートル250ミリメートルの寸法のSAX液体クロマトグラフィーカラムを使用し、HPLCに5μmのシリカ樹脂を含みます。汚染物質の注入を防止するために、カラムガードカラムを装い。
      2. フローシンチレータに3 H-互換500μlのフローセルをインストールします。
        注：分画はChemStationソフトウェアによって、または他の市販のHPLCシステムを用いて制御のAgilent 1200無限シリーズHPLCシステムを用いて行うことができます。 HPLCの溶離液の流れシンチレーションは、ローラ・ソフトウェアまたは他の市販の流れシンチレータまたは互換性のあるソフトウェアによって制御β-RAMフローシンチレータで行うことができます。
    6. 100％緩衝液Aと1.0 ml /分の流速で四級ポンプを初期化します
    7. HPLCで平衡プロファイルを設定5分間の1％緩衝液B、5分間の1-100％のB、5分間100％B、5用100-1％のB：緩衝液AおよびBの勾配（この「プロトコル平衡」と呼ぶ ）を制御します分で、20分間、1％B。 400バール、1.0 ml /分の流速、および30分の実行時の圧力限界を設定します。
    8. 緩衝液AおよびBの勾配を制御するために、HPLCで溶出プロフィール（ 図2）を設定し （この「プロトコルA」と呼ぶ ）：5分間1％のB、40分間の1〜20％のB、20〜100％ 10分、5分間100％B、20分100-1％のB、10分間で1％BのB。 400バール、1.0 ml /分の流速、および90分の実行時に圧力限界を設定します。
    9. 2.5ミリリットル/分、8.57秒の滞留時間のシンチレーション液の流速で、60分間実行する（この「プロトコル検出」と呼ぶ ）の流れシンチレータで検出プロトコルを設定します。
    10. プログラムEに続いて「プロトコル平衡 」に水を空白で開始するHPLCで自動注入シーケンス、「プロトコルA」の放射性標識サンプルをACH。準備ができたらシーケンスを初期化します。
    11. ランが平衡プロトコルに入れたまま、と全てのサンプルを測定するためのフローシンチレータのバッチを作成する「プロトコル検出を 。」開始するフローシンチレータをトリガしながら、それぞれの新しい試料の注入は、HPLC の 「プロトコルA」を初期化する」 を検出プロトコル 。 "
    12. すべてのランの完了時、HPLC、カラムをフラッシュし、1.0 ml /分の流速で30分間、100％緩衝液Aを用いてシンチレータを流します。
  4. データ分析
    1. ローラ・ソフトウェアまたはクロマトグラフィースペクトルを定量化することができる任意の他のソフトウェアを使用してください。このセクションで説明する手順は、図3に示されています。
    2. 「ファイル」、「開く」をクリックしてファイルを開いて、各サンプルの生データファイルを選択します。
    3. 「クロマトグラム」タブで、ZO時間分解能を維持しながら、より小さなピーク（約1000カウント[Y軸]）のそれぞれを伸ばすことでOM。必要に応じて、それぞれの個々のピークに拡大します。
    4. 「ROIを追加」ツールを使用して、分析のための各ピークを強調表示します。 18分にGRO-Ins3P、10分で親グロイン、29分とグロインでのGRO-Ins4P 20分で、グロイン（3,5）P 2（4,5：溶出時間によってピークを同定32分で）、P 2。
    5. 「地域・テーブル」タブで、各ピークの「面積（カウント）」を記録します。時間と「終了（MM：SS）」は、各ピークの時間：「（SS mm）の起動」を注意してください。
    6. バックグラウンド除去のために、同じ時間に及ぶピークに隣接する領域を強調表示します。対応するピークからのカウント数を減算します。
    7. （「合計のPtdInsの％」と表記）親グロインに対する各ピークの面積を正規化します。その後、N」として表現（制御条件に対して、各実験条件での各ピークを正規化倍増加）」を制御するために比較されます。
      注：各ピークの正規化は、全カウントに対しても行うことができますが、親のグロインは、結果が似ている傾向にある他のすべてのPtdInsPsよりもはるかに豊富であるため。
    8. 「CSV（カンマ区切り） "ファイル形式を" ...として保存」、「ファイル」を押して、クロマトグラフ用のデータをエクスポートし、選択します。スプレッドシート上のデータをプロットし、必要に応じて提示します。

結果

この方法を用いて、酵母PtdInsPsは、代謝的に3 H- ミオ -イノシトールを用いて標識しました。標識後、リン脂質は、リン脂質脱アシル化し、水溶性GRO-InsPs（ 図1）を抽出し、過塩素酸を用いて沈殿させました。この段階では、それはのPtdIns（3,5）P 2のような非常に低存在量PtdInsPsために十分な信号対雑音比を確保するために、液...

ディスカッション

この記事では、酵母からHPLC結合フローシンチレーションによりPtdnsPsの細胞レベルを定量化するために必要な実験プロトコルの詳細について説明します。方法論は、脂質処理、水溶性3 H-GRO-InsPs、HPLC分画と分析を抽出した3 H- ミオ -イノシトールとPtdInsPsの代謝標識を可能にします。 PtdInsについて示されているように、この方法を用いて、種々の条件下での細胞におけるP...

開示事項

The authors declare that they have no competing financial interests.

謝辞

C.Y.H. was supported by an Ontario Graduate Scholarship from the Government of Ontario. This article was made possible by funding held by R.J.B. from the Natural Sciences and Engineering Research Council, the Canada Research Chairs Program and Ryerson University.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1-ButanolBiobasicBC1800Reagent grade
Ammonium phosphate dibasicBioshopAPD001ACS grade
Ammonium sulfateBiobasicADB0060Ultra Pure grade
AutosamplerAgilentG1329BAgilent 1260 infinity series
BiotinSigmaB4501
Boric acidBiobasicBB0044Molecular biology grade
Calcium ChlorideBiobasicCT1330Ahydrous, industrial grade
Calcium pantothenateSigmaC8731
Copper(II) sulfateSigma451657Anhydrous
D-GlucoseBiobasicGB0219Anhydrous, biotech grade
Dulbecco's modification of Eagle's MediumLife11995-065With 4.5 g/L glucose, 110 mg/L pyruate, L-glutamine
Dulbecco's modification of Eagle's MediumMP biomedicals0916429 With 4.5 g/L glucose, without L-gluatmine, without inositol
EDTABiobasicEB0107Acid free, ultra pure grade
Ethyl etherCaledon labs1/10/4700Anhydrous, reagent grade
Ethyl formateSigma112682Reagent grade
Fetal bovine serumWisent080-450US origin, premium quality, heat inactivated
Fetal Bovine Serum, DialyzedLife26400044US origin
FlowLogic ULabLogic Systems LtdSG-BXX-05Scintillation fluid for flow scintillation 
Folic acidBiobasicFB0466USP grade
HEPES buffer solutionLife156300801 M solution
Inositol, Myo-[2-3H(N)]Perkin ElmerNET114005MC9:1 ethanol to water
Insulin-Transferrin-Selenium-EthanolamineLife51500056100x solution
Iron(III) chlorideSigma157740Reagent grade
Laura - Chromatography data collection and analysis softwareLabLogic Systems LtdVersion 4.2.1.18Flow scintillator software
L-glutamineSigmaG7513200 mM, solution, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture
Magnesium ChlorideSigmaM8266Anhydrous
Manganese sulfateBiobasicMB0334Monohydrate, ACS grade
MethanolCaledon labs6701-7-40HPLC Grade
Methylamine solutionSigma42646640% (v/v)
Monopotassium phosphateBiobasicPB0445Anhydrous, ACS grade
Nicotinic acidBiobasicNB0660Reagent grade
OpenLAB CSD ChemStation AgilentRev. C.01.03 HPLC software
p-aminobenzoic acid (PABA)BioshopPAB001.100Free acid
Penicillin-StreptomycinSigmaP4333100X, liquid, stabilized, sterile-filtered, cell culture tested
Perchloric acidSigma244252ACS reagent, 70%
PhenoSpher SAX columnPhenomenex00G-315-E05 µm, 80 Å, 250 x 4.6 mm
Phosphoric acidCaledon labs1/29/8425Reagent grade
Potassium ChlorideBiobasicPB0440ACS grade
Potassium iodideBiobasicPB0443ACS grade
Pyridoxine hydrochlorideSigmaP9755
Quaternary pumpAgilentG1311CAgilent 1260 infinity series
RiboflavinBioshopRIB333.100USP grade
Sodium ChlorideBiobasicDB0483Biotech grade
Sodium molybdateSigma243655
Thermostatted Column CompartmentAgilentG1316AAgilent 1260 infinity series
Thiamine hydrochlorideSigmaT4625Reagent grade; make solution of 0.02% (w/v), forms a suspension. mix and freeze aliquots
Ultima GoldPerkin Elmer6013321Scintillation coctail for liquid scintillation counting
Zinc sulfateBiobasicZB2906Heptahydrate, reagent grade
β-RAM 4IN/US systemsModel 4Flow scintillator - 500 µl flow cell; alternative Radiomatic Flow Scintillator Analyser by Perkin Elmer 

参考文献

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