Una nueva estrategia Array-CGH, secuenciación del exoma todo y electroporación en el útero en roedores para identificar los Genes causales de las malformaciones del cerebro

Resumen

Heterotopia nodular periventricular (PNH) es la forma más común de malformación del desarrollo cortical (MCD) en la edad adulta, pero su base genética sigue siendo desconocido en los casos más esporádicos. Recientemente hemos desarrollado una estrategia para identificar genes candidatos novela de MCDs y confirmar directamente su papel causativo en vivo.

Resumen

Defectos congénitos que involucran a la corteza cerebral, también conocido como malformaciones del desarrollo cortical (MCD), son causas importantes de discapacidad intelectual y cuenta para 20-40% de la epilepsia resistente a fármacos en la infancia. Proyección de imagen de alta resolución del cerebro ha facilitado la identificación en vivo de un grupo grande de fenotipos MCD. A pesar de los avances en proyección de imagen de cerebro, análisis genómico y generación de modelos animales, un flujo de trabajo sencillo dar prioridad sistemáticamente a genes candidatos y efecto funcional de mutaciones putativas es falta. Para superar este problema, una estrategia experimental que permite la identificación de nuevos genes causativos para MCD fue desarrollada y validada. Esta estrategia se basa en identificar regiones genómicas de candidatos o genes por array-CGH o conjunto-exoma secuenciar y caracterizar los efectos de su inactivación o sobreexpresión de mutaciones específicas en el desarrollo de roedor cerebro via el útero en electroporación. Este enfoque condujo a la identificación del gen C6orf70 , codificando para una proteína supuesta del vesicular, a la patogenesia de heterotopia nodular periventricular, un MCD causada por una migración neuronal defectuosa.

Introducción

La corteza cerebral juega un papel clave en los procesos cognitivos e intelectuales y participa en la memoria como aprendizaje y control emocional. Por lo tanto no es sorprendente que muchas enfermedades neurológicas y psiquiátricas como resultado de las malformaciones del desarrollo cortical (MCD). La etiología de la MCD es compleja puesto que ambos adquirieron y están implicados factores genéticos. La prevalencia acumulada de genéticamente determinada proporción de MCD es alrededor del 2% y son esporádicas en la mayoría de los casos. Por ejemplo, la incidencia de la disgenesia congénita del cerebro era estimada para ser superior al 1% en la población humana, y algunas formas de MCD se observan en más del 14% de los pacientes con epilepsia y en el 40% de epilepsia severa o insuperable^{1, 2}.

Heterotopia Nodular periventricular (PNH) es una de la MCDs más común y es causada por la migración anormal de las neuronas de la zona ventricular (VZ) a la corteza cerebral en desarrollo. La falta de neuronas para migrar los resultados en clusters de heterotopic neuronas a lo largo de las paredes de los ventrículos laterales que normalmente se pueden visualizar mediante imágenes por resonancia magnética (MRI). Las características clínicas, anatómicas y proyección de imagen de PNH son heterogéneas. Los nódulos varían desde pequeño y unilateral a bilateral y simétrica. Secuelas clínicas comunes incluyen el de discapacidad intelectual y epilepsia³. Las mutaciones en el gene del Filamin A (o FLNA), que se asigna en Xq28, encontraron en el 100% de familias con PNH bilateral X-ligado y en el 26% de pacientes esporádicos^3,4. Una forma recesiva rara de PNH causada por mutaciones en el gen ARFGEF2 , que mapas en 20q13, se ha divulgado en dos familias consanguíneas⁵. Recientemente, se han identificado mutaciones biallelic en genes que codifican el par de cadherina de receptor-ligando DCHS1 y FAT4 en nueve pacientes afectados por un trastorno multisistémico que incluye PNH⁶. PNH, también se ha asociado con frágil síndrome⁷, síndrome de Williams⁸, de síndrome de microdeleción 22q11⁹, duplicaciones en 5 p 15¹⁰, eliminaciones en 1 p 36¹¹, 5q14.3-q15¹², 6 p 25¹³ y 6q canceladura terminal síndrome^{14,15,16,17,18,19}, lo que sugiere que los genes causales adicionales están dispersos por todo el genoma. Sin embargo, aproximadamente el 74% de pacientes esporádicos del PNH la base genética queda esclarecida¹⁷.

Mapeo genético clásico se acerca como matriz hibridación Genomic comparativo (CGH-array) han demostrado para ser una herramienta poderosa para la detección de anormalidades cromosómicas sub microscópicas, sin embargo, las regiones genómicas que se identifican con este enfoque son a menudo grandes y contienen numerosos genes.

El advenimiento de las técnicas de secuenciación masiva en paralelo (es decir, secuenciación del exoma todo (WES) y todo el genoma secuencia (gt)) ha reducido sustancialmente el costo y el tiempo requerido para un entero exoma humano o el genoma de la secuencia. Sin embargo, la interpretación de los datos de WES y WGS sigue desafiante en la mayoría de los casos, puesto que para las variantes de cada paciente decenas a cientos (o incluso miles, dependiendo del tipo de análisis) emergen de filtrado de datos.

Para acelerar el proceso de identificación de nuevos genes causantes de la MCD, una nueva estrategia sistemática combinación de array-CGH, WES y en el útero electroporación (IUE) detección de genes candidatos fue diseñado. IUE permite inactivar selectivamente (o sobreexpresan) determinados genes o mutaciones en el cerebro de roedor, lo que permite la evaluación rápida de su participación en corticogenesis^18,19. RNAi mediado-caída o sobreexpresión de uno o más genes del candidato se espera que causa, cuando el gen se asocia con el desarrollo de la enfermedad, defectos localizados en la migración neuronal o maduración. Sobre la identificación de un gen cuya inactivación (o sobreexpresión) reproduce el fenotipo observado en pacientes en roedores, se convierte en un candidato excelente para la investigación en pacientes esporádicos con MCD. Usando este acercamiento, recientemente reveló la crucial contribución del gen C6orf70 (también conocido como ERMARD) en patogenesia de la PNH en albergar 6q27 canceladuras cromosómicas¹⁶pacientes.

Protocolo

Declaración de ética: Ratas Wistar fueron acopladas, mantenidas y utilizadas en las instalaciones animales INMED, de acuerdo con la legislación de la Unión Europea y francesa.

1. ADN extracción y cuantificación de Array-CGH y WES

1. Extraer el DNA genómico (gDNA) de leucocitos de la sangre humana de pacientes usando un robot automatizado de aislamiento de ADN o comercialmente disponible manual kits de extracción de ADN según protocolo del fabricante. Cuantificar todas las muestras usando un espectrofotómetro.

2. array-CGH protocolo

1. Digestión de la restricción del gDNA
   1. Doble digest 500 ng de gDNA purificada de un paciente y un control humano disponible comercialmente ADN con RsaI y AluI por 2 h a 37 ° C. Utilizar 0,5 μl de enzima 10 de U/μL de cada reacción. Incubar por 20 min a 65 ° C para inactivar las enzimas y pasar los tubos de muestras de hielo.
2. Etiquetado de la muestra
   1. Añadir el volumen adecuado de los Primers al azar para el formato de microarrays en uso a cada tubo de reacción (por ejemplo 5 μL para microarrays 1-pack, paquete de 2 y 4-pack). Mezclar por pipeteo hacia arriba y hacia abajo suavemente.
   2. Transferencia de tubos en un termociclador. Incubar a 95 ° C por 3 min y luego a 4 ° C durante 5 minutos.
   3. Preparar un Cianina de Cianina 3 y un 5 etiquetado Master Mix en el hielo mezclando los siguientes volúmenes: 10.0 μL 5 X Buffer de reacción, 5,0 μl 10 x dNTPs, 3.0 μL Cianina 3-dUTP o Cianina 5-dUTP y 1,0 μL Exo (-) la enzima Klenow, 2.0 μL de agua libre de nucleasa. Elija el volumen de cada reactivo según el formato de microarrays en uso.
   4. Añadir el etiquetado Master Mix a cada tubo de reacción que contiene el gDNA. Mezclar por pipeteo suavemente hacia arriba y hacia abajo.
   5. Transferencia de tubos en un termociclador, incubar a 37 ° C durante 2 h, 65 ° C durante 10 min y luego mantener las muestras a 4 ° C.
3. Purificación del gDNA etiquetado
   1. Añadir 430 μl de TE 1 x (pH 8.0) a cada tubo de reacción.
   2. Coloque una columna de purificación en tubos de 2 mL y etiquetar correctamente las columnas. Carga cada etiqueta gDNA en una columna de purificación.
   3. Centrifugar durante 10 minutos a 14.000 g de x en una microcentrífuga a temperatura ambiente. Deseche el flujo a través y vuelva a colocar la columna en el tubo de recogida de 2 ml.
   4. Añadir 480 μl de TE 1 x (pH 8.0) para cada columna. Centrifugar durante 10 minutos a 14.000 g de x en una microcentrífuga a temperatura ambiente. Deseche el flujo a través.
   5. Invertir la columna en un tubo de la colección de frescos 2 mL y centrifugar por 1 min a 1.000 x g en una microcentrífuga a temperatura ambiente para recolectar muestra purificada.
   6. Llevar el volumen de muestra a solicitó para el formato de microarrays en uso utilizando un concentrador o añadiendo 1 x TE (pH 8.0). Por ejemplo, 1-paquete de microarray llevar el volumen a 80,5 μl. Incubar la muestra en hielo durante 5 minutos y después pipetear la solución arriba y abajo 10 veces.
4. Preparación del gDNA etiquetado para hibridación
   1. Combinar muestras de prueba y de referencia en un nuevo tubo 1,5 mL libre de Rnasa la Cianina apropiado etiquetado 5 muestra y muestra marcada con 3 Cianina. Por ejemplo, para 1-paquete de microarray asegurarse de que el volumen final es 158 μl. elegir el volumen de cada muestra según el formato de microarrays en uso.
   2. Use un espectrofotómetro para medir rendimiento, grado de actividad específica o etiquetadora midiendo la absorbancia a A260 nm (ADN), A550 nm (Cianina 3) y A650 nm (Cianina 5).
      1. Calcular el rendimiento mediante la fórmula: [ADN concentration(ng/µl) x volumen de muestra (μL)] / 1.000 (ng/μg). Calcular la actividad específica mediante la fórmula: pmol por μl de colorante/μg por μl del gDNA.
         Nota: por ejemplo, de 0,5 μg de ADN de entrada, el rendimiento debe ser 8 a 11 μg y la actividad específica (pmol/μg) debe ser 25 a 40 para la Cianina 3 había etiquetado muestra y 20 a 35 para la muestra con Cianina-5.
   3. Para preparar la cantidad de hibridación Master Mix para el formato de microarrays en uso, mezclar los siguientes reactivos: 50 μl ADN Cot-1 (1.0 mg/ml), 52 μl 10 x aCGH agente de bloqueo y 260 μl 2 x HI-RPM tampón de hibridación.
   4. Añadir el volumen adecuado de la mezcla maestra de hibridación para el tubo de 1,5 ml libre de ARNasas que contiene el etiquetado gDNA para obtener el volumen total requerido para el formato de microarrays en uso. Por ejemplo, para 1 paquete de microarrays, asegúrese que el volumen final de cada reacción 362 μl.
   5. Mezcle la muestra mediante pipeteo arriba y abajo, y luego rápidamente centrifugar a 14.000 g x e incubar 3 min a 95 ° C y a 37 ° C durante 30 minutos.
5. Conjunto de cámaras e hibridación
   1. Cargar una diapositiva Junta limpia en la base de la cámara con la etiqueta del empaque hacia arriba y alineada con la sección rectangular de la base de la cámara. Asegúrese de que la junta quede al ras con la base de la cámara y no es entornado.
   2. Distribuir la mezcla de la muestra de hibridación en el pozo de la Junta, asegurándose de que la muestra se distribuye uniformemente.
   3. Colocar una diapositiva microarray en la diapositiva de Junta evaluar que el par de sándwich está correctamente alineado. A continuación, montar la cámara de reacción colocando la tapa en las diapositivas hojaldradas y apriete a mano la pinza.
   4. Asegúrese de diapositivas mojar girando la cámara montada verticalmente. Asegúrese de que las burbujas no están presentes en la cámara. Si es necesario, golpee el montaje sobre una superficie dura para mover las burbujas fijas.
   5. Poner las cámaras diapositiva montada en un bastidor de rotador para gira a 20 rpm. Poner la cámara de hibridación en un horno y realizar la hibridación a 65 ° C durante 24 o 40 h según el formato de microarrays en uso.
6. Lavado de microarrays y análisis de
   1. Sacar la cámara de hibridación de horno y sumergir en el tampón de lavado 1. Proceder a su desmontaje.
   2. Eliminar la diapositiva microarray y ponerlo rápidamente en una parrilla en tampón de lavado 1 a temperatura ambiente.
   3. Lavar el portaobjetos matriz 5 min con agitación (uso una pulga y un agitador magnético). Ajustar la velocidad del agitador a un ajuste de 4 (velocidad media), para obtener buena pero mezcla no demasiado vigoroso.
   4. Lavar el portaobjetos de serie en tampón de lavado 2 para revolver s 90. Recuperar suavemente la diapositiva desde el buffer (debe salir seco) y carga en un sostenedor de la diapositiva con la ayuda de un protector deslizante.
   5. Cargar la diapositiva en el escáner de la matriz y realizar la exploración según las instrucciones del fabricante de la matriz.
   6. Analizar los resultados utilizando el software de extracción con el analizador de uso de acuerdo con las instrucciones del fabricante (V.9.1.3.1).

3. WES protocolo

1. Objetivo de enriquecimiento
   1. Utilice el dsDNA BR ensayo para determinar la concentración de la muestra del gDNA según el protocolo de instrumento.
   2. Diluir 5 μg de alta calidad doble cadena DNA con 1 x buffer TE baja en un tubo de 1,5 mL baja bind en un volumen total de 50 μl.
   3. Configurar un sonicador y poner un microtubo en la estación de carga y descarga según las instrucciones del fabricante. Mantenga la tapa en el tubo.
   4. Transferencia lentamente la muestra 50 μl de ADN a través de los tabiques de la fractura sin la introducción de burbujas.
   5. Corte del ADN según los ajustes sugeridos del fabricante del sonicador y evaluar su calidad mediante un equipo Bioanalyzer según las instrucciones del fabricante. El destino tamaño del fragmento de ADN es 150 a 200 bp.
2. Reparación del ADN termina
   1. Preparar la mezcla de reacción de reparación final mezclando 40 μl de mezcla de enzima de reparación final con 10 μl de mezcla de Oligo de reparación final. Mezclar en un mezclador de tipo vórtex.
   2. Incubar las muestras a 20 ° C durante 30 minutos en un termociclador y luego mantenerlos a 4 ° C. No use una tapa caliente.
   3. Añadir 50 μl de la mezcla de reacción de reparación final preparado en el paso 3.2.1 para cada 50 μl cortado bien muestra de ADN. Mezclar por pipeteo arriba y abajo o con un vórtex suave.
   4. Purificar la muestra con un kit de potabilización de granos base según protocolo del fabricante.
3. Poliadenilación 3' extremos.
   1. Añadir 20 μl de mezcla de maestra dA seguimiento a cada muestra de ADN reparado final, purificada (aproximadamente 20 μl).
   2. Mezclar por pipeteo arriba y abajo o con un vórtex suave.
   3. Incubar las muestras a 37 ° C en un termociclador y luego mantenerla a 4 ° C. No use una tapa caliente.
4. Ligadura del adaptador de captura de la indexación.
   1. Añadir 5 μl de ligadura Master Mix a cada muestra de ADN A cola.
   2. Añadir 5 μl de la solución adecuada del índice de pre-captura a cada muestra.
   3. Sellar los pozos y mezcle bien todo con un vórtex para 5 s. brevemente centrifugar las muestras.
   4. Incubar las muestras a 20 ° C durante 15 minutos en un termociclador y mantenga a 4 º C. No use una tapa caliente.
   5. Purificar las muestras con un kit de potabilización de granos base según protocolo del fabricante.
5. Amplificación de la biblioteca indexada.
   1. Preparar el volumen adecuado de la mezcla de reacción PCR pre captura mezclando 1 μl de mezcla de cartilla y 25 μl de PCR Master Mix. Mezclar en un mezclador de tipo vórtex.
   2. Combinar 26 μl de la mezcla en pocillos distintos de una placa PCR de amplificación y 24 μl de cada muestra de biblioteca gDNA indexadas.
   3. Ejecutar un programa PCR con los siguientes pasos: 98 ° C por 2 min, 5 ciclos a 98 ° C por 30 s, 60 ° C durante 30 s y 72 ° C por 1 min y una extensión final a 72 ° C durante 10 minutos mantenga las muestras a 4 ° C.
   4. Purificar la muestra con un kit de potabilización de granos base según protocolo del fabricante.
   5. Evaluar la calidad con un equipo Bioanalyzer según protocolo del fabricante.
6. Puesta en común de las muestras de ADN indexadas para hibridación
   1. Para cada grupo de reacción de captura, combinar el volumen apropiado de cada muestra de biblioteca gDNA indexadas en un pocillo de una placa PCR. Por ejemplo, para humanos o ratón todo-exón capturar bibliotecas, combinar 8 Bibliotecas por piscina con 187.5 ng de cada biblioteca indexada. Asegúrese de que cada grupo de reacción de captura final contiene 1.500 ng del gDNA indexada.
   2. Reducir el volumen en cada bien a < 7 μl utilizando un concentrador de vacío. ■ Evite el secar completamente la muestra.
   3. Añadir suficiente agua libre de nucleasa a cada piscina gDNA concentrado para hacer el volumen final del pozo 7 μl y luego agitar la placa que contiene gDNA vigorosamente por 30 s. centrífuga en una centrífuga o mini-placa spinner para recoger el líquido en el fondo de los pozos.
7. Hibridación del gDNA piscinas de biblioteca a la biblioteca de captura de
   1. Añadir a cada 7 μl indexadas gDNA piscina, 9 μl de mezcla de bloqueo. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar.
   2. Tapa los pozos, transferir la placa de sellado que contiene gDNA en el termociclador e incubar a 95 ° C por 5 min, luego mantener a 65 ° C. Asegúrese de que la placa se lleva a cabo a 65 ° C durante al menos 5 minutos.
   3. Prepare la dilución apropiada de Rnasa, basándose en el tamaño de la biblioteca de captura (10% de dilución para bibliotecas < 3.0 dilución de Mb y 25% para las bibliotecas > 3,0 Mb).
   4. Según el tamaño de captura de la biblioteca, combinar la cantidad adecuada de captura biblioteca y diluir solución bloque Rnasa en una placa PCR en hielo. Mezclar por pipeteo. Para las bibliotecas de captura de < 3,0 Mb, uso 2 μl de biblioteca y 5 μl de Rnasa en dilución al 10%. Para las bibliotecas de captura > 3,0 Mb, uso 5 μl de biblioteca y 2 μl de ARNasa a dilución del 25%.
   5. Añadir 37 μl de tampón de hibridación a cada pocillo que contenga 7 μl de la mezcla de bloque de biblioteca/Rnasa capturar. Mezclar por pipeteo y centrifugar brevemente la placa que contiene la mezcla.
   6. Mantener la placa de piscina gDNA a 65 ° C con una pipeta multicanal para transferir el todo 44 μl de mezcla de captura biblioteca de paso 3.7.5 a cada muestra de la placa de piscina gDNA. Mezclar por pipeteo lentamente arriba y abajo de 8 a 10 veces.
   7. Sellar los pozos con los casquillos de la tira con forma de cúpula. Asegúrese de que todos los pocillos estén completamente sellados. Coloque una esterilla de compresión sobre la placa de la polimerización en cadena en el termociclador.
   8. Incubar la mezcla de hibridación durante 24 h a 65 ° C. Nota: Las muestras pueden ser cruzado por hibridación para hasta 72 h, pero deben verificar que la hibridación extendida no causa evaporación extensa en los pocillos de la muestra.
8. Elaboración de bolas magnéticas recubiertas de estreptavidina
   1. Precaliente el tampón de lavado 2 a 65 ° C en un baño o calor bloque.
   2. Agite vigorosamente las bolas magnéticas de estreptavidina en un mezclador de tipo vórtex. Las bolas magnéticas se instalan durante el almacenamiento.
   3. Para cada muestra de hibridación, añada 50 μl de los granos resuspendidos en pocillos de una placa PCR.
   4. Lavar los granos y resuspender en 200 μL de tampón de Unión.
9. Captura del ADN hibridado con perlas de estreptavidina.
   1. Estimar y registrar el volumen de solución de hibridación que permanece después de la incubación de 24 h.
   2. Mantener la placa de hibridación a 65 ° C y utilizar una pipeta multicanal para transferir todo el volumen (aproximadamente 60 μL) de cada mezcla de hibridación a los pocillos de la placa que contiene 200 μL de estreptavidina lavado de granos. Mezclar por pipeteo lentamente arriba y abajo de 3 a 5 veces.
   3. Tapa los pozos e incubar la placa de captura de un Nutator mezclador o equivalente durante 30 min a temperatura ambiente. Asegúrese de que las muestras están mezclando correctamente en los pozos.
   4. Centrifugar brevemente la placa de captura en una centrífuga o mini-placa spinner.
   5. Poner la placa de captura en un separador magnético para recoger los granos de la suspensión. Retire y descarte el sobrenadante.
   6. Resuspender los granos en 200 μL de tampón de lavado 1. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo hasta que los granos están totalmente suspendidos.
   7. Centrifugar brevemente en una centrífuga o mini-placa spinner.
   8. Poner la placa en el separador magnético.
   9. Espere a que la solución para limpiar, luego retire y descarte el sobrenadante.
10. La captura muestra procesamiento secuencias multiplexadas
    1. Preparar el volumen adecuado de mezcla de reacción PCR mediante la mezcla de los siguientes: 9 μl de agua libre de nucleasa, 25 μl Master Mix y 1 μl cebador mezclar según el número de amplificaciones. Mezclar con un mezclador de tipo vórtex y mantener en hielo.
    2. Para cada reacción de amplificación, colocar 35 μl de la mezcla de reacción PCR de paso 3.10.1 en los pocillos de una placa PCR.
    3. Pipeta de cada de las muestras de piscina biblioteca capturada limite de grano hacia arriba y hacia abajo para asegurar que la suspensión de grano homogénea.
    4. Añadir 15 μl de cada suspensión de grano piscina biblioteca capturada a la mezcla de reacción PCR correspondiente bien. Mezclar bien mediante pipeteo hasta la suspensión de grano homogénea.
    5. Coloque la placa preparada en el punto 3.10.2 en un termociclador y ejecutar el siguiente programa de amplificación de PCR: 98 ° C por 2 min, ciclos de 8 a 11 a 98 ° C por 30 s, 60 ° C para 30 s y 72 ° C por 1 min, seguido de una extensión final a 72 ° C durante 10 minutos. Mantener las muestras a 4 ° C.
    6. Purificar la muestra con una purificación de granos base según protocolo del fabricante.
    7. Evaluar la calidad con un equipo Bioanalyzer según protocolo del fabricante.
11. Preparar muestras para el multiplexado de secuenciación
    Nota: Las muestras finales enriquecidas contienen piscinas de 8 ó 16 bibliotecas indexadas, basado en el tamaño de captura de la biblioteca y dando por resultado la captura previa agrupación de estrategia. El número total de librerías indexadas que pueden ser multiplexados en un carril de una secuencia es determinado por las especificaciones de salida de la plataforma utilizada, junto con la cantidad de datos de secuenciación necesarios para la biblioteca de capturar.
    1. Calcular el número de índices que pueden ser combinadas por carril, según la capacidad de la plataforma. El número total de librerías indexadas que pueden ser multiplexados en un carril de una secuencia es determinado por las especificaciones de salida de la plataforma utilizada, junto con la cantidad de datos de secuenciación necesarios para la biblioteca de capturar. Por ejemplo, para la biblioteca de la v5 de exón todos humanos, los datos de secuenciación recomendada por biblioteca indexadas es de 4 Gb y los datos de secuenciación recomendada por captura de la piscina es de 32 Gb (índice de 8 piscinas).
12. La secuencia de las bibliotecas.
    1. Cargar las bibliotecas de la plataforma de secuenciación de última generación de elección y realizar la secuencia de funcionamiento según las especificaciones del instrumento.
13. Analizar los datos de secuenciación del exoma.
    1. Ejecute la canalización y el software de elección para llamar base. Por ejemplo, utilizar Stampy mapa Lee²⁰, quitar duplicados con Picard (http://broadinstitute.github.io/picard/) e identificar polimorfismos de nucleótido único e inserción o deleción de bases (indels) con Platypus²¹. Filtro de variantes sinónimas y los observados con una frecuencia del alelo < 5% y comparar los datos con los de los padres exomas para identificar variantes de novo .

4. plásmido ADN preparación para electroporación en el útero

1. Diseño de varios horquilla corta RNAs (shRNAs) apuntando la secuencia de codificación o el 3' UTR de los genes del candidato como se describió anteriormente²².
2. Para evitar que fuera objetivo efectos prueba de shRNAs especificidad por búsqueda BLAST contra bases de datos mediante métodos estándar. Excluir shRNAs mostrando más del 50% de complementariedad con otros genes de rata.
3. Oligonucleótidos de clon recocido en un vector mU6-pro como se ha descrito anteriormente²³.
4. Purificar el plásmido de DNA con un Maxi-preparación según las instrucciones del fabricante y hacer una concentración final de 3 μg/μl.
5. Alícuota de 20 μl de ADN (0,5 mg/ml pCAGGS-GFP ya sea solo o con 1,5 mg/ml de shRNAs construir) y añadir 2 μl de ayuno verde tinte (2 mg/mL) que permiten el monitoreo visual de la inyección.

5. en el útero de electroporación

1. Procedimiento quirúrgico
   1. Anestesiar E15.5 embarazadas ratas hembra (E0 se define como el día de la confirmación de tapón vaginal de esperma-positivos), con una combinación de una mezcla de ketamina/xilacina (0,1 y 0,01 mg por cuerpo de peso, respectivamente), que se da a través de un intraperitoneal inyección para la inducción anestésica.
   2. Asegúrese de que el animal está totalmente anestesiado observando la desaparición del reflejo de pellizco del dedo del pie.
   3. Afeite la parte inferior del abdomen del animal usando una maquinilla para quitar la piel. Desinfectar la piel con peelings de povidona yodada y alcohol 70%. Aplique ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad mientras esté bajo anestesia.
   4. Coloque el animal en una fuente de calor y colocar un paño estéril (con una ventana abierta de 4-5 cm en el medio) sobre el sitio de la incisión. Usar mascarillas, bata, gorros y guantes quirúrgicos estériles. Mantener la esterilidad hasta el final de la cirugía.
   5. Utilizando unas tijeras afiladas para hacer una incisión vertical (2-2.5 cm) en la piel a lo largo de la línea media en el abdomen caudal y luego hacer una incisión de la pared muscular por debajo de la piel, también de 2,5 cm, a lo largo de la línea media.
   6. Con cuidado, exponga un cuerno uterino de la cavidad abdominal. Gota de solución salina normal de 37 º C precalentado para hidratar los embriones. Mantener el útero húmedo todo el tiempo.
2. Inyección de ADN y electroporación
   1. Suavemente Sujete uno de los cuernos uterinos con pinzas anilladas y empuje con cuidado un embrión a la pared uterina. Mantener el embrión en una mano y con la otra mano insertar cuidadosamente Capillares de vidrio de 1 mm de la línea media hacia el ventrículo lateral izquierdo (2-3 mm de profundidad) e inyectar aproximadamente 1 μl de DNA con Fast Green para permitir el control visual de la inyección utilizando un microinyector.
   2. Gota de solución salina normal en la superficie de electrodos de² mm de 3 x 7. Coloque el electrodo positivo estéril del lado inyectado (ventrículo lateral izquierdo) y el electrodo negativo de estéril en el ventrículo derecho. Entregar 5 impulsos eléctricos a intervalos de 950 ms con un pedal de pie controlado (4000 mF del condensador cargado a 40 V con un electroporator).
3. Publicar procedimientos de electroporación
   1. Poner de nuevo cuernos uterinos a la cavidad abdominal, agregar gotas de solución salina normal en la cavidad para permitir que los embriones colocados más naturalmente y para tener en cuenta la pérdida de líquidos intraoperatoria.
   2. Cerca de la pared muscular abdominal con suturas quirúrgicas absorbibles, luego la piel con un punto interrumpido simple.
   3. Poner la rata a la jaula y controlar al animal hasta que salga de la anestesia.
   4. Para manejo del dolor administre buprenorfina (0,03 mg/kg) en el animal mediante una inyección subcutánea cada 8-12 h, para un máximo de 48 h.

6. preparación de muestras de cerebro

1. Método de fijación
   1. Sacrificar la rata embarazada 5 días después del procedimiento quirúrgico con anestesia de gas (isoflurano) seguida por una rápida dislocación cervical.
   2. Haga una incisión vertical para volver a abrir la cavidad abdominal.
   3. Exponer los cuernos uterinos, sacar los embriones del útero y decapita a los usando unas tijeras afiladas.
   4. Quitar el cerebro con daño mínimo al tejido: usando unas tijeras afiladas, haga una pequeña incisión a lo largo de la parte posterior (cerebelo) / eje anterior (bulbos olfativos) de la cabeza para perforar la piel y el cráneo, entonces usando un par de pinzas Retire el cráneo para exponer el cerebro y quitarlo usando una pequeña espátula.
   5. Sumergir el cerebro durante la noche a 4 ° C en un 4% paraformaldehido en 1 x de tampón de fosfato salino (PBS).
2. Secciones de la cerebral
   1. Lavar cerebros en PBS 1 x durante 10 minutos.
   2. Incrustar los cerebros en agar al 4% en plástico moldes de inclusión.
      1. Preparar 50 mL de agar al 4% de 1 x PBS para empotrar 5 cerebros embrionarios. Que agarosa disuelta esté a no más de 50 ° C.
   3. Mantener el cerebro en agarosa para polimerizar durante al menos 1 h a 4° C. Retire el exceso agarosa alrededor del cerebro.
   4. Pegue el cerebro a la placa base de vibratome, orientado para que el eje anterior/posterior del cerebro es perpendicular a la hoja. Espere unos minutos para que el pegamento se seque y coloque la placa con el cerebro pegado en la cámara de vibratome.
   5. Llene el vibratome con PBS 1 x. Corte secciones gruesas de 100 μm.
   6. Transferencia de rebanadas de cerebro en las diapositivas, eliminar el exceso de líquido, añadir unas gotas de medio de montaje y coloque un cubreobjetos encima de cerebros

7. proyección de imagen confocal y análisis cuantitativo

1. Que el seco medio de montaje durante la noche antes proyección de imagen. Secciones de imagen de 10 X en un microscopio confocal de escaneo láser.
2. Uso de software para análisis de imagen cuantitativo, convertir la imagen en 8 bits, seleccione un representante GFP positivo fluorescente de la célula y manualmente, definir su forma. Para ello, haga clic en "Cálculo" y dibujar el borde de la celda con la herramienta Selección a mano alzada. En esta forma el diámetro y el umbral de intensidad de la célula son retenidas automáticamente por el software.
3. Haga clic en "Encontrar células" para permitir que el software localizar células transfected a lo largo de la corteza. Entonces, si es necesario, eliminar manualmente falsos positivos.
4. El grueso entero de la corteza se dividen en 8 áreas de interés normalizado en secciones individuales. Para ello, haga clic en "Herramienta de la región", seleccione 8 "rayas de la región" donde la primera (1) y el último (8) rayas corresponden a la VZ y la parte superior de CP respectivamente. Haga clic en "Aplicar" para permitir que el software de la posición relativa de las células transfectada de GFP en la corteza toda la cuenta. Finalmente haga clic en "Guardar cuantificación" para exportar los datos en un archivo de Excel para el análisis.

Resultados

La estrategia experimental diseñada para identificar nuevos genes causativos MCD es recapitulada en la figura 1.

Mediante la realización de array-CGH en una cohorte de 155 pacientes con anormalidades del desarrollo cerebral variable combinación de PNH (figura 2A), disgenesia de cuerpo calloso, colpocephaly, hipoplasia cerebelosa y polymicrogyria asociados con la epilepsia, ataxia y deterioro ...

Discusión

MCDs son causas importantes de discapacidad intelectual y cuenta para 20-40% de la niñez resistente epilepsia^1,2. Interés en MCDs ha aumentado dramáticamente en la última década como resultado de dos factores principales. La primera es la mejora en imágenes (particularmente IRM) del cerebro, que permite a los médicos y científicos a visualizar muchas de las malformaciones del cerebro no reconocidas previamente. La otra es la evolución de las herramientas...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Picospritzer III	Parker Hannifin Corp	P/N 051-0500-900	Intracellular Microinjection Dispense Systems
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252	Fast green allow visual monitoring of the injection
BTX ECM 830 electroporator	BTX Harvard Apparatus	45-0002	The ECM 830 is a Square Wave Pulse generator designed for in vitro and in vivo applications
Microtome HM 650 V	Microm	10076838	Microtome HM 650 V vibratome 240V 50/60Hz with vibrating blade
FluoView 300	Olympus		The Olympus FluoViewTM 300 is a point-scanning, point-detection, confocal laser scanning microscope designed for biology research application
eCELLence software	Glance Vision Technologies		eCELLence is software designed for the quantitive analysis of cell migration
Agilent Microarray Scanner Bundle			Array slides
for 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K or 8 x 15K	Agilent	Agilent p/n G4900DA, G2565CA or G2565BA
for 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K or 8 x 60K	Agilent	Agilent p/n G4900DA or G2565CA
Hybridization Chamber, stainless	Agilent	Agilent p/n G2534A	Chamber for array CGH hybridization
Hybridization Chamber gasket slides, 5-pack			Gasket for array CGH hybridization
for 1-pack microarrays or	Agilent	Agilent p/n G2534-60003
for 2-pack microarrays or	Agilent	Agilent p/n G2534-60002
for 4-pack microarrays or	Agilent	Agilent p/n G2534-60011
for 8-pack microarrays	Agilent	Agilent p/n G2534-60014
Hybridization oven	Agilent	Agilent p/n G2545A
Hybridization oven rotator for Agilent Microarray Hybridization Chambers	Agilent	Agilent p/n G2530-60029
Thermal cycler with heated lid	Agilent	Agilent p/n G8800A or equivalent	Termal cycler for incubations
1.5 mL RNase-free Microfuge Tube	Ambion	p/n AM12400 or equivalent	Microcentrifuge
Magnetic stir bar	Corning	p/n 401435 or equivalent	Instrument for stirring
Qubit Fluorometer	Life Technologies	p/n Q32857	Instrument for DNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit, for use with the Qubit fluorometer	Invitrogen	p/n Q32850	Kit for Qubit fluorometer
UV-VIS spectrophotometer	Thermo Scientific	NanoDrop 8000 or 2000, or equivalent	Instrument for DNA quantification
P10, P20, P200 and P1000 pipettes	Pipetman or equivalent		DNA dispensation
Vacuum Concentrator	Thermo Scientific	p/n DNA120-115 or equivalent	Instrument to concentrate DNA
SureTag Complete DNA Labeling Kit	Agilent	p/n 5190-4240	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
Purification Columns (50 units)	Agilent	p/n 5190-3391	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
AutoScreen A, 96-well plates	GE Healthcare	p/n 25-9005-98	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
GenElute PCR Clean-Up Kit	Sigma-Aldrich	p/n NA1020	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
Human Genomic DNA		p/n G1521	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
For CGH microarrays:	Promega	(female) or p/n G1471 (male)	Array CGH control DNA
For CGH+SNP microarrays:	Coriell	p/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878, or NA18579	Array CGH control DNA
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer Kit or	Agilent	p/n 5188-5226	Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and	Agilent	p/n 5188-5221	Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2	Agilent	p/n 5188-5222	Array CGH hybridization and wash
Stabilization and Drying Solution	Agilent	p/n 5185-5979	Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit	Agilent	p/n 5188-5220 (25) or p/n 5188-5380 (100)	Array CGH hybridization and wash
Human Cot-1 DNA	Agilent	p/n 5190-3393	Array CGH hybridization and wash
Agilent C scanner	Agilent		Scanner for array CGH slides
SureSelect XT2 Reagent Kit			Kit for target enrichment
HiSeq platform (HSQ), 16 Samples	Agilent	p/n G9621A
HiSeq platform (HSQ), 96 Samples	Agilent	p/n G9621B
HiSeq platform (HSQ), 480 Samples	Agilent	p/n G9621C
MiSeq platform (MSQ), 16 Samples	Agilent	p/n G9622A
MiSeq platform (MSQ), 96 Samples	Agilent	p/n G9622B
MiSeq platform (MSQ), 480 Samples	Agilent	p/n G9622C
DNA 1000 Kit	Agilent	p/n 5067-1504	Kit for the separation, sizing and quantification of dsDNA fragments from 25 to 1000 bp.
High Sensitivity DNA Kit	Agilent	p/n 5067-4626	Kit for analysis of fragmented DNA or DNA libraries.
AMPure XP Kit			Kit for automated PCR purification.
5 mL	Agencourt	p/n A63880
60 mL	Agencourt	p/n A63881
450 mL	Agencourt	p/n A63882
Dynabeads MyOne Streptavidin T1			Isolation and handling of biotinylated nucleic acids
2 mL	Life Technologies	Cat #65601
10 mL	Life Technologies	Cat #65602
Quant-iT dsDNA BR Assay Kit, for the Qubit fluorometer			DNA quantification
100 assays, 2-1000 ng	Life Technologies	Cat #Q32850
500 assays, 2-1000 ng	Life Technologies	Cat #Q32853
Qubit assay tubes	Life Technologies	p/n Q32856	DNA quantification
SureSelec tXT2 Capture Libraries	Agilent	depending on the experiment	Kit for libraries capture
SureCycler 8800 Thermal Cycler	Agilent	p/n G8800A	DNA amplification
96 well plate module for SureCycler 8800 Thermal Cycler	Agilent	p/n G8810A	DNA amplification
SureCycler 8800-compatible 96-well plates	Agilent	p/n 410088	DNA amplification
Optical strip caps	Agilent	p/n 401425	DNA amplification
Tube cap strips, domed	Agilent	p/n 410096	DNA amplification
Compression mats	Agilent	p/n 410187	DNA amplification
2100 Bioanalyzer Laptop Bundle	Agilent	p/n G2943CA	DNA amplification
2100 Bioanalyzer Electrophoresis Set	Agilent	p/n G2947CA	DNA amplification
Covaris Sample Preparation System, E-series or S-series	Covaris		DNA shearing
Covaris sample holders		p/n 520078	DNA shearing
Nutator plate mixer	BD Diagnostics	p/n 421105 or equivalent	Plate Mixer
GaIIx	Illumina		next generation sequencing machine