Новые стратегии, сочетающей массив CGH, всего exome последовательности и в утробе матери электропорации грызунов для выявления причинных генов для пороки развития головного мозга

Резюме

Перивентрикулярной узловой heterotopia (НПГ) является наиболее распространенной формой пороки развития коры головного мозга (MCD) в зрелом возрасте, но его генетической основы остается неизвестным в наиболее спорадических случаев. Недавно мы разработали стратегию выявления роман кандидат генов для МОРС и непосредственно подтвердить их причинных роль в естественных условиях.

Аннотация

Врожденные дефекты, которые включают головного мозга — также известен как пороки развития коры головного мозга (MCD) — являются важными причинами умственной инвалидности и составляют 20-40% лекарственно-эпилепсии в детстве. Изображений с высоким разрешением мозга способствовала в естественных условиях идентификации большой группы MCD фенотипов. Несмотря на успехи в томографии головного мозга, геномного анализа и генерации животных моделей отсутствует простой рабочий процесс для систематически приоритеты кандидата генов и тестирования функциональных последствий предполагаемого мутаций. Для преодоления этой проблемы, экспериментальной стратегии, позволяющие идентифицировать Роман причинных генов для MCD разработан и проверен. Эта стратегия основана на выявления геномной регионах кандидат или генов через массив CGH или целое exome секвенирования и характеризующих последствия их инактивации или гиперэкспрессия специфических мутаций в разработке грызунов мозги через в утробе матери Электропорация. Этот подход привел к выявлению гена C6orf70 , кодирование для предполагаемого везикулярного белка, в патогенезе перивентрикулярной узловой heterotopia, МКД, вызванных дефектных миграции нейронов.

Введение

Коре играет ключевую роль в процессах когнитивных и интеллектуальной и участвует в эмоциональной регуляции, а также обучения и памяти. Поэтому не удивительно, что многие неврологические и психические заболевания в результате пороков развития коры головного мозга (MCD). Этиология MCD сложной так как приобрел и генетических факторов. Накопительное распространения генетически детерминированных доля MCD составляет около 2%, и они являются спорадические в большинстве случаев. Например распространенность врожденных мозга дисгенезия оценивается выше, чем 1% населения, и некоторые виды MCD наблюдаются в более чем 14% всех пациентов с эпилепсией и 40% тяжелой или неразрешимыми эпилепсии^{1, 2}.

Перивентрикулярной узловой Heterotopia (НПГ) является одним из наиболее распространенных MCDs и вызвано ненормальное миграции нейронов из желудочков зоны (VZ) для развивающихся коры головного мозга. Неспособность нейронов переносить результаты в кластерах heterotopic нейронов вдоль стены боковых желудочков, которые обычно могут быть визуализированы с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ). Клинико-анатомических и изображений функции НПГ неоднородны. Конкреций могут варьироваться от небольших и односторонних двусторонних и симметричный. Общие клинические осложнения включают эпилепсию и интеллектуальной инвалидностью³. Мутации в гене Filamin A (или FLNA), которая сопоставляет в Xq28, были найдены в 100% семей с Х-хромосомой двусторонних НПГ и 26% спорадических больных^3,4. Редкие, рецессивный форма НПГ, вызванных мутациями в гене ARFGEF2 , который карты в 20q13, были зарегистрированы в двух кровосмесительных семей⁵. Недавно в девяти больных, пострадавших от мультисистемной расстройство, которое включает в себя НПГ⁶было выявлено biallelic мутации генов, кодирующих рецептор лиганд Кадгерины пара DCHS1 и FAT4 . НПГ также было связано с ломкой Х синдром⁷, Уильямс синдром⁸, 22q11 микроделеций синдром⁹, дублирования 5 p 15¹⁰, удалений в 1 p 36¹¹, 5q14.3-q15¹², 6 p 25¹³ и 6q терминала исключить синдром^{14,15,16,17,18,19}, предполагая, что дополнительные причинных генов разбросаны на протяжении всего генома. Однако для примерно 74% больных спорадических НПГ генетическую основу остается проясненного¹⁷.

Классические Джин сопоставления подходы, такие, как массив Сравнительная геномная гибридизация (массив CGH) доказали, что мощные инструменты для обнаружения югу микроскопических хромосомных аномалий, однако геномные регионов, выявленных с помощью этого подхода часто большие и содержат многочисленные гены.

Появление массивной параллельной последовательности методов (то есть целое-Exome последовательности (Уэс) и целом-геном последовательности (РГ)) существенно сократить затраты и время, необходимое для последовательности всей человеческой exome или генома. Тем не менее интерпретация данных Уэс и WGS остается сложной задачей в большинстве случаев, поскольку для каждого пациента десятков до сотен (или даже тысяч, в зависимости от типа анализа) варианты выйти из фильтрации данных.

Чтобы ускорить процесс идентификации Роман MCD причинных генов, Роман систематической стратегии, сочетающей массив CGH, был разработан Уэс и в утробе матери электропорации (МСЭ) отбора кандидата генов. МСЭ позволяет выборочно отключить (или overexpress) специфических генов мутации в грызунов мозги, быстрой оценки их участия в corticogenesis^18,19. Ожидается, что при посредничестве RNAi-нокдаун или гиперэкспрессия генов одного или более кандидата вызвать, когда ген связан с развития болезни, локализованные дефекты нейронной миграции и/или созревания. После определения гена, чьи инактивация (или гиперэкспрессия) воспроизводит фенотип, наблюдается у больных грызунов она становится выдающийся кандидатом для скрининга в спорадических больных с MCD. Используя этот подход, мы недавно выявили решающий вклад гена C6orf70 (также известный как ERMARD) в патогенезе НПГ в укрывательстве 6q27 хромосомных удаления¹⁶пациентов.

протокол

Этика заявление: Крыс Вистара были вязка, поддерживается и используется в INMED животных зал, по согласованию с Европейским союзом и французского законодательства.

1. ДНК добычи и количественной оценки для массива CGH и Уэс

1. Извлечь из лейкоцитов крови человека от больных с использованием автоматизированных роботов изоляции ДНК или коммерчески доступных ручной комплекты экстракции ДНК согласно протоколу производителя геномной ДНК (геномная ДНК). Подсчитать все образцы с помощью спектрофотометра.

2. массив CGH протокол

1. Пищеварение ограничения геномная ДНК
   1. Двухместный Дайджест 500 нг очищенный геномная ДНК от пациента и коммерчески доступных человеческого контроля ДНК с RsaI и другие втечение 2 ч при 37 ° C. Используйте 0.5 мкл 10 U/мкл фермента для каждой реакции. Проинкубируйте втечение 20 мин при 65 ° C для инактивации ферментов и перемещения образца трубки для льда.
2. Образец маркировки
   1. Добавьте соответствующий объем случайных праймеров, необходимый для использования формата microarray используется для каждой пробке реакции (например 5 мкл для microarrays 1-пакет, 2-пакет и 4-пакет). Смешайте хорошо закупорить вверх и вниз осторожно.
   2. Передача образцов труб тепловая велосипедист. Инкубируйте на 95 ° C в течение 3 мин, а затем на 4 ° C за 5 мин.
   3. Подготовка одного цианиновые 3 и один цианиновые 5 маркировки Мастер микс на льду, смешивая следующие тома: 10,0 мкл 5 X буфер реакции, 5.0 мкл 10 x dNTPs, 3.0 мкл цианиновые 3-dUTP или цианиновые 5-dUTP и 1.0 мкл Exo (-) фрагменты фермента, 2.0 мкл воды, свободной от нуклеиназы. Выберите объем каждого реагента по microarray формат используется.
   4. Добавьте смесь мастер маркировки для каждой реакции трубка, содержащая геномная ДНК. Смешайте хорошо аккуратно закупорить вверх и вниз.
   5. Передать тепловая велосипедист пробоотборные трубки и инкубировать при 37 ° C 2 h, 65 ° C для 10 мин и затем сохранить образцы на 4 ° C.
3. Очистка помечены геномная ДНК
   1. Мкл 430 1 x МЭ (рН 8,0) к каждой пробке реакции.
   2. Поместить столбец очистки в 2 мл коллекции трубок и метки столбцов соответствующим образом. Нагрузки каждого помечены геномная ДНК на столбец очистки.
   3. Центрифуги для 10 мин на 14 000 x g в microcentrifuge при комнатной температуре. Отказаться от потока через и поместить столбец обратно в 2-мл пробирку коллекции.
   4. 480 мкл 1 x TE (рН 8,0), для каждого столбца. Центрифуги для 10 мин на 14 000 x g в microcentrifuge при комнатной температуре. Отказаться от потока через.
   5. Инвертируйте столбца в коллекции свежий 2-мл пробирку и центрифуги за 1 мин на 1000 x g в microcentrifuge при комнатной температуре для сбора очищенной образца.
   6. Довести объем образца для запрошенной microarray формата используется с помощью концентратора или добавление 1 x TE (рН 8,0). Например для 1-Пак microarray доводят объем до 80.5 мкл. инкубации образца на льду на 5 мин и затем Пипетка решение вверх и вниз по 10 раз.
4. Подготовка помечены геномная ДНК гибридизации
   1. Совместить тест и ссылки образцы, используя соответствующие цианиновые 5-меченых образца и цианиновые 3-меченых образца в трубке свежие 1,5 мл, RNase бесплатно. Например для 1-Пак microarray обеспечить окончательный объем является 158 мкл. Выберите объем каждого образца в формате microarray дна в использовании.
   2. Используйте спектрофотометр для измерения доходности, степень маркировки или конкретных активности путем измерения оптической плотности в A260 Нм (ДНК), A550 Нм (цианиновые 3) и A650 Нм (цианиновые 5).
      1. Вычислить доходность по формуле: [ДНК concentration(ng/µl) x объем образца (мкл)] / 1000 (нг/мкг). Расчет удельной активности с использованием формулы: пмоль за мкл краска/мкг на мкл геномная ДНК.
         Примечание: например, для 0,5 мкг ввода ДНК, выход должен быть 8-11 мкг и удельная активность (пмоль/мкг) должна быть 25-40 для цианиновые-3 помечены образца и 20-35 для маркированных образца цианиновые-5.
   3. Подготовить количество гибридизации Мастер микс, необходимый для использования формата microarray используется смесь следующих реагентов: 50 мкл Cot-1 ДНК (1,0 мг/мл), 52 мкл 10 x aCGH блокирование агента и 260 мкл 2 x HI-RPM гибридизации буфера.
   4. Добавьте соответствующие объемы гибридизации Мастер микс труба 1,5 мл, RNase бесплатно, содержащий помечены геномная ДНК для получения общего объема для microarray формата используется. Например 1 пачка microarray дна, убедитесь, что конечный объем для каждой реакции 362 мкл.
   5. Смешать образца, закупорить вверх и вниз, а затем быстро центрифуг в 14.000 x g и Инкубируйте 3 мин при 95 ° C и при 37 ° C за 30 мин.
5. Палаты собрания и гибридизации
   1. Загрузите чистой прокладка слайд в камере базу с прокладка этикеткой вверх и согласованы с прямоугольного сечения камеры базы. Обеспечить, чтобы слайд прокладку заподлицо с базой камеры и не приоткрытой.
   2. Отказаться от гибридизации образца смесь на прокладку колодец, убедившись, что образец равномерно распределены.
   3. Положите microarray слайд на слайд прокладку, оценке что сэндвич пара правильно выровнен. Затем соберите реакционной камере положить крышку на слоеное слайды и ручной затяжки зажима.
   4. Обеспечить слайды, смачивание, поворачивая зале собраны по вертикали. Убедитесь, что пузыри не присутствует в зале. При необходимости нажмите Ассамблеи на твердой поверхности для перемещения стационарных пузыри.
   5. Положите в собранном виде слайд камеры в ротатор стойку для поворота на 20 об/мин. Поставьте камеру гибридизации в духовке и выполнить гибридизации при 65 ° C для 24-40 h согласно microarray формат используется.
6. Microarray мытья и сканирование
   1. Гибридизации камеры из печи и погрузите его в мыть буфера 1. Перейти к его разборки.
   2. Удалить слайд microarray и быстро положил его в стойку слайд в буфере 1 мыть при комнатной температуре.
   3. Вымойте массива слайд 5 мин с перемешивания (используйте блох и магнитной мешалкой). Регулировать скорость мешалки параметру 4 (средняя скорость), чтобы получить хорошее, но не слишком энергичные смешения.
   4. Вымойте слайд массива в буфере 2 мыть для 90 s перемешивания. Аккуратно восстановить слайд из буфера (она должна выйти сухой) и загрузить его в слайд держатель с помощью слайд-протектор.
   5. Загрузить слайд в массив сканера и выполнять сканирование согласно инструкциям производителя массива.
   6. Анализировать результаты, используя программное обеспечение извлечения с сканера используются согласно инструкции производителя (V.9.1.3.1).

3. Уэс протокол

1. Обогащение целевой
   1. Для определения концентрации геномная ДНК образца согласно протоколу инструмент используйте dsDNA BR Assay.
   2. Разбавьте 5 мкг высокое качество двойной нити ДНК с 1 x температура TE буфер в трубке низкий связывать 1,5 мл в суммарный объем 50 мкл.
   3. Настройка sonicator и положить Микропробирка станцию погрузки и разгрузки согласно инструкции производителя. Держите крышку на трубе.
   4. Медленно передачи образцов ДНК 50 мкл через предварительно разделенное перегородками без введения пузыри.
   5. Сдвига ДНК в соответствии с параметрами, предложил от производителя sonicator и оценить качество, с использованием Bioanalyzer согласно инструкции производителя. Целевой размер фрагментов ДНК-150-200 bp.
2. Заканчивается ремонт ДНК
   1. Подготовка конце ремонта реакция смеси путем смешивания 40 мкл конце ремонта фермент смесь с 10 мкл конце ремонта Oligo смеси. Смесь хорошо на вихревой смеситель.
   2. Проинкубируйте образцы при 20 ° C на 30 мин в тепловая велосипедист и затем, удерживая их на 4 ° C. Не пользуйтесь крышкой с подогревом.
   3. Добавьте 50 мкл конце ремонта реакция смеси подготовлен на шаге 3.2.1 каждый 50 мкл стриженый, образец ДНК хорошо. Смесь хорошо закупорить вверх и вниз или нежные vortexing.
   4. Очищение образца с комплектом очистки бусы на основе согласно протоколу производителя.
3. Сплайсингу 3' концы.
   1. 20 мкл Mix мастер да хвостохранилища, в каждый конец отремонтированы, очищенная ДНК образца (примерно 20 мкл).
   2. Смесь хорошо закупорить вверх и вниз или нежные vortexing.
   3. Проинкубируйте образцы при 37 ° C в тепловая велосипедист и затем, удерживая его на 4 ° C. Не пользуйтесь крышкой с подогревом.
4. Лигирование индексации адаптер до захвата.
   1. 5 мкл лигирование Master Mix, для каждого образца A-белохвост ДНК.
   2. 5 мкл соответствующего решения индекс до захвата, для каждого образца.
   3. Уплотнение скважин и тщательно перемешать, vortexing для 5 s. кратко центрифуги образцы.
   4. Проинкубируйте образцы при 20 ° C 15 мин в тепловая велосипедист и затем провести на 4 ° C. Не пользуйтесь крышкой с подогревом.
   5. Очищайте образцы с комплектом очистки бусы на основе согласно протоколу производителя.
5. Усиление индексированного библиотеки.
   1. Подготовьте соответствующий объем смеси реакции PCR до захвата, смешивая 1 мкл смеси праймера и 25 мкл ПЦР Мастер микс. Смесь хорошо на вихревой смеситель.
   2. Объединить 26 мкл амплификации смеси в отдельных скважинах ПЦР плиты и 24 мкл каждого образца библиотеки индексированных геномная ДНК.
   3. Запустить программу ПЦР с следующими шагами: 98 ° C на 2 мин, 5 циклов на 98 ° C за 30 сек, 60 ° C за 30 s и 72 ° C за 1 мин и окончательное расширение при 72 ° C для 10 min. удерживайте образцов при 4 ° C.
   4. Очищение образца с комплектом очистки бусы на основе согласно протоколу производителя.
   5. Оцените качество с Bioanalyzer согласно протоколу производителя.
6. Объединение индексированного образцов ДНК для гибридизации
   1. Для каждого пула реакции захвата объединять соответствующий объем каждого образца библиотеки индексированных геномная ДНК в одной скважиной ПЦР-планшете. Например, для человека или библиотек захвата мыши все-экзона, объединить 8 библиотек в пул с помощью 187,5 нг каждого индексированного библиотеки. Убедитесь, что каждый пул реакции окончательного захвата содержит 1500 нг индексированных геномная ДНК.
   2. Уменьшить объем в каждом хорошо < 7 мкл, с помощью вакуума концентратор. Избегайте полностью сушка образца.
   3. Добавьте достаточно воды, свободной от нуклеиназы каждый пул концентрированной геномная ДНК довести окончательный объем хорошо до 7 мкл и затем вихревой пластину, содержащие геномная ДНК энергично за 30 с. Центрифуга в центрифуге или мини-плита spinner для сбора жидкости в нижней части скважины.
7. Гибридизация геномная ДНК библиотека пулов для захвата библиотеки
   1. Каждый пул геномная ДНК 7 мкл индексируются мкл 9 блокирования микс. Пипетка вверх и вниз, чтобы смешать.
   2. Крышки колодцев, передачи запечатанном пластины, содержащие геномная ДНК к тепловая велосипедист и Инкубируйте на 95 ° C за 5 минут, а затем провести его на 65 ° C. Убедитесь, что пластины проводится при 65 ° C для по крайней мере 5 минут.
   3. Подготовить соответствующие разрежения РНКазы блока, на основе размера библиотеки захвата (10% раствора для библиотек < 3.0 МБ и 25% разрежения для библиотек > 3.0 МБ).
   4. Размерам захватить библиотека объединить необходимое количество захвата библиотеки и разбавить раствор РНКазы блока в ПЦР-планшете, хранится на льду. Смешайте хорошо закупорить. Для захвата библиотек < 3.0 МБ, используйте 2 мкл библиотеки и 5 мкл РНКазы блока на 10% разрежения. Для захвата библиотек > 3,0 МБ, использование 5 мкл библиотеки и 2 мкл РНКазы блока на 25% разрежения.
   5. Мкл 37 гибридизации буфера для каждой скважины, содержащий 7 мкл захвата блока библиотеки/РНКазы смеси. Смесь хорошо закупорить и кратко центрифуга пластину, содержащие смеси.
   6. Поддерживать пластину бассейн геномная ДНК при 65 ° C при использовании многоканальных дозаторов для передачи всего 44 мкл захвата библиотека смеси от шага 3.7.5 для каждого образца также пластину бассейн геномная ДНК. Смешайте хорошо закупорить медленно вверх и вниз по 8-10 раз.
   7. Уплотнение скважин с куполом газа шапки. Убедитесь, что все скважины полностью опечатаны. Поместите циновку сжатия пластины ПЦР в тепловая велосипедист.
   8. Инкубировать гибридизации смесь для 24 h на 65 ° C. Примечание: Образцы могут быть гибридизированных до 72 часов, но необходимо убедиться, что расширенная гибридизации не вызывает обширные испарения в скважинах образца.
8. Подготовка стрептавидина покрытием магнитные бусы
   1. Prewarm мыть буфера 2 при 65 ° C в блоке водой ванну или тепла.
   2. Энергично Ресуспензируйте стрептавидина магнитные бусы на вихревой смеситель. Магнитные бусы поселиться во время хранения.
   3. Для каждого образца гибридизации 50 мкл ресуспензированы бусы из скважин ПЦР-планшете.
   4. Вымойте бисер и Ресуспензируйте их в 200 мкл буфера привязки.
9. Захват гибридизированные ДНК с помощью стрептавидина бусины.
   1. Оценить и фиксируют объем гибридизации решения, которое остается после 24 ч инкубации.
   2. Поддерживать пластину гибридизации при 65 ° C и использовать многоканальные пипетки для передачи всего тома (примерно 60 мкл) каждого гибридизации смеси лунках, содержащие 200 мкл промывают стрептавидина бусины. Смешайте хорошо закупорить медленно вверх и вниз по 3-5 раз.
   3. Крышки колодцев и инкубировать захвата плиты на Nutator смесителя или эквивалент для 30 мин при комнатной температуре. Убедитесь, что образцы правильно смешивания в скважинах.
   4. Кратко центрифуга захвата пластины в центрифуге или мини-плита spinner.
   5. Положите пластину захвата в магнитный сепаратор для сбора бисер от приостановки. Снимите и выбросьте супернатант.
   6. Ресуспензируйте бисер в 200 мкл мыть буфера 1. Смешайте закупорить вверх и вниз до тех пор, пока бисер полностью высокомобильна.
   7. Кратко центрифуги в центрифуге или мини-плита spinner.
   8. Установите пластину в магнитный сепаратор.
   9. Ждать решение очистить, затем удалить и удалить супернатант.
10. После захвата образец обработки мультиплексированные последовательности
    1. Подготовить соответствующий объем реакционной смеси ПЦР, смешивая следующее: 9 мкл нуклеиназы свободной воды, 25 мкл Мастер микс и 1 мкл грунт смешать зависимости количества амплификации. Смеси хорошо с помощью вихревой смеситель и держать на льду.
    2. Для каждой реакции амплификации место 35 мкл реакционной смеси ПЦР из шага 3.10.1 в скважинах ПЦР-планшете.
    3. Пипетка каждого из бисера прыгните захваченных библиотека бассейн образцов вверх и вниз, чтобы обеспечить однородное подвески из бисера.
    4. Добавьте 15 мкл каждого подвески из бисера бассейн захваченных библиотеки в соответствующие смеси реакции PCR хорошо. Тщательно перемешать, дозирование до тех пор, пока шарик подвеска является однородной.
    5. Место пластину, подготовленных в точке 3.10.2 в тепловая велосипедист и запустите следующую программу амплификации PCR: 98 ° С в течение 2 мин., 8-11 циклов на 98 ° C за 30 с, 60 ° C 30 s и 72 ° C в течение 1 мин, затем окончательное расширение при 72 ° C для 10 мин. Держите образцов при 4 ° C.
    6. Очищение образца с бисер на основе очистки согласно протоколу производителя.
    7. Оцените качество с Bioanalyzer согласно протоколу производителя.
11. Подготовка образцов для мультиплексированных виртуализации
    Примечание: Окончательный обогащенного образцы содержат бассейны 8 или 16 индексированных библиотек, основано на размере захватить библиотеки и в результате до захвата, объединение стратегии. Общее количество индексированных библиотек, которые могут быть мультиплексируются в одной последовательности Лейн определяется выходной характеристики платформы используется вместе с количеством последовательности данных, необходимых для захвата библиотеки.
    1. Рассчитайте количество индексов, которые могут быть объединены в одну полосу движения, по словам возможностей платформы. Общее количество индексированных библиотек, которые могут быть мультиплексируются в одной последовательности Лейн определяется выходной характеристики платформы используется вместе с количеством последовательности данных, необходимых для захвата библиотеки. Например для человека все экзона v5 библиотеки, рекомендовал виртуализации данных каждой индексации библиотеки составляет 4 ГБ и рекомендовал виртуализации данных пулу до захвата 32 ГБ (8-индекс бассейны).
12. Последовательность библиотек.
    1. Загрузка библиотек на платформе виртуализации следующего поколения выбора и выполнить последовательность запуска согласно спецификации инструмента.
13. Анализ exome последовательности данных.
    1. Запуск конвейера и программное обеспечение выбора для базового вызова. Например используйте Stampy для сопоставления считывает²⁰, удалить дубликаты с Пикар (http://broadinstitute.github.io/picard/) и определения единичных нуклеотидных полиморфизмов и вставки или удаления баз (indels) с утконоса²¹. Фильтр синонимом вариантов и теми, которые наблюдались в частота аллеля < 5% и сравнения данных с теми, кто из родителей exomes для определения вариантов de novo .

4. плазмида ДНК подготовка для электропорации в утробе матери

1. Дизайн несколько коротких шпильки РНК (процессируются) ориентации кодирующая последовательность или 3' УТР кандидат генов, как было описано ранее²².
2. Чтобы предотвратить створ эффекты проверить процессируются специфика взрыв Поиск баз данных с использованием стандартных методов. Исключите процессируются отображение более чем 50% взаимодополняемости с другими генами крыса.
3. Клон отожженная олигонуклеотиды в mU6-про вектор как описано ранее,²³.
4. Очистить плазмидной ДНК с макси prep согласно инструкции производителя и сделать окончательный концентрации 3 мкг/мкл.
5. Аликвота 20 мкл ДНК (0.5 мг/мл pCAGGS-GFP либо самостоятельно или с 1,5 мг/мл индуцируемый построить) и 2 мкл быстро зеленый краситель (2 мг/мл) для обеспечения визуального контроля впрыска.

5. в утробе матери Электропорация

1. Хирургическая процедура
   1. Анестезировать E15.5 беременных самок крыс (E0 был определен как днем подтверждения Вагинальные вилка спермы позитивных), используя комбинацию с смесь кетамина/Ксилазина (0.1 и 0,01 мг на тело вес, соответственно), которая предоставляется через внутрибрюшинного инъекции для индукции анестезии.
   2. Убедитесь, что животное находится полностью под наркозом, наблюдая за исчезновение мыс щепотку рефлекс.
   3. Бритье животных в нижней части живота с помощью машинки для удаления шерсти. Дезинфекция кожи с помощью скрабов повидон йода и 70% спирта. Примените мазь ветеринар на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
   4. Поместите животное на источник тепла и положить стерильные драпировки (с открытым окном в середине 4-5 см) на сайте разрез. Носите маски, лаборатории пальто, шапки и перчатки стерильные хирургические. Поддерживать стерильность до конца операции.
   5. С помощью острых ножниц сделать вертикальный разрез (2-2,5 см) в кожу вдоль средней линии в хвостовой части живота и затем сделать разрез стены мышц под кожу — также от 2,5 см — вдоль средней линии.
   6. Тщательно предоставляют один рога матки из брюшной полости. Падение 37 ° C подогретым нормальный физиологический раствор для увлажнения эмбрионов. Держите матки влажные все время.
2. Инъекции ДНК и Электропорация
   1. Аккуратно прижмите один из маточные рожки кольчатой пинцетом и аккуратно протолкните одного эмбриона в стенку матки. Держите эмбриона в одной руке и с другой стороны вставки тщательно стеклянные капилляры 1 мм от средней линии в левый боковой желудочек (2-3 мм в глубину) и придать примерно в 1 мкл ДНК с быстро зеленый возможность визуального контроля с помощью инъекций microinjector.
   2. Падение нормальный физиологический раствор на поверхности электродов² 3 x 7 мм. Место позитивные стерильные электрода на введенный стороне (левый боковой желудочек) и негативные стерильные электрода на правый желудочек. Доставить 5 электрические импульсы интервалы 950 ms с контролируемой ног педалью (4000 mF конденсатор взимается 40 V с electroporator).
3. Электропорация процедуры POST
   1. Положить обратно маточные рожки брюшной полости, добавить капель нормального физиологического раствора в полость позволить эмбрионов, расположены более естественно и приходится интраоперационной потери жидкости.
   2. Закройте мышц брюшной стены с рассасывающиеся хирургические шовные материалы, затем кожи с помощью простой прервана стежком.
   3. Положите крысу обратно к клетке и контролировать животное до тех пор, пока он возникает от анестезии.
   4. Для управления боли бупренорфин (0,03 мг/кг) для животного по администрированию подкожной инъекции каждые 8-12 ч, до 48 ч.

6. мозг пробоподготовки

1. Метод крепления
   1. Пожертвуйте беременных крыс через 5 дней после хирургической процедуры, с помощью газа анестезии (изофлюрановая) следуют быстро шейки матки дислокации.
   2. Сделайте вертикальный разрез вновь открыть брюшной полости.
   3. Разоблачить маточные рожки, удалить из матки эмбрионы и обезглавить их с помощью острых ножниц.
   4. Удаление мозга с минимальным ущербом для ткани: с помощью острых ножниц, сделать небольшой надрез вдоль задней (мозжечка) / Передняя (olfactive луковицы) оси головы для прокалывания кожи и черепа, затем с помощью пары щипцы удаляйте череп подвергать мозг и удалить его с помощью небольшой лопаткой.
   5. Погружать мозги на ночь при 4 ° C в 4% параформальдегида в 1 x Buffered фосфатный (PBS).
2. Мозг секционирование
   1. Промойте мозги в однократном ПБС втечение 10 мин.
   2. Внедрите мозги в 4% агар в пластик, встраивание формы.
      1. Подготовка 50 мл 4% агара в 1 x PBS для встраивания 5 эмбриональных мозги. Убедитесь, что растворенной агарозы находится не более чем на 50 ° C.
   3. Держите мозги в агарозы для полимеризации для по крайней мере 1 час при 4° C. Удалите избыток агарозы вокруг мозга.
   4. Клей мозг vibratome основание, ориентированные так передней/задней оси мозга перпендикулярно лопасти. Подождите несколько минут для клея для сухой и место пластину с клееный мозга в vibratome камеру.
   5. Заполните vibratome с ПБС. Нарежьте 100 µm толщиной секций.
   6. Передача срезы мозга на слайдах, удалить лишнюю жидкость, добавьте несколько капель монтажа средних и место coverslip на вершине мозги

7. конфокальная томография и количественный анализ

1. Пусть монтажа полусухое ночь перед изображений. Изображения разделы в 10 X на сканирование лазерного конфокального микроскопа.
2. С помощью программного обеспечения для анализа количественных изображений, конвертировать изображения в 8-разрядный, выберите один представитель GFP позитивные люминесцентные клеток и вручную определить свою форму. Чтобы сделать это, нажмите на «Оценки» и нарисуйте границы ячейки, используя инструмент freehand выделения. В этом путь диаметр и интенсивности порог ячейки автоматически сохраняются от программного обеспечения.
3. Нажмите на «Найти клетки» позволяет программное обеспечение для локализации transfected клеток по всему коры. Затем при необходимости, вручную удалите ложных срабатываний.
4. Разделите весь толщина коры в 8 областях, представляющих интерес, нормализованы в отдельных разделах. Для достижения этой цели, нажмите на «Регион инструмент», где выберите 8 «регион полосы» (1) первый и последний (8) полосы соответствуют VZ и верхней части CP соответственно. Нажмите на «Применить», чтобы позволить программное обеспечение подсчитать относительное положение GFP transfected клеток в целом коры. Наконец, нажмите на «Сохранить количественной», чтобы экспортировать данные в файле Excel для анализа.

Результаты

Экспериментальной стратегии, призванной определить Роман MCD причинных генов изъятый в рисунке 1.

Выполняя массив CGH в когорте 155 пациентов с аномалиями развития мозга, переменно объединения НПГ (рисунок 2A), дисгенезия ?...

Обсуждение

Морс являются важными причинами умственной инвалидности и составляют 20-40% лекарственно-детства эпилепсии^1,2. Интерес к MCDs резко возросло за последнее десятилетие в результате два основных фактора. Во-первых, улучшение в мозга, томография (особенно МРТ), ко...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Picospritzer III	Parker Hannifin Corp	P/N 051-0500-900	Intracellular Microinjection Dispense Systems
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252	Fast green allow visual monitoring of the injection
BTX ECM 830 electroporator	BTX Harvard Apparatus	45-0002	The ECM 830 is a Square Wave Pulse generator designed for in vitro and in vivo applications
Microtome HM 650 V	Microm	10076838	Microtome HM 650 V vibratome 240V 50/60Hz with vibrating blade
FluoView 300	Olympus		The Olympus FluoViewTM 300 is a point-scanning, point-detection, confocal laser scanning microscope designed for biology research application
eCELLence software	Glance Vision Technologies		eCELLence is software designed for the quantitive analysis of cell migration
Agilent Microarray Scanner Bundle			Array slides
for 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K or 8 x 15K	Agilent	Agilent p/n G4900DA, G2565CA or G2565BA
for 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K or 8 x 60K	Agilent	Agilent p/n G4900DA or G2565CA
Hybridization Chamber, stainless	Agilent	Agilent p/n G2534A	Chamber for array CGH hybridization
Hybridization Chamber gasket slides, 5-pack			Gasket for array CGH hybridization
for 1-pack microarrays or	Agilent	Agilent p/n G2534-60003
for 2-pack microarrays or	Agilent	Agilent p/n G2534-60002
for 4-pack microarrays or	Agilent	Agilent p/n G2534-60011
for 8-pack microarrays	Agilent	Agilent p/n G2534-60014
Hybridization oven	Agilent	Agilent p/n G2545A
Hybridization oven rotator for Agilent Microarray Hybridization Chambers	Agilent	Agilent p/n G2530-60029
Thermal cycler with heated lid	Agilent	Agilent p/n G8800A or equivalent	Termal cycler for incubations
1.5 mL RNase-free Microfuge Tube	Ambion	p/n AM12400 or equivalent	Microcentrifuge
Magnetic stir bar	Corning	p/n 401435 or equivalent	Instrument for stirring
Qubit Fluorometer	Life Technologies	p/n Q32857	Instrument for DNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit, for use with the Qubit fluorometer	Invitrogen	p/n Q32850	Kit for Qubit fluorometer
UV-VIS spectrophotometer	Thermo Scientific	NanoDrop 8000 or 2000, or equivalent	Instrument for DNA quantification
P10, P20, P200 and P1000 pipettes	Pipetman or equivalent		DNA dispensation
Vacuum Concentrator	Thermo Scientific	p/n DNA120-115 or equivalent	Instrument to concentrate DNA
SureTag Complete DNA Labeling Kit	Agilent	p/n 5190-4240	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
Purification Columns (50 units)	Agilent	p/n 5190-3391	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
AutoScreen A, 96-well plates	GE Healthcare	p/n 25-9005-98	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
GenElute PCR Clean-Up Kit	Sigma-Aldrich	p/n NA1020	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
Human Genomic DNA		p/n G1521	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
For CGH microarrays:	Promega	(female) or p/n G1471 (male)	Array CGH control DNA
For CGH+SNP microarrays:	Coriell	p/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878, or NA18579	Array CGH control DNA
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer Kit or	Agilent	p/n 5188-5226	Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and	Agilent	p/n 5188-5221	Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2	Agilent	p/n 5188-5222	Array CGH hybridization and wash
Stabilization and Drying Solution	Agilent	p/n 5185-5979	Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit	Agilent	p/n 5188-5220 (25) or p/n 5188-5380 (100)	Array CGH hybridization and wash
Human Cot-1 DNA	Agilent	p/n 5190-3393	Array CGH hybridization and wash
Agilent C scanner	Agilent		Scanner for array CGH slides
SureSelect XT2 Reagent Kit			Kit for target enrichment
HiSeq platform (HSQ), 16 Samples	Agilent	p/n G9621A
HiSeq platform (HSQ), 96 Samples	Agilent	p/n G9621B
HiSeq platform (HSQ), 480 Samples	Agilent	p/n G9621C
MiSeq platform (MSQ), 16 Samples	Agilent	p/n G9622A
MiSeq platform (MSQ), 96 Samples	Agilent	p/n G9622B
MiSeq platform (MSQ), 480 Samples	Agilent	p/n G9622C
DNA 1000 Kit	Agilent	p/n 5067-1504	Kit for the separation, sizing and quantification of dsDNA fragments from 25 to 1000 bp.
High Sensitivity DNA Kit	Agilent	p/n 5067-4626	Kit for analysis of fragmented DNA or DNA libraries.
AMPure XP Kit			Kit for automated PCR purification.
5 mL	Agencourt	p/n A63880
60 mL	Agencourt	p/n A63881
450 mL	Agencourt	p/n A63882
Dynabeads MyOne Streptavidin T1			Isolation and handling of biotinylated nucleic acids
2 mL	Life Technologies	Cat #65601
10 mL	Life Technologies	Cat #65602
Quant-iT dsDNA BR Assay Kit, for the Qubit fluorometer			DNA quantification
100 assays, 2-1000 ng	Life Technologies	Cat #Q32850
500 assays, 2-1000 ng	Life Technologies	Cat #Q32853
Qubit assay tubes	Life Technologies	p/n Q32856	DNA quantification
SureSelec tXT2 Capture Libraries	Agilent	depending on the experiment	Kit for libraries capture
SureCycler 8800 Thermal Cycler	Agilent	p/n G8800A	DNA amplification
96 well plate module for SureCycler 8800 Thermal Cycler	Agilent	p/n G8810A	DNA amplification
SureCycler 8800-compatible 96-well plates	Agilent	p/n 410088	DNA amplification
Optical strip caps	Agilent	p/n 401425	DNA amplification
Tube cap strips, domed	Agilent	p/n 410096	DNA amplification
Compression mats	Agilent	p/n 410187	DNA amplification
2100 Bioanalyzer Laptop Bundle	Agilent	p/n G2943CA	DNA amplification
2100 Bioanalyzer Electrophoresis Set	Agilent	p/n G2947CA	DNA amplification
Covaris Sample Preparation System, E-series or S-series	Covaris		DNA shearing
Covaris sample holders		p/n 520078	DNA shearing
Nutator plate mixer	BD Diagnostics	p/n 421105 or equivalent	Plate Mixer
GaIIx	Illumina		next generation sequencing machine