Uma nova estratégia combinando Array-CGH, todo-exome sequenciamento e eletroporação no Utero em roedores para identificar Genes causadores de malformações do cérebro

Resumo

Periventricular nodular heterotopia (PNH) é a forma mais comum de malformação do desenvolvimento cortical (MCD) na idade adulta, mas sua base genética permanece desconhecida em casos mais esporádicos. Recentemente desenvolvemos uma estratégia para identificar genes candidatos romance para MCDs e confirmar diretamente seu papel causal em vivo.

Resumo

Defeitos de nascença que envolvem o córtex cerebral — também conhecido como malformações do desenvolvimento cortical (MCD) — são causas importantes de incapacidade intelectual e conta para 20-40% de epilepsia resistentes na infância. Imagens do cérebro de alta resolução tem facilitado a identificação no vivo de um grande grupo de fenótipos MCD. Apesar dos avanços em imagens do cérebro, análise genômica e geração de modelos animais, um fluxo de trabalho simples para priorizar sistematicamente genes candidatos e para testar os efeitos funcionais de mutações putativos está faltando. Para superar este problema, uma estratégia experimental, permitindo a identificação de novos genes causadores de MCD foi desenvolvida e validada. Esta estratégia baseia-se identificando as regiões genômicas candidato ou genes via matriz-CGH ou todo-exome sequenciamento e caracterizar os efeitos de sua inativação ou de superexpressão de mutações específicas no desenvolvimento de cérebros de roedores através de in utero eletroporação. Essa abordagem levou à identificação do gene C6orf70 , codificação para uma proteína vesicular putativa, a patogênese da heterotopia nodular periventricular, um MCD causada pela migração neuronal defeituosa.

Introdução

O córtex cerebral desempenha um papel fundamental nos processos cognitivos e intelectuais e está envolvido no controle emocional, bem como a aprendizagem e a memória. Portanto não é surpreendente que muitas doenças neurológicas e psiquiátricas resultam malformações do desenvolvimento cortical (MCD). A etiologia da MCD é complexa desde ambos adquiridos e fatores genéticos estão envolvidos. A prevalência cumulativa da geneticamente determinada proporção de MCD é cerca de 2% e eles são esporádicos, na maioria dos casos. Por exemplo, a incidência de disgenesia cerebral congênita foi estimada para ser superior a 1% na população humana, e algumas formas de MCD são observadas em mais de 14% de todos os pacientes com epilepsia e em 40% de epilepsia grave ou intratável^{1, 2}.

Heterotopia Nodular periventricular (PNH) é um da MCDs mais comum e é causada pela migração anormal dos neurônios da zona ventricular (VZ) para o córtex cerebral em desenvolvimento. O fracasso dos neurônios para migrar resultados em agrupamentos de neurônios heterotópico ao longo das paredes dos ventrículos laterais que geralmente podem ser visualizadas usando ressonância magnética (MRI). As características clínicas, anatômicas e da imagem latente da PNH são heterogêneas. Nódulos podem variar de pequenas e unilateral bilateral e simétrica. Sequelas clínicas comuns incluem deficiência de epilepsia e intelectual³. Mutações no gene Fblim1 A (ou FLNA), que mapeia em Xq28, foram encontradas em 100% das famílias com X-lig bilateral hemoglobinúria paroxística noturna e em 26% dos pacientes esporádicos^3,4. Uma forma recessiva rara de hemoglobinúria paroxística noturna, causada por mutações no gene ARFGEF2 , que mapeia no 20q13, tem sido relatada em duas famílias consanguíneos⁵. Recentemente, foram identificadas em nove pacientes afetados por uma doença multissistêmica que inclui PNH⁶biallelic mutações em genes que codificam o par de caderina ligante-receptor, DCHS1 e FAT4 . Hemoglobinúria paroxística noturna também tem sido associada com frágil X síndrome⁷, síndrome de Williams⁸, 22q11 microdeletion síndrome⁹, duplicações no 5 p 15¹⁰, as exclusões na 1 p 36-¹¹5q14.3-q15¹², 6 p. 25¹³ e 6q terminal exclusão síndrome^{14,15,16,17,18,19}, sugerindo que os genes causadores adicionais estão espalhados ao longo do genoma. No entanto, para cerca de 74% dos pacientes de HPN esporádicos a base genética continua a ser elucidado¹⁷.

Mapeamento do gene clássica se aproxima como matriz Comparative Genomic Hybridization (CGH-matriz) provaram para ser ferramentas poderosas para a detecção de sub microscópicas anormalidades cromossômicas, no entanto, as regiões genômicas identificadas usando essa abordagem são muitas vezes grandes e contêm inúmeros genes.

O advento das técnicas de sequenciamento paralelo maciço (ou seja, todo-Exome sequenciamento (WES) e do inteiro-genoma sequenciamento (WGS)) reduziu substancialmente tanto o custo e o tempo necessário para sequenciar um inteiro exome humano ou genoma. No entanto, interpretação dos dados de WES e WGS permanece desafiador na maioria dos casos, desde para variantes cada paciente dezenas a centenas (ou mesmo milhares, dependendo do tipo de análise) emergem de filtragem de dados.

Para acelerar o processo de identificação de novos genes causadores de MCD, uma estratégia sistemática romance combinando matriz-CGH, destinava-se a triagem de eletroporação (IUE) WES e no utero de genes candidatos. IUE permite desativar seletivamente (ou overexpress) os genes específicos ou mutações no cérebro de roedor, permitindo uma avaliação rápida do seu envolvimento em corticogenesis^18,19. RNAi mediada-nocaute ou superexpressão de genes de um ou mais candidatos deverá causar, quando o gene é associado com o desenvolvimento da doença, defeitos localizados na migração neuronal e/ou maturação. Após a identificação de um gene cuja inativação (ou superexpressão) reproduz o fenótipo observado em pacientes em roedores, torna-se um excelente candidato para o rastreio em pacientes esporádicos com MCD. Usando essa abordagem, recentemente revelou a contribuição fundamental do gene C6orf70 (também conhecido como ERMARD) na patogênese de hemoglobinúria paroxística noturna em pacientes abrigar 6q27 deleções cromossômicas¹⁶.

Protocolo

Declaração de ética: Ratos Wistar foram acasalados, mantidos e utilizados nas instalações de animais INMED, de acordo com a legislação da União Europeia e o francês.

1. DNA extração e quantificação de Array-CGH e WES

1. Extrai DNA genômico (gDNA) de leucócitos do sangue humano de pacientes usando um robô automatizado de isolamento de DNA ou comercialmente disponíveis kits manuais de extração de DNA de acordo com o protocolo do fabricante. Quantificar todas as amostras utilizando um espectrofotômetro.

2. array-CGH protocolo

1. Digestão da limitação de gDNA
   1. Dobro de digerir 500 ng de gDNA purificado de um paciente e um controle humano disponível comercialmente DNA com RsaI e AluI durante 2 h a 37 ° C. Uso 0,5 μl da enzima de U/μL 10 para cada reação. Incube durante 20 min a 65 ° C para inativar as enzimas e mover os tubos de amostra de gelo.
2. Rotulagem de amostra
   1. Adicione o volume apropriado de Primers aleatórios, necessária para o formato de microarray em uso para cada tubo de reação (por exemplo, 5 µ l para microarrays 1-pack, pack-2 e 4-pack). Misture bem por pipetagem para cima e para baixo suavemente.
   2. Transferi os tubos de amostra para um termociclador. Incube a 95 ° C por 3 min e, em seguida, a 4 ° C por 5 min.
   3. Preparar um cianina cianina 3 e um 5 rotulagem Master Mix no gelo, misturando os seguintes volumes: 10,0 µ l 5 X amortecedor da reação, 5,0 µ l 10 x dNTPs, 3,0 µ l cianina 3-dUTP ou cianina 5-dUTP e 1,0 µ l Exo (-) da enzima Klenow, 2,0 µ l água livre de Nuclease. Escolha o volume de cada reagente de acordo com o formato de microarray em uso.
   4. Adicione a mistura de mestre de rotulagem para cada tubo de reação contendo o gDNA. Misture bem delicadamente pipetagem para cima e para baixo.
   5. Transferir os tubos de amostra para um termociclador e incubar a 37 ° C por 2 h, 65 ° C durante 10 minutos e em seguida, manter as amostras em 4 ° C.
3. Purificação de gDNA rotulado
   1. Adicione 430 µ l de 1 x TE (pH 8.0) para cada tubo de reação.
   2. Colocar uma coluna de purificação em tubos de colheita de 2ml e rotular as colunas apropriadamente. Carrega cada gDNA rotulado em uma coluna de purificação.
   3. Centrifugar durante 10 minutos a 14.000 g x numa microcentrifuga à temperatura ambiente. Descartar o escoamento e colocar a coluna de volta no tubo de coleta de 2 ml.
   4. Adicione 480 µ l de 1 x TE (pH 8.0) para cada coluna. Centrifugar durante 10 minutos a 14.000 g x numa microcentrifuga à temperatura ambiente. Descarte o escoamento.
   5. Inverta a coluna em um tubo de coleta de 2ml fresco e centrifugar por 1 min em 1.000 g de x em um microcentrifuge à temperatura ambiente para coletar amostra purificada.
   6. Traga o volume da amostra a que solicitou para o formato de microarray em uso usando um concentrador ou adicionando 1 x TE (pH 8.0). Por exemplo, para 1-pacote microarray trazer o volume para 80,5 µ l. Incubar a amostra no gelo por 5 min e depois Pipetar a solução acima e para baixo 10 vezes.
4. Preparação de gDNA rotulado para hibridização
   1. Combine as amostras de teste e de referência usando a amostra de 5-rotulado cianina apropriado e amostra de cianina 3-etiquetadas em um tubo 1,5 mL RNase-livre. Por exemplo, para 1-pacote microarray asseguram que o volume final é µ l 158. escolher o volume de cada amostra de acordo com o formato de microarray em uso.
   2. Use um espectrofotômetro para medir o rendimento, grau de atividade específica ou rotulagem medindo-se a absorvância a A260 nm (DNA), A550 nm (cianina 3) e A650 nm (cianina 5).
      1. Calcular o rendimento usando a fórmula: [DNA concentration(ng/µl) x volume de amostra (µ l)] / 1.000 (ng / µ g). Calcular a actividade específica usando a fórmula: pmol por µ l de tintura / µ g por µ l de gDNA.
         Nota: por exemplo, para 0,5 µ g de DNA de entrada, o rendimento deve ser 8 a 11 µ g e a atividade específica (pmol / µ g) deveria ser 25 a 40 para o Cyanine-3 rotulados de amostra e 20 e 35 anos para a amostra rotulada cianina-5.
   3. Para preparar a quantidade de hibridização Master Mix necessária para o formato de microarray em uso, misturar os seguintes reagentes: 50 µ l berço-1 DNA (1,0 mg/ml), 52 µ l 10 x protocolo agente de bloqueio e 260 µ l 2 x tampão de hibridização HI-RPM.
   4. Adicione o volume apropriado do Master de hibridização Mix para o tubo de 1,5 ml RNase-livre que contém o gDNA rotulado para obter o volume total necessário para o formato de microarray em uso. Por exemplo, para 1 pacote microarray, certifique-se que o volume final para cada reação é µ l 362.
   5. Misturar a amostra pipetando para cima e para baixo, em seguida, rapidamente centrifugar a 14.000 x g e incubar durante 3 min a 95 ° C e a 37 ° C por 30 min.
5. Montagem de câmaras e hibridação
   1. Carrega um slide de gaxeta limpa na base da câmara com o rótulo de gaxeta para cima e alinhado com a seção retangular da base da câmara. Certifique-se que o slide de gaxeta esteja alinhado com a base da câmara e não está entreaberto.
   2. Dispense a mistura de amostra de hibridação no poço da gaxeta, certificando-se que a amostra é uniformemente distribuída.
   3. Abaixe um microarray slide para o slide de gaxeta avaliar que o sanduíche-par está alinhado corretamente. Em seguida, monte a câmara de reação, colocar a tampa sobre as guias imprensadas e o grampo de aperto de mão.
   4. Certifique-se de slides umectantes girando a câmara montada verticalmente. Certifique-se de que as bolhas não estão presentes na câmara. Se necessário, bata a montagem em uma superfície dura para mover as bolhas estacionárias.
   5. Colocar as câmaras de slide montado em um rack de rotador criado para rodar a 20 rpm. Coloque a câmara de hibridação em um forno e executar a hibridação a 65 ° C para 40 ou 24 h de acordo com o formato de microarray em uso.
6. Lavagem de Microarray e digitalização
   1. Tirar forno câmara de hibridação e submirja em tampão de lavagem 1. Proceda à sua desmontagem.
   2. Retirar a lâmina de microarray e rapidamente colocá-lo em um rack de slide em tampão de lavagem 1 à temperatura ambiente.
   3. Lave o slide matriz por 5 min com agitação (use uma pulga e um agitador magnético). Ajuste a velocidade do misturador para uma configuração de 4 (velocidade média), para obter bom, mas não demasiado vigorosa mistura.
   4. Lave o slide matriz em tampão de lavagem 2 para agitar de s 90. Delicadamente, recuperar o slide do buffer (deve emergir seco) e carregá-lo em um suporte de slide com o auxílio de um protetor de slide.
   5. Carregar o slide no scanner matriz e realizar a varredura de acordo com as instruções do fabricante da matriz.
   6. Analise os resultados usando o software de extração fornecido com o scanner em uso de acordo com as instruções do fabricante (V.9.1.3.1).

3. WES protocolo

1. Enriquecimento de alvo
   1. Use o dsDNA BR ensaio para determinar a concentração da amostra gDNA de acordo com o protocolo do instrumento.
   2. Dilua 5 µ g de alta qualidade double strand DNA com tampão de baixa TE em um tubo de ligação baixa 1,5 mL em um volume total de 50 µ l 1x.
   3. Configurar um sonicador e colocar um microtubo para a estação de carga e descarga de acordo com as instruções do fabricante. Mantenha a tampa do tubo.
   4. Lentamente, transferi a amostra de DNA de 50 µ l através os septos pre-divididas sem introduzir bolhas.
   5. O DNA de acordo com as configurações sugerida fabricante do sonicador de cisalhamento e avaliar a qualidade usando um Bioanalyzer de acordo com as instruções do fabricante. O tamanho do fragmento de DNA alvo é de 150 a 200 bp.
2. Termina de reparo do DNA
   1. Prepare a mistura de reação de reparação final misturando 40 µ l do Mix de enzima de reparo final com 10 µ l do Mix de Oligo reparação final. Misturar bem no vortex.
   2. Incubar as amostras a 20 ° C por 30 min em um termociclador e mantenha-os em 4 ° C. Não use uma tampa aquecida.
   3. Adicione 50 µ l da mistura de reação de reparação final preparado no passo 3.2.1 a cada 50 µ l cortado a amostra de DNA bem. Misture bem pipetando para cima e para baixo ou vortexing suave.
   4. Purifica a amostra com um kit de purificação de grânulos com base de acordo com o protocolo do fabricante.
3. Poliadenilação 3' extremidades.
   1. Adicione 20 µ l dA-Tailing Master Mix para cada amostra de DNA purificada, reparada a fim (aproximadamente 20 µ l).
   2. Misture bem pipetando para cima e para baixo ou vortexing suave.
   3. Incubar as amostras a 37 ° C em um termociclador e em seguida Segure a 4 ° C. Não use uma tampa aquecida.
4. Ligadura do adaptador indexação pré-captura.
   1. Adicione 5 µ l de ligadura Master Mix para cada amostra de DNA A cauda.
   2. Adicione 5 µ l da solução de índice de pré-captura apropriada para cada amostra.
   3. Selar os poços e homogeneiza vortexing para 5 s. brevemente Centrifugar as amostras.
   4. Incubar as amostras a 20 ° C por 15 min em um termociclador e mantenha a 4 ° C. Não use uma tampa aquecida.
   5. Purifica as amostras com um kit de purificação de grânulos com base de acordo com o protocolo do fabricante.
5. Amplificação da biblioteca indexada.
   1. Prepare o volume adequado da mistura de reação de PCR de pré-captura pela mistura de 1 µ l do Mix de Primer e 25 µ l de PCR Master Mix. Misturar bem no vortex.
   2. Combine 26 µ l da mistura em separado poços de uma placa PCR amplificação e 24 µ l de cada amostra de biblioteca gDNA indexado.
   3. Executar um programa PCR com as seguintes etapas: 98 ° C por 2 min, 5 ciclos a 98 ° C por 30 s, 60 ° C por 30 s e 72 ° C por 1 min e uma extensão final a 72 ° C durante 10 min. Mantenha as amostras em 4 ° C.
   4. Purifica a amostra com um kit de purificação de grânulos com base de acordo com o protocolo do fabricante.
   5. Avalie a qualidade com um Bioanalyzer de acordo com o protocolo do fabricante.
6. Pool de amostras de DNA indexadas para hibridização
   1. Para cada pool de reação de captura, combine o volume apropriado de cada amostra de biblioteca gDNA indexado em um poço de uma placa PCR. Por exemplo, para humanos ou bibliotecas capturar do Mouse All-Exon, combinar 8 bibliotecas por pool usando 187,5 ng de cada biblioteca indexada. Certifique-se de que cada pool de reação de captura final contém 1.500 ng de gDNA indexado.
   2. Reduzir o volume em cada um para < 7 µ l utilizando um concentrador a vácuo. Evite secar completamente a amostra.
   3. Adicione água livre de nuclease cada pool gDNA concentrado para trazer o volume bem final de 7 µ l e, em seguida vórtice a placa contendo gDNA vigorosamente por 30 s. centrífuga em uma centrífuga ou placa Mini spinner para coletar o líquido no fundo dos poços.
7. Hibridação das piscinas de biblioteca gDNA à biblioteca de capturar
   1. Para cada pool de gDNA de 7 µ l indexados, adicione 9 µ l do Mix de bloqueio. Pipete para cima e para baixo para misturar.
   2. Os poços do tampão, transferir a placa selada contendo gDNA para o termociclador e incubar a 95 ° C por 5 min, então segure a 65 ° C. Certifique-se que a placa é presa a 65 ° C, durante pelo menos 5 min.
   3. Preparar a diluição adequada do RNase bloco, em função do tamanho da biblioteca de captura (10% de diluição para bibliotecas < 3.0 Mb e 25% diluição para bibliotecas > 3.0 Mb).
   4. De acordo com o tamanho da biblioteca capturar, combine a quantidade apropriada de biblioteca de capturar e diluir a solução de RNase bloco em uma placa PCR mantida no gelo. Misture bem por pipetagem. Para bibliotecas de captura < 3.0 Mb, uso 2 µ l de biblioteca e 5 µ l de RNase bloco a diluição de 10%. Para bibliotecas de captura > 3.0 Mb, uso 5 µ l de biblioteca e 2 µ l de RNase bloco a diluição de 25%.
   5. Adicione 37 µ l de tampão de hibridização de cada poço contendo 7 µ l do mix de capturar bloco de biblioteca/RNase. Misture bem por pipetagem e brevemente, centrifugar a placa contendo o mix.
   6. Manter a placa de piscina gDNA a 65 ° C enquanto estiver usando uma pipeta multicanal para transferir o inteiro 44 μL de mistura de capturar biblioteca da etapa 3.7.5 para cada amostra bem da placa gDNA piscina. Misture bem pipetando lentamente e descer de 8 a 10 vezes.
   7. Os poços com tampas abobadadas tira do selo. Certifique-se de que todos os poços estão completamente fechados. Coloque um tapete de compressão sobre a placa PCR no termociclador.
   8. Incubar a mistura de hibridização por 24 h a 65 ° C. Nota: As amostras podem ser hibridizadas por até 72 h, mas devem verificar que a hibridização prolongada não causa evaporação extensa em poços de amostra.
8. Preparação dos grânulos magnéticos streptavidin-revestido
   1. Escaldar o tampão de lavagem 2 a 65 ° C em banho-maria ou calor num bloco.
   2. Resuspenda vigorosamente os grânulos magnéticos Streptavidin no vortex. Os grânulos magnéticos resolver durante o armazenamento.
   3. Para cada amostra de hibridação, adicione 50 µ l de grânulos a ressuspensão de poços de uma placa PCR.
   4. Lave os grânulos e Resuspenda-los em 200 µ l de tampão de ligação.
9. Captura do DNA hibridizado usando streptavidin grânulos.
   1. Estimar e registrar o volume de solução de hibridação que permanece após a incubação de 24 h.
   2. Manter a placa de hibridação a 65 ° C e usar uma pipeta multicanal para transferir todo o volume (cerca de 60 µ l) de cada mistura de hibridização para os poços da placa contendo 200 µ l de grânulos streptavidin lavados. Misture bem pipetando lentamente e descer de 3 a 5 vezes.
   3. Os poços do tampão e incubar a placa de captura em um misturador de Nutator ou equivalente durante 30 min à temperatura ambiente. Certifique-se que as amostras são corretamente a mistura em poços.
   4. Brevemente, centrifugar a placa de captura em uma centrífuga ou placa Mini spinner.
   5. Colocar a placa de captura em um separador magnético para coletar as esferas da suspensão. Remover e descartar o sobrenadante.
   6. Resuspenda as contas em 200 µ l de tampão de lavagem 1. Misture pipetando acima e para baixo até que os grânulos são totalmente resuspended.
   7. Brevemente a centrífuga em uma centrífuga ou placa Mini spinner.
   8. Colocar a placa no separador magnético.
   9. Espere que a solução para limpar, em seguida, remover e descartar o sobrenadante.
10. Pós-capturar amostra processamento para sequenciamento multiplexado
    1. Prepare o volume adequado da mistura de reação de PCR, misturando-se o seguinte: água de Nuclease livre 9 µ l, 25 µ l Master Mix e 1 µ l Primer misturar de acordo com o número de amplificações. Misture bem, usando um misturador do vortex e manter no gelo.
    2. Para cada reação de amplificação, coloque 35 µ l da mistura de reação de PCR da etapa 3.10.1 em poços de uma placa PCR.
    3. Pipete cada uma das amostras piscina biblioteca capturados do grânulo-limite acima e para baixo para garantir que a suspensão do grânulo é homogênea.
    4. Adicione 15 µ l de cada suspensão de grânulo de piscina biblioteca capturados para a mistura adequada de reação de PCR bem. Misture bem, pipetando até a suspensão do grânulo é homogênea.
    5. Coloque o prato preparado no ponto 3.10.2 em um termociclador e executar o seguinte programa de amplificação do PCR: 98 ° C por 2 min, ciclos de 8 a 11 a 98 ° C por 30 s, 60 ° C por 30 s e 72 ° C por 1 min, seguido por uma extensão final a 72 ° C por 10 min. Mantenha as amostras em 4 ° C.
    6. Purifica a amostra com uma purificação de grânulos com base de acordo com o protocolo do fabricante.
    7. Avalie a qualidade com um Bioanalyzer de acordo com o protocolo do fabricante.
11. Preparar amostras para multiplexado sequenciamento
    Nota: As amostras enriquecidas finais contenham piscinas de 8 ou 16 bibliotecas indexadas, baseado no tamanho da biblioteca de capturar e resultando pré-captura pooling de estratégia. O número total de indexado bibliotecas que podem ser multiplexados em uma pista única sequenciamento é determinado pelas especificações da plataforma usada, junto com a quantidade de dados de sequenciamento, necessários para a biblioteca de captura de saída.
    1. Calcule o número de índices que podem ser combinados por faixa, de acordo com a capacidade da plataforma. O número total de indexado bibliotecas que podem ser multiplexados em uma pista única sequenciamento é determinado pelas especificações da plataforma usada, junto com a quantidade de dados de sequenciamento, necessários para a biblioteca de captura de saída. Por exemplo, para a biblioteca de v5 Exon todos os humanos, os dados de sequenciamento recomendado, por biblioteca indexado é 4 Gb e os dados de sequenciamento recomendado, por Pool de pré-captura é 32 Gb (8-índice de piscinas).
12. Sequencie as bibliotecas.
    1. Carregar as bibliotecas na plataforma de próxima geração sequenciamento de escolha e realizar o sequenciamento executar de acordo com as especificações do instrumento.
13. Analise dados de sequenciamento exome.
    1. Execute o pipeline e o software de escolha para a chamada base. Por exemplo, use o patudo para mapear leituras²⁰, remover duplicatas com Picard (http://broadinstitute.github.io/picard/) e identificar polimorfismos de nucleotídeo único e inserção ou supressão de bases (puntuais) com ornitorrinco²¹. Filtro variantes sinónimas e aqueles observados em uma frequência alélica < 5% e comparar dados com aqueles de exomes parental para identificar variantes de novo .

4. plasmídeo DNA preparação para eletroporação no Utero

1. Desenha vários RNAs de gancho de cabelo curto (shRNAs) visando a sequência de código ou a 3' UTR dos genes candidatos conforme descrito anteriormente,²².
2. Para evitar fora do alvo efeitos teste shRNAs especificidade pela pesquisa de explosão contra bancos de dados usando métodos padrão. Exclua shRNAs exibindo mais de 50% de complementaridade com outros genes de rato.
3. Os oligonucleotides clone recozido em um vetor de mU6-pro como descrito anteriormente,²³.
4. Purificar o plasmídeo com uma Maxipreparação de acordo com as instruções do fabricante e fazer uma concentração final de 3 µ g / µ l.
5. Alíquota 20 µ l de DNA (0,5 mg/ml pCAGGS-GFP ou sozinho ou com 1,5 mg/ml de shRNA construir) e adicionar 2 µ l de Fast verde tintura (2 mg/mL) para permitir o acompanhamento visual da injeção.

5. no Utero eletroporação

1. Procedimento cirúrgico
   1. Anestesia E15.5 grávida femininos ratos (E0 foi definido como o dia da confirmação do plugue vaginal esperma-positivo), usando uma combinação com uma mistura de xilazina/cetamina (0,1 e 0,01 mg / corpo peso, respectivamente), que é dada através de um intraperitoneal injeção para indução anestésica.
   2. Certifique-se de que o animal é totalmente anestesiado, observando o desaparecimento do reflexo de pitada de dedo do pé.
   3. Raspe o abdômen inferior do animal, usando uma tesoura para remover as peles. Desinfecte a pele usando esfoliantes de iodo-povidona e álcool a 70%. Aplique pomada de veterinário nos olhos para evitar ressecamento enquanto sob anestesia.
   4. Coloque o animal em uma fonte de calor e coloque um pano estéril (com uma janela aberta de 4-5 cm no meio) sobre o local da incisão. Usam máscaras, jaleco, touca e luvas cirúrgicas estéreis. Manter a esterilidade até ao final da cirurgia.
   5. Usando uma tesoura afiada para fazer uma incisão vertical (2 a 2,5 cm) na pele ao longo da linha mediana no abdómen caudal e então fazer uma incisão da parede muscular debaixo da pele — também de 2,5 cm — ao longo da linha mediana.
   6. Cuidadosamente, expor um corno uterino da cavidade abdominal. Largue a 37 ° C pré-aquecido solução salina normal para hidratar os embriões. Manter o útero úmido o tempo todo.
2. Injeção de DNA e eletroporação
   1. Delicadamente, segure um dos cornos uterinos com pinças com anéis e empurre com cuidado um embrião na parede uterina. Segure o embrião em uma mão e com a outra mão inserir cuidadosamente capilares de vidro 1 mm da linha média para o ventrículo lateral esquerdo (2-3 mm de profundidade) e injetar aproximadamente 1 µ l de DNA com Fast Green para permitir o acompanhamento visual da injeção usando uma microinjector.
   2. Gota de solução salina normal na superfície de eletrodos² 3 x 7 mm. Coloque o eletrodo positivo estéril no lado injetado (ventrículo lateral esquerdo) e o elétrodo negativo estéril no ventrículo direito. Entrega 5 pulsos elétricos em intervalos de ms 950 com um pedal pé-controlado (capacitor mF 4000 cobrado a 40 V com um electroporator).
3. Procedimentos de eletroporação de post
   1. Devolver os cornos uterinos à cavidade abdominal, adicione gotas de solução salina normal para a cavidade para permitir embriões posicionados mais naturalmente e para compensar a perda de líquidos no intra-operatório.
   2. A parede do músculo abdominal com suturas cirúrgicas absorvíveis, então feche a pele usando um ponto simples-interrompido.
   3. Coloque o rato volta para a jaula e monitorar o animal até que ele emerge a anestesia.
   4. Para controle da dor administre buprenorfina (0,03 mg/kg) para o animal por injeção subcutânea cada 8-12 h, para até 48 h.

6. cérebro preparação da amostra

1. Método de fixação
   1. Sacrifica o rato grávido 5 dias após o procedimento cirúrgico usando anestesia de gás (isoflurano) seguida de um rápido deslocamento cervical.
   2. Faça uma incisão vertical para re-abrir a cavidade abdominal.
   3. Expor os cornos uterinos, remova os embriões no útero e decapitá-los com uma tesoura afiada.
   4. Remover o cérebro com danos mínimos ao tecido: usando uma tesoura afiada, faça uma pequena incisão ao longo do posterior (cerebelo) / eixo anterior (bulbos olfativa) da cabeça para perfurar a pele e o crânio, em seguida, usando um par de pinças descascar o crânio para expor o cérebro e removê-lo usando uma espátula pequena.
   5. Mergulhe o cérebro durante a noite a 4 ° C, em um 4% paraformaldeído em 1x tampão de fosfato salino (PBS).
2. Corte de cérebro
   1. Lave o cérebro em 1X PBS por 10 min.
   2. Incorpore os miolos em ágar de 4% na incorporação de moldes de plástico.
      1. Prepare-se 50 mL de ágar de 4% em 1X PBS para a incorporação de 5 cérebro embrionário. Certifique-se de que agarose dissolvida é a não mais de 50 ° C.
   3. Manter o cérebro em agarose para polimerizar pelo menos 1 h a 4° C. Remova o excesso do agarose ao redor do cérebro.
   4. Colagem do cérebro para a placa de base vibratome, orientado para que o eixo anterior/posterior do cérebro é perpendicular à lâmina. Aguarde alguns minutos para a cola secar e colocar a placa com o cérebro colado na câmara de vibratome.
   5. Preencha o vibratome com PBS 1x. Fatia de 100 µm de seções espessas.
   6. Transferência de fatias de cérebro em slides, remover o excesso de líquido, adicione algumas gotas de meio de montagem e coloque uma lamela em cima de cérebros

7. confocal Imaging e análise quantitativa

1. Deixe o seco médio de montagem durante a noite antes de imagem. Seções de imagem em 10x em um microscópio confocal de varredura a laser.
2. Usando o software para análise quantitativa de imagem, converter a imagem em 8-bit, selecione um representante GFP positivas fluorescente célula e definir manualmente a sua forma. Para fazer isso, clique em "Orçamento" e desenhar a borda da célula usando a ferramenta de seleção à mão livre. Neste caminho o diâmetro e o limiar de intensidade da célula são mantidos automaticamente pelo software.
3. Clique em "Localizar células" para permitir que o software localizar células transfectadas por todo o córtex. Em seguida, se necessário, remova manualmente os falsos positivos.
4. Divida a toda espessura do córtex em 8 áreas de interesse normalizado em seções individuais. Para conseguir isso, clique em "Região Tool", selecione 8 "faixas de região" onde o primeiro (1) e o último (8) listras correspondem a VZ e o topo do CP, respectivamente. Clique em "Aplicar" para permitir que o software contar a posição relativa de células GFP transfectada no córtex inteiro. Finalmente, clique em "Salvar quantificação" para exportar dados em um arquivo do Excel para a análise.

Resultados

A estratégia experimental projetada para identificar novos genes causadores de MCD é recapitulada em Figura 1.

Através da realização de matriz-CGH em uma coorte de 155 pacientes com anormalidades no desenvolvimento cerebral variàvel combinando hemoglobinúria paroxística noturna (Figura 2A), disgenesia do corpo caloso, colpocefalia, hipoplasia cerebelar e polymicrogyria associados com epi...

Discussão

MCDs são importantes causas de deficiência intelectual e conta para 20-40% de infância resistentes epilepsia^1,2. Interesse em MCDs aumentou dramaticamente durante a última década como resultado de dois fatores principais. A primeira é a melhoria no cérebro de imagem (particularmente MRI), que permite que médicos e cientistas Visualizar muitas malformações do cérebro que não foram reconhecidas anteriormente. O outro é a evolução de ferramentas gené...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Picospritzer III	Parker Hannifin Corp	P/N 051-0500-900	Intracellular Microinjection Dispense Systems
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252	Fast green allow visual monitoring of the injection
BTX ECM 830 electroporator	BTX Harvard Apparatus	45-0002	The ECM 830 is a Square Wave Pulse generator designed for in vitro and in vivo applications
Microtome HM 650 V	Microm	10076838	Microtome HM 650 V vibratome 240V 50/60Hz with vibrating blade
FluoView 300	Olympus		The Olympus FluoViewTM 300 is a point-scanning, point-detection, confocal laser scanning microscope designed for biology research application
eCELLence software	Glance Vision Technologies		eCELLence is software designed for the quantitive analysis of cell migration
Agilent Microarray Scanner Bundle			Array slides
for 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K or 8 x 15K	Agilent	Agilent p/n G4900DA, G2565CA or G2565BA
for 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K or 8 x 60K	Agilent	Agilent p/n G4900DA or G2565CA
Hybridization Chamber, stainless	Agilent	Agilent p/n G2534A	Chamber for array CGH hybridization
Hybridization Chamber gasket slides, 5-pack			Gasket for array CGH hybridization
for 1-pack microarrays or	Agilent	Agilent p/n G2534-60003
for 2-pack microarrays or	Agilent	Agilent p/n G2534-60002
for 4-pack microarrays or	Agilent	Agilent p/n G2534-60011
for 8-pack microarrays	Agilent	Agilent p/n G2534-60014
Hybridization oven	Agilent	Agilent p/n G2545A
Hybridization oven rotator for Agilent Microarray Hybridization Chambers	Agilent	Agilent p/n G2530-60029
Thermal cycler with heated lid	Agilent	Agilent p/n G8800A or equivalent	Termal cycler for incubations
1.5 mL RNase-free Microfuge Tube	Ambion	p/n AM12400 or equivalent	Microcentrifuge
Magnetic stir bar	Corning	p/n 401435 or equivalent	Instrument for stirring
Qubit Fluorometer	Life Technologies	p/n Q32857	Instrument for DNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit, for use with the Qubit fluorometer	Invitrogen	p/n Q32850	Kit for Qubit fluorometer
UV-VIS spectrophotometer	Thermo Scientific	NanoDrop 8000 or 2000, or equivalent	Instrument for DNA quantification
P10, P20, P200 and P1000 pipettes	Pipetman or equivalent		DNA dispensation
Vacuum Concentrator	Thermo Scientific	p/n DNA120-115 or equivalent	Instrument to concentrate DNA
SureTag Complete DNA Labeling Kit	Agilent	p/n 5190-4240	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
Purification Columns (50 units)	Agilent	p/n 5190-3391	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
AutoScreen A, 96-well plates	GE Healthcare	p/n 25-9005-98	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
GenElute PCR Clean-Up Kit	Sigma-Aldrich	p/n NA1020	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
Human Genomic DNA		p/n G1521	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
For CGH microarrays:	Promega	(female) or p/n G1471 (male)	Array CGH control DNA
For CGH+SNP microarrays:	Coriell	p/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878, or NA18579	Array CGH control DNA
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer Kit or	Agilent	p/n 5188-5226	Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and	Agilent	p/n 5188-5221	Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2	Agilent	p/n 5188-5222	Array CGH hybridization and wash
Stabilization and Drying Solution	Agilent	p/n 5185-5979	Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit	Agilent	p/n 5188-5220 (25) or p/n 5188-5380 (100)	Array CGH hybridization and wash
Human Cot-1 DNA	Agilent	p/n 5190-3393	Array CGH hybridization and wash
Agilent C scanner	Agilent		Scanner for array CGH slides
SureSelect XT2 Reagent Kit			Kit for target enrichment
HiSeq platform (HSQ), 16 Samples	Agilent	p/n G9621A
HiSeq platform (HSQ), 96 Samples	Agilent	p/n G9621B
HiSeq platform (HSQ), 480 Samples	Agilent	p/n G9621C
MiSeq platform (MSQ), 16 Samples	Agilent	p/n G9622A
MiSeq platform (MSQ), 96 Samples	Agilent	p/n G9622B
MiSeq platform (MSQ), 480 Samples	Agilent	p/n G9622C
DNA 1000 Kit	Agilent	p/n 5067-1504	Kit for the separation, sizing and quantification of dsDNA fragments from 25 to 1000 bp.
High Sensitivity DNA Kit	Agilent	p/n 5067-4626	Kit for analysis of fragmented DNA or DNA libraries.
AMPure XP Kit			Kit for automated PCR purification.
5 mL	Agencourt	p/n A63880
60 mL	Agencourt	p/n A63881
450 mL	Agencourt	p/n A63882
Dynabeads MyOne Streptavidin T1			Isolation and handling of biotinylated nucleic acids
2 mL	Life Technologies	Cat #65601
10 mL	Life Technologies	Cat #65602
Quant-iT dsDNA BR Assay Kit, for the Qubit fluorometer			DNA quantification
100 assays, 2-1000 ng	Life Technologies	Cat #Q32850
500 assays, 2-1000 ng	Life Technologies	Cat #Q32853
Qubit assay tubes	Life Technologies	p/n Q32856	DNA quantification
SureSelec tXT2 Capture Libraries	Agilent	depending on the experiment	Kit for libraries capture
SureCycler 8800 Thermal Cycler	Agilent	p/n G8800A	DNA amplification
96 well plate module for SureCycler 8800 Thermal Cycler	Agilent	p/n G8810A	DNA amplification
SureCycler 8800-compatible 96-well plates	Agilent	p/n 410088	DNA amplification
Optical strip caps	Agilent	p/n 401425	DNA amplification
Tube cap strips, domed	Agilent	p/n 410096	DNA amplification
Compression mats	Agilent	p/n 410187	DNA amplification
2100 Bioanalyzer Laptop Bundle	Agilent	p/n G2943CA	DNA amplification
2100 Bioanalyzer Electrophoresis Set	Agilent	p/n G2947CA	DNA amplification
Covaris Sample Preparation System, E-series or S-series	Covaris		DNA shearing
Covaris sample holders		p/n 520078	DNA shearing
Nutator plate mixer	BD Diagnostics	p/n 421105 or equivalent	Plate Mixer
GaIIx	Illumina		next generation sequencing machine