אסטרטגיה רומן המשלב מערך-CGH, רצף שלם-exome and בתוך הרחם אלקטרופורציה בחולדות לזיהוי גנים סיבתי של מומים המוח

Summary

Periventricular קשרי הטרוטופיה (PNH) היא הצורה הנפוצה ביותר של מום ההתפתחות בקליפת המוח (MCD) בבגרות אבל את הבסיס הגנטי שלה אינו ידוע במקרים ספורדיים ביותר. לאחרונה פיתחנו אסטרטגיה לזיהוי גנים מועמדים חדשניים עבור MCDs וכדי לאשר ישירות שלהם תפקיד סיבתי בתוך vivo.

Abstract

מומים מולדים המערבות קליפת המוח – המכונה גם מומים של פיתוח בקליפת המוח (MCD) — הם גורמים חשובים מוגבלות ועל חשבון עבור 20-40% של אפילפסיה עמידים לתרופות בילדות. הדמיה מוחית ברזולוציה גבוהה הנחתה ויוו זיהוי של קבוצה גדולה של פנוטיפים MCD. למרות ההתקדמות הדמיה מוחית, אנליזה גנומית, דור של מודלים בעלי חיים, זרימת עבודה פשוטה כדי לקבוע עדיפויות באופן שיטתי של המועמד גנים, כדי לבדוק את ההשפעות פונקציונלי של מוטציות בשם חסר. כדי להתגבר על בעיה זו, אסטרטגיית ניסיוני המאפשרים הזיהוי של הרומן גנים סיבתי עבור MCD פיתח, לאמת. אסטרטגיה זו מבוסס על זיהוי אזורים גנומית המועמד או גנים באמצעות מערך-CGH או כל-exome רצף ואפיון את ההשפעות של איון שלהם או של ביטוי של מוטציות ספציפיות בפיתוח המוח מכרסמים באמצעות בתוך הרחם אלקטרופורציה. גישה זו הובילה הזיהוי של הגן C6orf70 , קידוד עבור חלבון בשם vesicular, בפתוגנזה של הטרוטופיה קשרי periventricular, MCD הנגרמת על ידי הגירה העצבית פגומה.

Introduction

קליפת המוח ממלא תפקיד מרכזי בתהליכי קוגניטיבית ואינטלקטואלית, ומעורב שליטה רגשית כמו גם בלמידה ובזיכרון. לכן זה לא מפתיע כי מחלות והפרעות פסיכיאטריות רבות תוצאה של מומים של פיתוח בקליפת המוח (MCD). האטיולוגיה של MCD מורכבים מאז רכשה, מעורבים גורמים גנטיים. השכיחות המצטברת של שיעור נקבע גנטית MCD היא כ- 2% והם סדיר ברוב המקרים. למשל, השכיחות של מוח מולדים dysgenesis נאמד להיות גבוה מ- 1% באוכלוסייה האנושית ולאחר כמה צורות של MCD הם נצפו יותר מ 14% של כל חולי אפילפסיה ו- 40% של אפילפסיה חמורה או סורר^{1, 2}.

Periventricular קשרי הטרוטופיה (PNH) הוא אחד MCDs הנפוצה ביותר והיא נגרמת על ידי העברה חריגה של נוירונים מאזור חדרית (VZ) אל קליפת המוח המתפתח. הכשל של נוירונים להעברת תוצאות אשכולות של נוירונים הטרוטופי לאורך קירות החדרים הצדדיים אשר בדרך כלל ניתן לאבחן באמצעות תהודה מגנטית (MRI). המאפיינים הקליניים, אנטומי, הדמיה של PNH הם הטרוגנית. גושים עשויים לנוע בין קטן ולא חד-צדדי דו צדדיות ולא סימטרי. Sequelae קליניים נפוצים כוללים לקויות אפילפסיה אינטלקטואלי³. מוטציות בגן Filamin A (או FLNA), אשר מפות ב Xq28, נמצאו ב- 100% מהמשפחות עם X-linked PNH הדו-צדדיים וב -26% של חולים סדיר^3,4. צורה נדירה, רצסיבי של PNH נגרמת על ידי מוטציות בגן ARFGEF2 , אשר מפות ב- 20q13, דווח בשתי משפחות consanguineous⁵. לאחרונה, biallelic מוטציות בגנים קידוד הזוג קדהרין קולטן-ליגנד DCHS1 ו- FAT4 זוהו ב תשעה חולים מושפע על ידי הפרעה multisystemic הכולל PNH⁶. PNH הייתה קשורה גם שביר X תסמונת⁷, תסמונת וויליאמס⁸, תסמונת microdeletion 22q11⁹, כפילויות ב 15 p 5¹⁰, מחיקות-1 p 36¹¹, 5q14.3-q15¹², p 6 25¹³ 6q מחיקה מסוף תסמונת^{14,15,16,17,18,19}, רומז כי גנים סיבתי נוספים פזורים ברחבי הגנום. עם זאת, כ- 74% מהחולים PNH סדיר בסיס גנטי נשאר עד מבואר¹⁷.

מיפוי גנים קלאסית גישות כמו מערך הכלאה גנומית השוואתית (מערך-CGH) הוכיחו להיות כלים רבי-עוצמה הגילוי של תת-מיקרוסקופיים העיוותים כרומוזומלית, אולם האזורים גנומית מזוהה באמצעות גישה זו הם לעיתים קרובות גדולים מכילים גנים רבים.

כניסתו של רצף מקביל מסיבית טכניקות (כלומר רצף שלם-Exome (ווס) ואת כל הגנום רצפי (WGS)) הפחיתה באופן משמעותי הן את העלות והן את הזמן הנדרש כדי רצף של exome האנושי כולו או גנום. יחד עם זאת, הפרשנות של ווס ונתונים WGS נותר מאתגר ברוב המכריע של המקרים, מאז עבור כל גרסאות החולה עשרות עד מאות (או אפילו אלפים, תלוי מתוך הסוג של ניתוח) מגיחים סינון נתונים.

כדי להאיץ את התהליך של זיהוי הרומן גנים סיבתי של MCD, אסטרטגיה שיטתית חדשניים המשלבים CGH מערך, ווס, בתוך הרחם ההקרנה אלקטרופורציה (הצמיגים) של המועמד גנים תוכנן. . הצמיגים מאפשר להשבית באופן סלקטיבי (או overexpress) גנים ספציפיים או מוטציות במוח מכרסמים, ראפיד הערכה מעורבותן^18,corticogenesis¹⁹. RNAi בתיווך מצרי-נוקאאוט או ביטוי של גנים מועמד אחד או יותר צפוי לגרום, כאשר הגן מזוהה עם התפתחות המחלה, פגמים מקומי הגירה העצבית ו/או התבגרות. על זיהוי גנים של מי איון (או ביטוי) מתרבה על פנוטיפ אצל חולים בחולדות, הוא הופך להיות מועמד מצטיינים להקרנה בחולים סדיר עם MCD. באמצעות גישה זו, אנחנו חשפה לאחרונה את התרומה מכריע של הגן C6orf70 (הידוע גם בשם ERMARD) ב- PNH פתוגנזה בחולים יקולל מחיקות כרומוזומלית 6q27¹⁶.

Protocol

אתיקה במשפט: חולדות Wistar היו הזדווגו ומתוחזק בשימוש במתקני בעלי חיים INMED, מסכים עם החקיקה באיחוד האירופי וצרפתית.

1. DNA החילוץ, כימות מערך-CGH, ווס

1. תמצית הדנ א (gDNA) של דם אנושי לויקוציטים מחולים באמצעות רובוט אוטומטי של בידוד דנ א או זמינים מסחרית ערכות חילוץ ידני הדנ א על פי הפרוטוקול של היצרן. לכמת כל דוגמאות שימוש ספקטרופוטומטרים.

2. מערך-CGH פרוטוקול

1. עיכול הגבלה של gDNA
   1. כפול תקציר 500 ננוגרם של מטוהרים gDNA חולה, פקד האנושי זמינים מסחרית DNA עם RsaI ו- AluI עבור 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס. השתמש μl 0.5 של האנזים U/μL 10 עבור כל תגובה. תקופת דגירה של 20 דקות ב 65 ° C בטל האנזימים ולעבור הצינורות דגימת קרח.
2. Labelling מדגם
   1. להוסיף נפח מתאים של תחל אקראי הדרושים עבור התבנית microarray בשימוש כדי כל שפופרת התגובה (למשל 5 µl עבור מיקרו-מערכים 1-pack 2-pack, רביעיית). מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה בעדינות.
   2. להעביר צינורות מדגם הצנטרפוגה תרמי. דגירה 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות ולאחר מכן 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
   3. להכין cyanine 3 ואחת אחת cyanine 5 Labelling מיקס מאסטר על הקרח על ידי ערבוב אמצעי האחסון הבאים: 10.0 µl 5 X תגובת מאגר, x dNTPs µl 10 5.0, 3.0 µl Cyanine 3-dUTP או Cyanine 5-dUTP, µl 1.0 Exo (-) Klenow האנזים, µl 2.0 נוקלאז ללא מים. בחר את הנפח של כל מגיב על פי התבנית microarray בשימוש.
   4. להוסיף את תערובת מאסטר Labelling כל שפופרת התגובה המכיל את gDNA. מערבבים היטב על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה.
   5. להעביר צינורות מדגם הצנטרפוגה תרמי ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים, 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן לשמור את הדגימות-4 מעלות צלזיוס.
3. טיהור של gDNA עם תוויות ברורות
   1. להוסיף µl 430 של טה 1 x (pH 8.0) כל שפופרת התגובה.
   2. למקם את עמודת טיהור צינורות אוסף 2 מ"ל, תוויות העמודות כראוי. לטעון את כל gDNA עם תוויות ברורות על עמודה טיהור.
   3. צנטריפוגה 10 דקות-14,000 g x ב- microcentrifuge בטמפרטורת החדר. למחוק את הזרימה דרך ולמקם את העמודה בחזרה בצינור אוסף 2 מ"ל.
   4. להוסיף µL 480 1 x TE (pH 8.0) של כל אחת מהעמודות. צנטריפוגה 10 דקות-14,000 g x ב- microcentrifuge בטמפרטורת החדר. למחוק את הזרימה דרך.
   5. היפוך העמודה לתוך טריים mL 2 אוסף שפופרת צנטריפוגה עבור 1 דקות ב- 1000 g x ב- microcentrifuge בטמפרטורת החדר כדי לאסוף דגימת מטוהרים.
   6. להביא את אמצעי האחסון מדגם ביקש עבור התבנית microarray בשימוש באמצעות רכז או הוספת x 1 TE (pH 8.0). לדוגמה, עבור 1-חבילת microarray להביא את אמצעי האחסון ל- 80.5 µL. דגירה המדגם על קרח למשך 5 דקות, ואז pipette את הפתרון לכל אורך 10 פעמים.
4. הכנת gDNA עם תוויות ברורות של הכלאה
   1. לשלב דוגמאות בדיקה ועיון באמצעות cyanine המתאים התווית על-ידי 5 מדגם cyanine התווית על-ידי 3 מדגם צינור טריים mL 1.5 ללא RNase. לדוגמה, עבור 1-חבילת microarray להבטיח כי אמצעי האחסון הסופי הוא 158 µL. בחר את הנפח של כל דגימה על פי התבנית microarray בשימוש.
   2. להשתמש ספקטרופוטומטרים כדי למדוד תפוקה, מידת פעילות labelling או ספציפי על-ידי מדידת את ספיגת A260 ננומטר (DNA), A550 nm (cyanine 3), וכן A650 nm (cyanine 5).
      1. חישוב תשואה תוך שימוש בנוסחה: [DNA concentration(ng/µl) x נפח דגימה (µl)] / 1,000 (ng/µg). לחשב את פעילות ספציפית באמצעות הנוסחה: pmol לכל µl של צבע/µg לכל µl של gDNA.
         הערה: לדוגמה, עבור µg 0.5 של קלט ה-DNA, התשואה צריכה להיות µg 8 עד 11, פעילות ספציפית (pmol/µg) אמור להיות 25 עד 40 עבור Cyanine-3 מתויג ולדגום 20 עד 35 עבור המדגם שכותרתה Cyanine-5.
   3. כדי להכין את הכמות של מיקס מאסטר הכלאה הדרושים עבור התבנית microarray בשימוש, לערבב את ריאגנטים הבאים: 50 µL מתקפלת-1 DNA (1.0 mg/ml), 52 µL 10-aCGH הסוכן חסימת ו- 260 µl 2 x מאגר הכלאה HI-סל ד.
   4. להוסיף נפח מתאים של המיקס הכלאה מאסטר הצינור ml 1.5 ללא RNase המכיל את gDNA עם תוויות ברורות כדי להשיג את הנפח הכולל הנדרש עבור התבנית microarray בשימוש. לדוגמה, עבור microarray 1 pack, ודא שעוצמת הסופי עבור כל תגובה 362 µl.
   5. לערבב את הדגימה על-ידי pipetting למעלה ולמטה, ואז במהירות צנטריפוגה ב 14,000 x g, תקופת דגירה של 3 דקות ב 95 ° C ו- 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
5. הכלאה והאסיפה צ'יימברס
   1. לטעון שקופית אטם נקי לתוך הבסיס קאמרית עם אטם את התווית פונה כלפי מעלה, מיושר עם המקטע מלבני של הבסיס קאמרית. ודא כי השקופית אטם מיושר עם הבסיס קאמרית אינה פתוחה.
   2. לוותר על התערובת מדגם הכלאה על הבאר gasket, מוודא כי המדגם מופץ בצורה אחידה.
   3. . תניח שקופית microarray על גבי השקופית אטם הערכת הכריך-הזוג מיושר כראוי לאחר מכן, להרכיב את התא התגובה לשים המכסה על השקופיות sandwiched על יד-הידוק המלחציים.
   4. ודא שקופיות משתין על-ידי סיבוב תא שהורכב אנכית. ודא כי בועות אינם נוכחים בבית הבליעה. במקרה הצורך, הקש על מכלול על משטח קשה להזיז את בועות נייח.
   5. הכניסו הצ'יימברס שקופית שהורכב מתלה מסובב להגדיר כדי לסובב במהירות של סל ד 20. לשים את התא הכלאה בתנור, לבצע הכלאה ב 65 ° C h 24 או 40 על פי התבנית microarray בשימוש.
6. כביסה Microarray וסריקה
   1. להוציא הכלאה קאמרית תנור ויציפו אותה במאגר שטיפת 1. המשך פירוק שלה.
   2. הסר את השקופית microarray, להכניס את זה לתוך ארון שקופית במאגר שטיפת 1 בטמפרטורת החדר.
   3. לשטוף את השקופית מערך עבור חמש דקות עם ערבוב (להשתמש הפשפשים ו של פגים). כוון את מהירות קדירות להגדרה של 4 (מהירות בינונית), כדי לקבל טוב אבל לא יותר מדי נמרצת ערבוב.
   4. לשטוף את השקופית מערך במאגר לשטוף 2 עבור ערבוב s 90. בעדינות להתאושש השקופית המאגר (זה אמור לצאת יבש) לטעון אותו לתוך מחזיק שקופיות בסיועם של מגן שקופיות.
   5. לטעון את השקופית לתוך הסורק מערך ולבצע סריקה לפי הוראות היצרן מערך.
   6. לנתח את התוצאות תוך שימוש השזורות בתוכנת מסופק עם הסורק בשימוש על פי הוראות היצרן (V.9.1.3.1).

3. ווס פרוטוקול

1. היעד העשרה
   1. להשתמש את dsDNA BR Assay כדי לקבוע הריכוז של הדגימה gDNA לפי הפרוטוקול כלי נגינה.
   2. לדלל 5 µg באיכות גבוהה כפולה גדיל DNA עם 1 x נמוך טה מאגר של צינור bind נמוך 1.5 mL הנפח הכולל של 50 µL.
   3. להגדיר את sonicator ושם microtube של תחנת טעינה ופריקה של-פי הוראות היצרן. תסתום את הפה ברכבת התחתית
   4. לאט לאט להעביר את דגימת דנ א 50 µl דרך septa מראש לפצל ללא היכרות עם בועות.
   5. הטיית ה-DNA בהתאם להגדרות הציע מיצרן של sonicator והערכת איכות שימוש של Bioanalyzer על פי הוראות היצרן. המטרה גודל מקטע ה-DNA היא 150-200 bp.
2. תיקון ה-DNA מסתיים
   1. להכין את תערובת התגובה סוף תיקון על ידי ערבוב µL 40 של סיום תיקון אנזים לערבב עם µL 10 של סיום תיקון Oligo מיקס. מערבבים היטב על מערבל מערבולת.
   2. דגירה הדגימות ב 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בהצנטרפוגה תרמי ולאחר מכן החזק אותם ב 4 º C. אל תשתמש מכסה מחוממת.
   3. הוסף µL 50 של המיקס התגובה תיקון סוף מוכן בשלב 3.2.1 על כל µL 50 לכסנתם דנ א. טוב. מערבבים היטב על-ידי pipetting למעלה ולמטה או vortexing עדין.
   4. לטהר מדגם עם ערכת טיהור חרוזים מבוסס על פי יצרן פרוטוקול.
3. פוליאדנילציה של 3' מסתיים.
   1. הוסף 20 µl של מיקס מאסטר dA-עוקב כל סוף תוקן, מטוהרים דנ א (כ-20 µL).
   2. מערבבים היטב על-ידי pipetting למעלה ולמטה או vortexing עדין.
   3. דגירה הדגימות ב- 37 מעלות צלזיוס הצנטרפוגה תרמי ולאחר מכן החזק את זה ב 4 º C. אל תשתמש מכסה מחוממת.
4. מצדו של מתאם יצירת אינדקס לכידת מראש.
   1. להוסיף 5 µL של מיקס מאסטר מצדו כל דגימת דנ א-זנב.
   2. להוסיף 5 µL של הפתרון המתאים של אינדקס לכידת קדם כל דגימה.
   3. חותם הבארות, לערבב ביסודיות על ידי vortexing על 5 ס' בקצרה צנטריפוגה הדגימות.
   4. דגירה הדגימות ב 20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות הצנטרפוגה תרמי ולאחר מכן החזק ב 4 º C. אל תשתמש מכסה מחוממת.
   5. לטהר את הדגימות עם ערכת טיהור חרוזים מבוסס על פי יצרן פרוטוקול.
5. הגברה של הספרייה באינדקס.
   1. הכן האחסון המתאים של לכידת קדם PCR התגובה מיקס על ידי ערבוב µL 1 של פריימר מיקס 25 µL של מיקס מאסטר PCR. מערבבים היטב על מערבל מערבולת.
   2. לשלב µL 26 של תערובת הגברה בבארות נפרדים של צלחת PCR µL 24 של כל מדגם ספריית gDNA באינדקס.
   3. הפעלת תוכנית ה-PCR עם השלבים הבאים: 98 ° C למשך 2 דקות, 5 מחזורים ב 98 ° C ל 30 s, 60 ° C ל 30 s ו- 72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה ועם סיומת הסופי ב-72 מעלות במשך 10 דקות להחזיק את הדוגמאות על 4 מעלות צלזיוס.
   4. לטהר מדגם עם ערכת טיהור חרוזים מבוסס על פי יצרן פרוטוקול.
   5. להעריך איכות עם Bioanalyzer לפי פרוטוקול היצרן.
6. איגום של אינדקס דגימות די אן איי של הכלאה
   1. בכל בריכה התגובה לכידת, לשלב את עוצמת הקול המתאים של כל מדגם ספריה באינדקס gDNA היטב אחד של צלחת PCR. לדוגמה, עבור האדם או ספריות ללכוד אקסון-כל של העכבר, לשלב 8 ספריות לכל בריכה באמצעות 187.5 ng של כל ספריה באינדקס. להבטיח כי בכל בריכה התגובה לכידת הסופית מכילה 1,500 ng של gDNA באינדקס.
   2. להפחית את נפח בכל טוב ל < µL 7 באמצעות רכז ואקום. להימנע לחלוטין ייבוש המדגם.
   3. להוסיף מים נטולי נוקלאז מספיק בכל בריכה gDNA מרוכז כדי להביא עוצמת הקול הסופי טוב µL 7 ואז מערבולת לצלחת המכילה gDNA נמרצות עבור צנטריפוגה ס' 30 ב ספינר צנטריפוגה או בצלחת מיני כדי לאסוף את הנוזל בתחתית הבארות.
7. הכלאה של gDNA בריכות הספרייה לספרייה ללכוד
   1. לבריכת gDNA כל µL 7 אינדקס ', להוסיף µl 9 של חסימת מיקס. פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב.
   2. קאפ הבארות, להעביר את הצלחת אטום המכיל gDNA כדי הצנטרפוגה תרמי, דגירה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואז תחזיק על 65 ° C. ודא כי הצלחת מוחזקת 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לפחות.
   3. להכין דילול המתאים RNase בלוק, על בסיס גודל הספרייה הלכידה (10% דילול עבור ספריות < 3.0 מגה-בתים ו- 25% דילול עבור ספריות > 3.0 Mb).
   4. על-פי גודל הספרייה ללכוד, לשלב את הכמות הנכונה של ספריית ללכוד ו לדלל RNase בלוק פתרון בצלחת PCR שמרה על קרח. מערבבים היטב בעזרת pipetting. עבור לכידת ספריות < 3.0 מגה, שימוש 2 µl של ספריית ו µL 5 של גוש RNase ב 10% דילול. עבור לכידת ספריות > מגה 3.0, שימוש 5 µl של ספריית ו- 2 µl של גוש RNase ב 25% דילול.
   5. להוסיף µL 37 הכלאה מאגר כל טוב המכיל 7 µL של לכידת בלוק ספריה/RNase מיקס. מערבבים היטב בעזרת pipetting, בקצרה centrifuge לצלחת המכילה את המיקס.
   6. לשמור על הלוח בריכת gDNA ב 65 ° C תוך שימוש פיפטה רב ערוצית כדי להעביר את µL 44 כל תערובת ספריית ללכוד צעד 3.7.5 כל מדגם טוב של צלחת הבריכה gDNA. מערבבים היטב בעזרת pipetting באיטיות לאורך 8-10 פעמים.
   7. חותם הבארות עם רצועת כיפה כיפות. ודא כי כל בארות אטומות לחלוטין. מניחים מזרון דחיסה יניף PCR ב הצנטרפוגה תרמי.
   8. דגירה התערובת הכלאה במשך 24 שעות ביממה ב- 65 מעלות צלזיוס. הערה: דגימות ייתכן שהוכלא על עד 72 שעות, אך עליך לוודא כי הכלאה מורחב אינו גורם אידוי נרחב ב הבארות מדגם.
8. הכנת beads מגנטי מצופה streptavidin
   1. Prewarm מאגר לשטוף 2 ב 65 מעלות צלזיוס בתוך גוש טורקי או חום המים.
   2. Resuspend נמרצות את החרוזים מגנטי Streptavidin על מערבל מערבולת. החרוזים מגנטי להתיישב במהלך האחסון.
   3. עבור כל דגימה הכלאה, להוסיף 50 µL של חרוזים resuspended בארות של צלחת PCR.
   4. לשטוף את החרוזים, resuspend אותם ב- 200 µL מאגר מחייב.
9. ללכוד את ה-dna hybridized באמצעות streptavidin חרוזים.
   1. מעריכים ולהקליט את עוצמת הקול של פתרון הכלאה שנשאר אחרי הדגירה 24 שעות ביממה.
   2. לשמור על הצלחת הכלאה ב 65 ° C, שימוש פיפטה רב-ערוצי כדי להעביר את אמצעי האחסון כולו (כ-60 µL) כל התערובת הכלאה הבארות צלחת המכיל 200 µL של streptavidin שטף חרוזים. מערבבים היטב בעזרת pipetting באיטיות לאורך 3 עד 5 פעמים.
   3. קאפ הבארות, דגירה את הצלחת הלכידה Nutator מיקסר או שווה ערך במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. ודא כי הדגימות הם ערבוב כראוי בתוך הבארות.
   4. Centrifuge בקצרה את הצלחת הלכידה ב ספינר צנטריפוגה או מיני בצלחת.
   5. לשים את הצלחת הלכידה מפריד מגנטי כדי לאסוף את החרוזים מההשעיה. להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע.
   6. Resuspend את החרוזים ב 200 µL שטיפת מאגר 1. מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה עד החרוזים הם resuspended באופן מלא.
   7. בקצרה צנטריפוגה ב ספינר צנטריפוגה או מיני בצלחת.
   8. לשים את הצלחת ההפרדה מגנטי.
   9. המתן פתרון ברור, ואז להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע.
10. פוסט ללכוד מדגם עיבוד רצף מרובבת
    1. להכין את אמצעי האחסון המתאים של תערובת התגובה PCR על ידי ערבוב הבאות: מים נטולי נוקלאז µL 9, 25 µL מיקס מאסטר, 1 µL פריימר לערבב לפי מספר amplifications. מערבבים היטב בעזרת מערבל מערבולת ולשמור על קרח.
    2. עבור כל תגובה הגברה, מקום µL 35 של תערובת התגובה PCR מ שלב 3.10.1 הבארות של צלחת PCR.
    3. פיפטה כל של הדגימות בריכה ספריית שנתפסו מאוגד-חרוז למעלה ולמטה כדי להבטיח כי ההשעיה חרוז הומוגנית.
    4. להוסיף 15 µL של כל ספריית שנתפסו בריכה חרוז השעיה לתערובת PCR התגובה המתאימה היטב. לערבב ביסודיות על ידי pipetting עד המתלה חרוז הוא הומוגני.
    5. למקם את הצלחת מוכן. למשל 3.10.2 ב הצנטרפוגה תרמי ולהפעיל את התוכנית הבאה של הגברה PCR: 98 ° C למשך 2 דקות, 8 עד 11 מחזורים ב 98 ° C ל 30 s, 60 ° C עבור s 30 ו-72 מעלות עבור 1 דקות, ולאחריה סיומת הסופי ב-72 מעלות למשך 10 דקות. להחזיק את הדוגמאות על 4 מעלות צלזיוס.
    6. לטהר מדגם בטהרה חרוזים מבוסס על פי יצרן פרוטוקול.
    7. להעריך איכות עם Bioanalyzer לפי פרוטוקול היצרן.
11. מוכנות דגימות מרובב רצף
    הערה: הדגימות מועשר הסופי להכיל בריכות של ספריות אינדקס 8 או 16, של בהתבסס על גודל הספרייה ללכוד וכתוצאה לכידת מראש איגוד האסטרטגיה. המספר הכולל של ספריות אינדקס עשוי להיות מרובב בסמטה רצף יחיד נקבע לפי המפרט פלט של פלטפורמת בהם, יחד עם כמות רצף הנתונים הנדרשים עבור הספריה ללכוד.
    1. לחשב את מספר אינדקסים שניתן לשלבם לכל ליין, בהתאם לקיבולת של הפלטפורמה. המספר הכולל של ספריות אינדקס עשוי להיות מרובב בסמטה רצף יחיד נקבע לפי המפרט פלט של פלטפורמת בהם, יחד עם כמות רצף הנתונים הנדרשים עבור הספריה ללכוד. לדוגמה, בספריה v5 אקסון כל האדם, מומלץ רצף הנתונים לכל ספריה באינדקס הוא 4 Gb והוא מומלץ רצף הנתונים לכל לכידת טרום בריכה 32 ג'יגה-בתים (8-אינדקס בריכות).
12. רצף של הספריות.
    1. לטעון את הספריות על פלטפורמת רצף הדור הבא של הבחירה ולבצע את הרצף לפעול בהתאם למפרטים כלי נגינה.
13. ניתוח נתונים רצף exome.
    1. הפעל את הצינור התוכנה של בחירה עבור חיוג הבסיס. לדוגמה, השתמש Stampy כדי למפות קריאות²⁰, להסרת כפילויות עם פיקארד (http://broadinstitute.github.io/picard/), לזהות נוקלאוטיד יחיד פולימורפיזמים, ההוספה או המחיקה של בסיסים (indels) עם ברווזן²¹. לסנן גרסאות נרדף ואלו נצפו בתדר אלל < 5% ונתונים השוואה עם אלה של exomes הורים לזהות משתנים de novo .

4. פלסמיד DNA הכנה אלקטרופורציה בתוך הרחם

1. עיצוב מספר RNAs סיכת ראש קצר (shRNAs) מיקוד או את רצף קידוד או את 3' UTR של גנים המועמד כפי שתואר לעיל²².
2. כדי למנוע מהמטרה אפקטים מבחן ירידה לפרטים shRNAs על ידי חיפוש הפיצוץ מול מסדי נתונים תוך שימוש בשיטות הרגילות. הכללת shRNAs מציג יותר מ-50% משלימים את החסר עם גנים אחרים חולדה.
3. שיבוט annealed oligonucleotides לתוך וקטור mU6-pro כפי שתואר לעיל²³.
4. לטהר פלסמיד DNA עם מקסי-הכנה לפי הנחיות היצרן ובצע ריכוז הסופי של µg 3/µL.
5. Aliquot 20 µl של ה-DNA (0.5 מ"ג/מ"ל pCAGGS-GFP גם לבד או עם 1.5 מ"ג/מ"ל של shRNA לבנות) ולהוסיף 2 µL הצום גרין דיי (2 מ"ג/מ"ל) כדי לאפשר מעקב ויזואלי של הזריקה.

5. בתוך הרחם אלקטרופורציה

1. הליך כירורגי
   1. עזים ומתנגד E15.5 בהריון חולדות נקבות (E0 מוגדר כהיום של אישור של הכנס הנרתיק זרע-חיוביים), באמצעות שילוב עם תערובת של קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים (0.1 ו- 0.01 מ"ג לכל הגוף משקל, בהתאמה), אשר ניתנת דרך בקרום הבטן זריקה עבור אינדוקציה הרדמה.
   2. ודא כי החיה הוא מורדם לחלוטין על ידי התבוננות היעלמותו של הבוהן קמצוץ רפלקס.
   3. גילוח הבטן התחתונה של החיה משתמשים בטלוויזיה כדי להסיר את הפרווה. לחטא את העור באמצעות קרצוף povidone יוד, אלכוהול 70%. החל וטרינר משחה על העיניים למניעת יובש בזמן תחת הרדמה.
   4. במקום החיה על מקור חום ושם תלוי סטרילי (עם חלון פתוח של 4-5 ס מ באמצע) על החתך. ללבוש מסכות, חלוק המעבדה, כובעים, כפפות כירורגי סטרילי. לשמור על עקרות עד הסוף של הניתוח.
   5. באמצעות מספריים חדות עושים חתך אנכי (2-2.5 ס מ) של העור לאורך האמצע בבטן סימטרית ולאחר מכן לבצע חתך של הקיר שריר מתחת לעור – גם של 2.5 ס מ — לאורך הקו האמצעי.
   6. בזהירות לחשוף אחד הרחם הקרן חלל הבטן. ירידה 37 ° C מראש ומחוממת רגיל תמיסת לחות את העוברים. לשמור על הרחם לח כל הזמן.
2. הזרקה של DNA ו אלקטרופורציה
   1. בעדינות להחזיק אחד של הקרניים הרחם עם מלקחיים מחויג ודחף בזהירות אחד העובר לדופן הרחם. להחזיק את העובר ביד אחת ועם את תותב יד אחרים בקפידה נימים זכוכית 1 מ מ האמצע לתוך החדר הלטראלי השמאלי (2-3 מ מ עמוקה) ולהזריק כ 1 µL של ה-DNA עם ירוק מהר כדי לאפשר חזותי ניטור באמצעות הזרקה microinjector.
   2. ירידה נורמלית תמיסת מלח על פני 3 x 7 מ מ² אלקטרודות. מניחים את האלקטרודה החיובית סטרילי בצד מוזרק (החדר הלטראלי השמאלי), סטרילי האלקטרודה השלילית על החדר הימני. לספק 5 פולסים חשמליים במרווחי זמן 950 ms עם דוושה שבשליטת רגל (לחייב 40 V עם electroporator קבל 4000 mF).
3. Post הליכים אלקטרופורציה
   1. תחזיר את הקרניים הרחם אל חלל הבטן, להוסיף טיפות של תמיסת מלח רגיל חלל כדי לאפשר עוברי מוצבים באופן טבעי יותר, להביא בחשבון פוסט ניתוחית לאיבוד נוזלים.
   2. סגור הקיר שריר הבטן בתפרים נספגים כירורגי, ואז העור בעזרת תפר פשוטה-הפרענו.
   3. לשים את החולדה בחזרה לכלוב ונטר החיה עד שייצא החוצה מן ההרדמה.
   4. לניהול כאב לנהל הבופרנורפין (0.03 נקודות מ"ג/ק"ג) לבעל-החיים על-ידי זריקה תת עורית כל ה 8-12, עבור עד 48 שעות.

6. הכנת הדוגמא המוח

1. שיטת קיבוע
   1. להקריב את החולדה בהריון 5 ימים לאחר הליך כירורגי באמצעות גז הרדמה (איזופלוריין) ואחריו תאמת צוואר הרחם מהירה.
   2. עושים חתך אנכי כדי לפתוח מחדש את חלל הבטן.
   3. לחשוף את הקרניים הרחם, להסיר את העוברים מן הרחם, לכרות אותם באמצעות מספריים חדות.
   4. מסירים את המוח עם מינימום נזק לרקמת: באמצעות מספריים חדות, עושים חתך קטן לאורך הצד האחורי (המוח הקטן) / ציר קדמי (נורות olfactive) של הראש כדי לחדור את העור ואת הגולגולת, ולאחר מכן שימוש זוג מלקחיים הקילוף הגולגולת כדי לחשוף המוח, להסיר אותו באמצעות מרית קטנה.
   5. לטבול המוח בין לילה ב 4 ° C ב- a 4% Paraformaldehyde 1 x פוספט תמיסת מלח Buffered (PBS).
2. המוח חלוקתה
   1. לשטוף את המוח ב- PBS 1 x 10 דקות.
   2. להטביע את המוח ב- 4% אגר פלסטיק והטבעה בתבניות.
      1. להכין 50 מ של 4% אגר ב- 1 x PBS הטבעה המוח העוברי 5. להבטיח את agarose מומס ב יותר מ 50 º C.
   3. לשמור על המוח ב- agarose כדי פולימריזציה במשך לפחות שעה ב 4 º C. להסיר את עודף agarose סביב המוח.
   4. הדבק את המוח ללוחית התחתונה vibratome, בכיוון הציר הקדמי/אחוריים של המוח הוא בניצב הלהב. המתן מספר דקות על הדבק לייבש מקום לצלחת עם המוח מודבק אל החדר vibratome.
   5. למלא את vibratome 1 x PBS. פורסים 100 מיקרומטר מקטעים עבה.
   6. העברת פרוסות המוח בשקופיות, להסיר עודפי נוזלים, להוסיף כמה טיפות של הרכבה בינונית, מקום של coverslip על המוח

7. קונאפוקלית הדמיה וניתוח כמותי

1. תן את יבש הרכבה בינונית למשך הלילה לפני הדמיה. התמונה סעיפים 10 X במיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר.
2. באמצעות תוכנה לניתוח תמונה כמותית, המירו את התמונה בתא 8 סיביות, בחר אחד נציג GFP חיובי פלורסנט ולהגדיר באופן ידני את צורתו. לשם כך, לחץ על "הערכה" וצייר את הגבול של התא בעזרת כלי הבחירה ביד חופשית. זה דרך הקוטר ואת עוצמת סף של התא נשמרות באופן אוטומטי על-ידי התוכנה.
3. לחץ על "חיפוש תאים" כדי לאפשר את התוכנה להתאים לשפה transfected תאים בכל רחבי קליפת המוח. לאחר מכן, אם יש צורך, להסיר באופן ידני תוצאות חיוביות שגויות.
4. לחלק כל עובי הקליפה 8 תחומי עניין מנורמל במקטעים בודדים. כדי להשיג זאת, לחץ על "אזור כלי", בחר 8 "אזור פסים" איפה הראשון (1) והאחרונה (8) פסים תואמים את VZ וכדי העליון של CP בהתאמה. לחץ על "החל" כדי לאפשר את התוכנה לספור את המיקום היחסי של GFP transfected תאים בקליפת שלם. ולבסוף ללחוץ על "שמור כימות" לייצא את הנתונים בקובץ Excel לניתוח.

תוצאות

האסטרטגיה הניסיונית נועדה לזהות גנים סיבתי הרומן של MCD היא recapitulated באיור1.

על ידי ביצוע מערך-CGH במדגם של 155 חולים עם הפרעות התפתחותיות במוח variably המשלב PNH (איור 2 א), כפיס המוח dysgenesis, colpocephaly, אסטרוציטומה hypoplasia and polymicrogyria הקשור?...

Discussion

MCDs הם גורמים חשובים מוגבלות ועל חשבון עבור 20-40% של הילדות עמידים לתרופות-אפילפסיה-^1,-². עניין MCDs גדל באופן דרמטי בעשור האחרון בשל שני גורמים עיקריים. הראשון הוא השיפור המוח הדמיה (MRI במיוחד), מה שמאפשר רופאים ומדענים לדמיין הרבה מומים המוח לא הכיר קודם לכן. השני ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Picospritzer III	Parker Hannifin Corp	P/N 051-0500-900	Intracellular Microinjection Dispense Systems
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252	Fast green allow visual monitoring of the injection
BTX ECM 830 electroporator	BTX Harvard Apparatus	45-0002	The ECM 830 is a Square Wave Pulse generator designed for in vitro and in vivo applications
Microtome HM 650 V	Microm	10076838	Microtome HM 650 V vibratome 240V 50/60Hz with vibrating blade
FluoView 300	Olympus		The Olympus FluoViewTM 300 is a point-scanning, point-detection, confocal laser scanning microscope designed for biology research application
eCELLence software	Glance Vision Technologies		eCELLence is software designed for the quantitive analysis of cell migration
Agilent Microarray Scanner Bundle			Array slides
for 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K or 8 x 15K	Agilent	Agilent p/n G4900DA, G2565CA or G2565BA
for 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K or 8 x 60K	Agilent	Agilent p/n G4900DA or G2565CA
Hybridization Chamber, stainless	Agilent	Agilent p/n G2534A	Chamber for array CGH hybridization
Hybridization Chamber gasket slides, 5-pack			Gasket for array CGH hybridization
for 1-pack microarrays or	Agilent	Agilent p/n G2534-60003
for 2-pack microarrays or	Agilent	Agilent p/n G2534-60002
for 4-pack microarrays or	Agilent	Agilent p/n G2534-60011
for 8-pack microarrays	Agilent	Agilent p/n G2534-60014
Hybridization oven	Agilent	Agilent p/n G2545A
Hybridization oven rotator for Agilent Microarray Hybridization Chambers	Agilent	Agilent p/n G2530-60029
Thermal cycler with heated lid	Agilent	Agilent p/n G8800A or equivalent	Termal cycler for incubations
1.5 mL RNase-free Microfuge Tube	Ambion	p/n AM12400 or equivalent	Microcentrifuge
Magnetic stir bar	Corning	p/n 401435 or equivalent	Instrument for stirring
Qubit Fluorometer	Life Technologies	p/n Q32857	Instrument for DNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit, for use with the Qubit fluorometer	Invitrogen	p/n Q32850	Kit for Qubit fluorometer
UV-VIS spectrophotometer	Thermo Scientific	NanoDrop 8000 or 2000, or equivalent	Instrument for DNA quantification
P10, P20, P200 and P1000 pipettes	Pipetman or equivalent		DNA dispensation
Vacuum Concentrator	Thermo Scientific	p/n DNA120-115 or equivalent	Instrument to concentrate DNA
SureTag Complete DNA Labeling Kit	Agilent	p/n 5190-4240	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
Purification Columns (50 units)	Agilent	p/n 5190-3391	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
AutoScreen A, 96-well plates	GE Healthcare	p/n 25-9005-98	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
GenElute PCR Clean-Up Kit	Sigma-Aldrich	p/n NA1020	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
Human Genomic DNA		p/n G1521	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
For CGH microarrays:	Promega	(female) or p/n G1471 (male)	Array CGH control DNA
For CGH+SNP microarrays:	Coriell	p/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878, or NA18579	Array CGH control DNA
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer Kit or	Agilent	p/n 5188-5226	Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and	Agilent	p/n 5188-5221	Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2	Agilent	p/n 5188-5222	Array CGH hybridization and wash
Stabilization and Drying Solution	Agilent	p/n 5185-5979	Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit	Agilent	p/n 5188-5220 (25) or p/n 5188-5380 (100)	Array CGH hybridization and wash
Human Cot-1 DNA	Agilent	p/n 5190-3393	Array CGH hybridization and wash
Agilent C scanner	Agilent		Scanner for array CGH slides
SureSelect XT2 Reagent Kit			Kit for target enrichment
HiSeq platform (HSQ), 16 Samples	Agilent	p/n G9621A
HiSeq platform (HSQ), 96 Samples	Agilent	p/n G9621B
HiSeq platform (HSQ), 480 Samples	Agilent	p/n G9621C
MiSeq platform (MSQ), 16 Samples	Agilent	p/n G9622A
MiSeq platform (MSQ), 96 Samples	Agilent	p/n G9622B
MiSeq platform (MSQ), 480 Samples	Agilent	p/n G9622C
DNA 1000 Kit	Agilent	p/n 5067-1504	Kit for the separation, sizing and quantification of dsDNA fragments from 25 to 1000 bp.
High Sensitivity DNA Kit	Agilent	p/n 5067-4626	Kit for analysis of fragmented DNA or DNA libraries.
AMPure XP Kit			Kit for automated PCR purification.
5 mL	Agencourt	p/n A63880
60 mL	Agencourt	p/n A63881
450 mL	Agencourt	p/n A63882
Dynabeads MyOne Streptavidin T1			Isolation and handling of biotinylated nucleic acids
2 mL	Life Technologies	Cat #65601
10 mL	Life Technologies	Cat #65602
Quant-iT dsDNA BR Assay Kit, for the Qubit fluorometer			DNA quantification
100 assays, 2-1000 ng	Life Technologies	Cat #Q32850
500 assays, 2-1000 ng	Life Technologies	Cat #Q32853
Qubit assay tubes	Life Technologies	p/n Q32856	DNA quantification
SureSelec tXT2 Capture Libraries	Agilent	depending on the experiment	Kit for libraries capture
SureCycler 8800 Thermal Cycler	Agilent	p/n G8800A	DNA amplification
96 well plate module for SureCycler 8800 Thermal Cycler	Agilent	p/n G8810A	DNA amplification
SureCycler 8800-compatible 96-well plates	Agilent	p/n 410088	DNA amplification
Optical strip caps	Agilent	p/n 401425	DNA amplification
Tube cap strips, domed	Agilent	p/n 410096	DNA amplification
Compression mats	Agilent	p/n 410187	DNA amplification
2100 Bioanalyzer Laptop Bundle	Agilent	p/n G2943CA	DNA amplification
2100 Bioanalyzer Electrophoresis Set	Agilent	p/n G2947CA	DNA amplification
Covaris Sample Preparation System, E-series or S-series	Covaris		DNA shearing
Covaris sample holders		p/n 520078	DNA shearing
Nutator plate mixer	BD Diagnostics	p/n 421105 or equivalent	Plate Mixer
GaIIx	Illumina		next generation sequencing machine