Dizi-CGH, Bütün exome sıralama ve rahim içinde elektroporasyon Rodents beyin malformasyonlar için sorumlu genlerin tanımlamak için birleştirerek yeni bir strateji

Özet

Periventriküler Nodüler Heterotopya (PNH) malformasyonu kortikal gelişim (MCD) en sık görülen yetişkinlikte ama genetik temeli en dağınık durumda bilinmeyen kalır. Biz son zamanlarda roman aday genler MCD'ler için tanımlamak için ve doğrudan kendi etken rol içinde vivoonaylamak için bir strateji geliştirdik.

Özet

Serebral korteks dahil doğum kusurları — kortikal geliştirme (MCD) olarak da bilinen Ekstremite Malformasyonlari — önemli Fikri Engellilik ve ilaca dirençli epilepsi % 20-40 için Çocukluk nedenleri. Yüksek çözünürlüklü beyin görüntüleme MCD fenotipleri büyük bir grup tanımlaması içinde vivo kolaylaştırdı. Beyin görüntüleme, genomik analiz ve hayvan modellerin üretimi gelişmeler rağmen sistematik olarak aday genler öncelik ve sözde mutasyonlar fonksiyonel etkilerini sınamak için basit bir iş akışı yok. Bu sorunu çözmek için kimliği roman sorumlu genlerin MCD etkinleştirme deneysel bir strateji geliştirdi doğrulanmış ve. Bu strateji tanımlayıcı aday genomik bölgeler veya genlerin yolu ile dizi-CGH ya da bütün exome sıralama ve onların inactivation veya overexpression içinde utero üzerinden kemirgen beyin geliştirme belirli mutasyonların etkileri karakterize dayanır elektroporasyon. Bu yaklaşım bir sözde veziküler protein, periventriküler Nodüler Heterotopya, arızalı nöronal göç neden bir MCD patogenezinde için kodlama C6orf70 gen tanımlaması yol açtı.

Giriş

Serebral korteks bilişsel ve entelektüel işlemlerinde önemli bir rol oynar ve duygusal kontrolü yanı sıra öğrenme ve hafıza ilgilenmektedir. Bu nedenle birçok nörolojik ve psikiyatrik hastalıklar kortikal geliştirme (MCD) Ekstremite Malformasyonlari neden şaşırtıcı değil. MCD etyolojisinde alınan her ikisi de beri karmaşıktır ve genetik faktörler söz konusu. MCD genetik olarak belirlenen oranda toplu yaygınlığı yaklaşık % 2 ve çoğu durumda tek tük. Örneğin, konjenital beyin dysgenesis insidansı insan nüfusunun % 1 daha yüksek olarak tahmin edildi ve bazı türlerinin MCD epilepsi olan tüm hastalarda % 14'den fazla ve ciddi veya dirençli epilepsi^1, % 40 oranında gözlenir ².

Periventriküler Nodüler Heterotopya (PNH) en yaygın MCD'ler biridir ve sinir hücreleri anormal geçiş tarafından gelişmekte olan serebral korteks ventrikül bölgesinden (VZ) neden olur. Kümeleri sonuçlarında heterotopik nöronların genellikle manyetik rezonans görüntüleme (MRG) kullanarak görüntülenir lateral ventriküllerin duvarları boyunca göç nöronların hatası. Klinik, anatomik ve görüntüleme PNH heterojen bulunuyor. Nodüller küçük ve tek taraflı bilateral ve simetrik aralığı. Ortak klinik sekeller epilepsi ve fikri Engelli³içerir. Xq28 haritalar, Filamin A (veya FLNA) gen mutasyonlar ikili PNH X'e aileleriyle % 100 ve % 26 sporadik hastalar^3,4bulundu. 20q13 haritalar, ARFGEF2 gen mutasyonlar neden PNH nadir, resesif şeklinde iki düşündürmekteyse aileler⁵' te bildirilmiştir. Son zamanlarda, biallelic Reseptör-ligand cadherin çift DCHS1 ve FAT4 kodlama genlerdeki mutasyonlar PNH⁶içerir bir multisystemic bozukluğu tarafından etkilenen dokuz hastalarda tespit edilmiştir. PNH Ayrıca ile ilişkili kırılgan X Sendromu⁷, Williams Sendromu⁸, 22q11 microdeletion Sendromu⁹, 5 p 15¹⁰mükerrer, 1 p 36¹¹, 5q14.3-S15¹², 6 p 25^{13 silme} ve ek sorumlu genlerin dağılmış düşündüren 6q terminal silme Sendromu^{14,15,16,17,18,19}, genom. Ancak, sporadik PNH hastaların yaklaşık % 74'genetik temeli aydınlatılmamıştır¹⁷gerekmektedir.

Dizi Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (dizi-CGH) kanıtlanmış gibi Ancak, alt mikroskobik kromozom anormallikleri, bu yaklaşımı kullanarak tanımlanan genomik bölgelerin tespiti için güçlü araçlardır olmak klasik gen eşleme yaklaşımlar genellikle büyük ve çok sayıda gen içerir.

Büyük paralel sıralama teknikleri (Yani bütün Exome sıralama (WES) ve bütün-genom sıralama (WGS)) gelişiyle maliyeti ve tüm insan exome veya genom sıralamak için gereken süreyi önemli ölçüde azalttı. Yine de, WES ve WGS veri yorumlanması için veri süzme gelen her hastaya onlarca, yüzlerce (veya hatta binlerce çözümleme türüne bağlı olarak,) türevleri ortaya beri çoğu durumda, zorlu kalır.

Roman MCD sorumlu genlerin, dizi-CGH birleştiren bir roman sistematik Strateji belirleme işlemini hızlandırmak için aday genler WES ve rahim içinde elektroporasyon (orijinal) tarama tasarlanmıştır. EKOSEM seçime bağlı olarak devre dışı bırakın (veya overexpress) belirli genler veya mutasyonlar kemirgen beynindeki corticogenesis^18,19onların katılımı hızlı değerlendirilmesi etkinleştirme sağlar. RNAi aracılı nakavt veya overexpression bir veya daha fazla aday gen gen hastalığı geliştirme, nöronal göç ve/veya olgunlaşma yerelleştirilmiş kusurları ile ilişkili olduğunda neden beklenir. Kimin inactivation (veya overexpression) Rodents hastalarda gözlenen fenotip üretir bir gen kimlik, bu MCD sporadik hastalarda tarama için olağanüstü bir aday haline gelir. Bu yaklaşımı kullanarak, biz son zamanlarda C6orf70 gen (olarak da bilinen ERMARD) çok önemli katkı 6q27 kromozom silme işlemleri¹⁶barındırmaktan hastalarda PNH patogenezinde ortaya koydu.

Protokol

Etik beyanı: Wistar fareler çiftleş, muhafaza ve Fransızca ve Avrupa Birliği mevzuatı ile anlaşma INMED hayvan tesislerinde kullanılan.

1. DNA ekstraksiyon ve miktar dizi-CGH ve WES için

1. Genomik DNA (gDNA) insan kanı lökosit otomatik bir DNA izolasyon robot veya üreticinin protokolüne göre piyasada bulunan el ile DNA ekstraksiyon Kitleri kullanarak hastaların ayıklamak. Tüm örnekleri bir Spektrofotometre kullanarak ölçmek.

2. dizi-CGH Protokolü

1. GDNA kısıtlama hazım
   1. Bir hasta ve 37 ° C'de 2 h için ticari olarak mevcut insan kontrolü DNA RsaI ve AluI ile saf gDNA çift ng Özet 500 10 U/μL enzim 0.5 μl her reaksiyon için kullanın. 20 dk 65 ° c enzimler devre dışı bırakın ve buz için örnek tüpler taşımak için kuluçkaya.
2. Örnek etiketleme
   1. Random primerler Mikroarray biçiminde her tepki tüp (örneğin 5 µl 1-pack, 2 paket ve 4-pack microarrays için) kullanmak için gerekli uygun hacmi ekleyin. De yukarı ve aşağı yavaşça pipetting tarafından karıştırın.
   2. Örnek tüpler için termal cycler aktarın. 95 ° C 3 dakika ve daha sonra 4 ° C 5 min için kuluçkaya.
   3. Bir siyanür 3 ve bir siyanür 5 hazırlamak aşağıdaki birimler karıştırma tarafından buz üzerinde etiketleme Master Mix: 10,0 µl 5 X reaksiyon arabellek, 5.0 µl 10 x dNTPs, 3.0 µl siyanür 3-dUTP veya siyanür 5-dUTP ve 1.0 µl Exo (-) Klenow enzim, 2.0 µl nükleaz ücretsiz su. Mikrodizi biçimine göre her reaktif hacmi kullanımda seçin.
   4. Etiketleme Master Mix gDNA içeren her tepki tüp ekleyin. De hafifçe yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın.
   5. Örnek tüpler için termal cycler aktarmak ve 37 ° c 2 h, 10 dk 65 ° C için kuluçkaya ve örnekleri 4 ° C'de korumak
3. Etiketli gDNA arıtma
   1. 1 x TE (pH 8.0) 430 µl her tepki tüp ekleyin.
   2. Arıtma sütun 2 mL koleksiyonu tüpler içine yerleştirin ve sütunları uygun şekilde etiketleyin. Yük her bir arıtma sütuna gDNA etiketli.
   3. 14.000 x g oda sıcaklığında bir microcentrifuge içinde vasıl 10 dk santrifüj. Akışı aracılığıyla atın ve sütun 2 ml koleksiyonu tüpe geri yerleştirin.
   4. 1 x TE (pH 8.0) 480 µL her bir sütun ekleyin. 14.000 x g oda sıcaklığında bir microcentrifuge içinde vasıl 10 dk santrifüj. Akışı aracılığıyla atın.
   5. Sütun bir taze 2 mL toplama tüp ve bir microcentrifuge saf örnek toplamak için oda sıcaklığında 1000 x g, 1 dk santrifüj tersine çevirin.
   6. Numune hacmi 1 x TE (pH 8.0) ekleme veya yoğunlaştırıcı kullanarak kullanım Mikroarray biçiminde için istenen getirmek. Örneğin, 1-pack Mikroarray getirmek için birimin 80,5 µL. için örnek 5 min için buz üzerinde kuluçkaya ve sonra yukarı ve aşağı 10 kez çözüm pipette.
4. Hibridizasyon için etiketli gDNA hazırlanması
   1. Test ve referans örnekleri uygun siyanür 5 etiketli sample ve siyanür 3 etiketli bir taze 1,5 mL RNase free tüpü kullanarak birleştirin. 1-pack Mikroarray emin olmak için son hacim Örneğin, 158 µL. Mikroarray biçimine göre her örnek hacmi kullanımda seçmektir.
   2. Bir Spektrofotometre verim, A260 nm (DNA), A550 nm (siyanür 3) ve A650 nm (siyanür 5) Absorbans ölçme tarafından etiketleme veya belirli etkinlik derecesini ölçmek için kullanın.
      1. Verim formülü kullanarak hesaplar: [DNA concentration(ng/µl) numune hacmi (µl) x] / 1000 (ng/µg). Özel faaliyet formülü kullanarak hesaplar: boya/µg gDNA µl başına µl başına pmol.
         Not: Örneğin, için 0,5 µg giriş DNA verimi 8-11 µg olmalıdır ve siyanür-3 örnek ve 20-35 siyanür-5 etiketli örnek için etiketli için belirli aktivite (pmol/µg) 25-40 olmalıdır.
   3. Hibridizasyon Master Mix Mikroarray biçimi kullanmak için gerekli miktarda hazırlamak için aşağıdaki reaktifler mix: 50 µL karyolası-1 DNA (1,0 mg/ml), 52 µL 10 x aCGH engelleme aracı ve 260 µl 2 x HI-RPM hibridizasyon arabellek.
   4. Hibridizasyon Master Mix uygun hacmi Mikroarray biçimi kullanmak için gerekli toplam hacmi elde etmek için etiketli gDNA içeren 1,5 ml RNase free tube ekleyin. Örneğin, 1 paket Mikroarray için her reaksiyon için son hacim 362 µl olduğundan emin olun.
   5. Yukarı ve aşağı, pipetting tarafından örnek mix sonra hızlı bir şekilde de 14,000 x g santrifüj kapasitesi ve 3 min 95 ° c ve 30 dk 37 ° C'de için kuluçkaya.
5. Chambers'ı derleme ve hibridizasyon
   1. Temiz conta slayt odası üsse doğru yukarı bakacak şekilde ve odası Bankası dikdörtgen bölümünü ile uyumlu conta etiketini yükleyin. Conta slayt odası tabanı ile aynı hizada ve açık olmadığından emin olun.
   2. Hibridizasyon örnek karışımı örnek eşit şekilde dağıtılır emin conta iyi dağıtmak.
   3. Mikrodizi slayt conta slayt yerine sandviç çifti düzgün uyumlu değerlendirilmesi üzerine koy. Ardından, kapak gözükeceksin slaytlar koyarak ve el sıkma pensi tepki odası bir araya getirin.
   4. Dikey olarak birleştirilmiş odası döndürerek ıslatma slaytlar olun. Kabarcıklar odasında mevcut olmadığından emin olun. Gerekirse, derleme sert bir yüzey üzerinde sabit kabarcıklar taşımak için dokunun.
   5. 20 devir / dakikada döndürmek için kurulmuş bir rotator rafa monte slayt odaları koymak. Hibridizasyon odası fırına koyar ve hibridizasyon 65 ° C'de 24-40 h kullanımda Mikroarray biçimine göre gerçekleştirmek.
6. Mikrodizi çamaşır ve tarama
   1. Hibridizasyon odası fırından alın ve 1 yıkama arabellekte daldırın. Onun demontaj için devam edin.
   2. Mikrodizi slayt kaldırın ve hızlı yıkama arabellek 1 oda sıcaklığında bir slayt rafa içine koymak.
   3. Dizi slayt ile (kullanım bir bit ve bir manyetik karıştırıcı) karıştırarak 5 dakika yıkayın. Çok güçlü karıştırma ama iyiye gitmeye karıştırıcı hızı 4 (Orta hızda), ayarı için ayarlayın.
   4. 90 s karıştırma için yıkama tampon 2 dizi slayt yıkayın. Yavaşça (o ortaya kuru) arabelleğinden slaydı yeniden elde etmek ve bir slayt tutucu bir slayt koruyucusu yardımıyla içine yükleyin.
   5. Slayt dizi tarayıcıya yüklemek ve dizi üretici yönergelerine göre tarama gerçekleştirin.
   6. Ayıklama yazılım üreticisinin yönergeleri (V.9.1.3.1) doğrultusunda kullanılan tarayıcı ile sağlanan kullanarak sonuçları çözümleyebilirsiniz.

3. WES Protokolü

1. Hedef zenginleştirme
   1. DsDNA BR tahlil gDNA örnek enstrüman protokolüne göre konsantrasyonu belirlemek için kullanın.
   2. Kaliteli Çift Kişilik iplikçik DNA 5 µg 1 x 50 µL toplam hacmi 1.5 mL düşük bağlama tüpte arabellekte düşük TE sulandırmak.
   3. Bir sonicator kadar ayarlayın ve bir microtube üreticinin yönerge göre yükleme ve boşaltma istasyonu içine koymak. Kap tüp üzerinde tutun.
   4. Yavaş yavaş 50 µl DNA örneği üzerinden önceden bölünmüş septa kabarcıklar tanıtımı olmadan aktarın.
   5. Sonicator'ın üretici tarafından önerilen ayarlara göre DNA kesme ve üreticinin yönerge göre bir Bioanalyzer kullanarak kalitesini değerlendirmek. DNA parçası boyutu 150 ila 200 hedeftir bp.
2. DNA tamiri biter
   1. Son onarım tepki Mix son onarım Oligo Mix 10 µL ile 40 µL son onarım enzim karışımı karıştırarak hazırlayın. Bir girdap karıştırıcı iyi karıştırın.
   2. 30 dk içinde termal cycler için 20 ° C'de örnekleri kuluçkaya ve sonra onları 4 ° C'de Isıtmalı bir kapak kullanmayın.
   3. Son onarım tepki her 50 µL 3.2.1. adımda hazırlanan Mix 50 µL DNA örneği de güdülmesini ekleyin. De yukarı ve aşağı pipetting veya hafif vortexing karıştırın.
   4. Örnek üretici protokolüne göre göre boncuk arıtma kiti ile arındırmak.
3. Poliadenilasyon 3' biter.
   1. DA-takip Master Mix 20 µl her sonunda tamir, saf DNA örneği için (yaklaşık 20 µL) ekleyin.
   2. De yukarı ve aşağı pipetting veya hafif vortexing karıştırın.
   3. Termal cycler 37 ° C'de örnekleri kuluçkaya ve sonra 4 ° C'de tutun Isıtmalı bir kapak kullanmayın.
4. Tüp ligasyonu yakalama öncesi dizin oluşturma bağdaştırıcısının.
   1. Tüp ligasyonu Master Mix 5 µL her A kuyruklu DNA örneği ekleyin.
   2. 5 µL uygun yakalama öncesi dizin çözüm her örnek için ekleyin.
   3. Kuyuları mühür ve 5 kısaca santrifüj örnekleri s.. için vortexing tarafından iyice karıştırın.
   4. 15 dakika içinde bir termal cycler 20 ° C'de örnekleri kuluçkaya ve 4 ° C'de basılı tutun Isıtmalı bir kapak kullanmayın.
   5. Üretici protokolüne göre göre boncuk arıtma kiti ile örnekleri arındırmak.
5. Dizin oluşturulmuş Kütüphane amplifikasyon.
   1. Yakalama öncesi PCR reaksiyon mix uygun hacmi 1 µL astar mix ve 25 µL PCR Master Mix karıştırarak hazırlayın. Bir girdap karıştırıcı iyi karıştırın.
   2. 26 µL PCR plaka ayrı Wells amplifikasyon karışımı ve her dizin oluşturulmuş gDNA Kütüphane örneğinin 24 µL birleştirir.
   3. PCR programı çalıştırmak ile ertesi gün merdiven: 98 ° C için 2 dk 5 döngüleri için 30 98 ° C'de s, 30 60 ° C s ve 72 ° C 1 min ve 10 dakika süreyle 72 ° C'de son bir uzantısı için tutun örnekleri 4 ° C'de
   4. Örnek üretici protokolüne göre göre boncuk arıtma kiti ile arındırmak.
   5. Üretici protokolüne göre bir Bioanalyzer kalitesiyle değerlendirmek.
6. Hibridizasyon için dizin oluşturulmuş DNA örneklerinin havuzu oluşturma
   1. Her yakalama tepki havuzu için her dizin oluşturulmuş gDNA Kütüphane örnek bir iyi bir PCR plaka uygun hacmi birleştirin. Örneğin, insan veya fare All-Exon kitaplıklar yakalamak için 187.5 kullanarak havuzu başına 8 kitaplıkları birleştirmek ng dizin oluşturulmuş her Kütüphane. Her final yakalama tepki havuzu 1500 içerdiğinden emin olun dizin oluşturulmuş gDNA ng.
   2. Her birim için azaltmak < 7 µL vakum yoğunlaştırıcı kullanarak. Tamamen örnek kurutma önlemek.
   3. Yeterli su nükleaz ücretsiz son iyi hacim 7 µL ve girdap sonra gDNA şiddetle için sıvı kuyu dibinde toplamak için bir santrifüj veya mini plaka spinner 30 s. santrifüje içeren plaka getirmek için her konsantre gDNA havuzu ekleyin.
7. GDNA Kütüphane havuzları yakalama kitaplığına hibridizasyon
   1. Her 7 µL dizine gDNA havuzu Mix engelleme 9 µl ekleyin. Yukarı ve aşağı pipet karıştırmak için.
   2. Kuyuları kap, gDNA termal cycler için içeren mühürlü plaka ve 5 min için 95 ° C'de kuluçkaya, daha sonra 65 ° C'de tutun Plaka için en az 5 dk 65 ° C'de tutulur emin olun.
   3. Yakalama Kütüphane boyutu temelinde RNase blok, seyreltme uygun hazırlamak (%10 seyreltme kitaplıkları < 3.0 Mb ve %25 seyreltme için kitaplıklarına > için 3,0 Mb).
   4. Yakalama Kütüphane büyüklüğüne göre yakalama Kütüphane uygun miktarda birleştirin ve RNase blok çözüm buz tuttu bir PCR plaka oranında seyreltin. De pipetting tarafından karıştırın. Yakalama kitaplıkları için < 3,0 Mb, kullanım 2 µl Kütüphanesi ve RNase blok 5 µL % 10 seyreltme. Yakalama kitaplıkları > 3,0 Mb, kullanım 5 µl Kütüphanesi ve RNase blok 2 µl %25 seyreltme olarak.
   5. Hibridizasyon arabelleği 37 µL Kütüphane/RNase blok yakalamak Mix 7 µL içeren her şey ekleyin. De pipetting tarafından mix ve kısaca karışımı içeren plaka santrifüj kapasitesi.
   6. GDNA havuzu plaka 65 ° c adımında de gDNA havuzu plaka 3.7.5 her örnek için tüm 44 µL Kütüphane yakalama karışımı aktarmak için bir çok kanallı pipet kullanırken korumak. De yavaş yavaş aşağı yukarı 8-10 kez pipetting tarafından karıştırın.
   7. Kuyu kubbeli şerit Kapakları kapatın. Bütün wells tamamen mühürlü emin olun. Bir sıkıştırma mat termal cycler PCR plaka üzerine getirin.
   8. Hibridizasyon karışımı için 65 ° C'de 24 saat kuluçkaya Not: Örnekleri en fazla 72 saat için melezleşmiştir, ancak genişletilmiş hibridizasyon geniş buharlaşma örnek wells neden olmaz doğrulamanız gerekir.
8. Manyetik boncuklar streptavidin kaplı hazırlanması
   1. Bir su banyosu veya sıcak bir blok içinde 65 ° C'de yıkama arabellek 2 prewarm.
   2. Şiddetle Streptavidin manyetik boncuklar bir girdap Mikser resuspend. Manyetik boncuklar depolama sırasında yerleşmek.
   3. Hibridizasyon örnekleri için resuspended boncuk 50 µL PCR plaka wells için ekleyin.
   4. Boncuk yıkama ve onları bağlayıcı arabelleğe 200 µL içinde resuspend.
9. Streptavidin boncuk kullanarak melezleşmiştir DNA'sı yakalamak.
   1. Tahmin ve kayıt sonra 24 saat kuluçka kalır hibridizasyon çözüm hacmi.
   2. Hibridizasyon plaka 65 ° C'de korumak ve yıkanmış streptavidin boncuk 200 µL içeren plaka wells için her hibridizasyon karışımı tüm birimi (yaklaşık 60 µL) aktarmak için bir çok kanallı pipet kullanın. De yavaş yavaş aşağı yukarı 3-5 kere pipetting tarafından karıştırın.
   3. Kuyuları kap ve yakalama plaka Nutator Mikser veya oda sıcaklığında 30 dk için eşdeğer üzerinde kuluçkaya. Örnekleri düzgün wells karıştırma emin olun.
   4. Kısaca bir santrifüj veya mini plaka spinner yakalama plaka santrifüj kapasitesi.
   5. Boncuk süspansiyon toplamak için bir manyetik Separator yakalama plaka koymak. Kaldırmak ve süpernatant atın.
   6. Boncuk yıkama arabellek 1 200 µL içinde resuspend. Boncuk tamamen resuspended kadar yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın.
   7. Kısaca santrifüje santrifüj veya mini plaka getiriyor.
   8. Plaka manyetik ayırıcısı olarak koymak.
   9. Temizleyin, sonra kaldırmak ve süpernatant atmak çözüm için bekleyin.
10. Sonrası için çoğaltılmış sıralama işleme örnek yakalama
    1. Aşağıdaki karıştırılarak PCR reaksiyon karışım uygun hacmi hazırlamak: 9 µL nükleaz ücretsiz su, 25 µL astar Arttırımlar sayısına göre Mix Master Mix ve 1 µL. İyi bir girdap Mikser kullanarak mix ve buz üzerinde tutun.
    2. Her amplifikasyon tepki için adım 3.10.1 PCR reaksiyon karışımı 35 µL PCR plaka wells yerleştirin.
    3. Pipet her yukarı ve aşağı boncuk süspansiyon homojen olduğundan emin olmak için boncuk bağlı yakalanan Kütüphane havuzu örnekleri.
    4. Her yakalanan Kütüphane havuzu boncuk süspansiyon, 15 µL de uygun PCR reaksiyon karışıma ekleyin. Boncuk süspansiyon homojen olana pipetting tarafından iyice karıştırın.
    5. Point 3.10.2 termal cycler içinde hazırlanan tabak yerleştirin ve aşağıdaki PCR güçlendirme programı çalıştırın: 98 ° C için 2 dk, 8-11 devredir 98 ° C'de 30 s, 60 ° C 30 s ve 72 ° C için 1 dakika takip 10 dk 72 ° C'de son bir uzantısı tarafından. Örnekleri 4 ° C'de tutun
    6. Örnek bir boncuk dayalı saflaştırma üretici protokolüne göre ile arındırmak.
    7. Üretici protokolüne göre bir Bioanalyzer kalitesiyle değerlendirmek.
11. Örnekleri sıralama multiplexed için hazırlayın
    Not: Havuzları kütüphanelerin Kütüphane yakalama boyutunu esas alarak ve strateji havuzu yakalama öncesi çıkan 8 veya 16 dizin oluşturulmuş, son zenginleştirilmiş örnekleri içerir. Bir tek sıralama şeritte multiplexed dizin oluşturulmuş kitaplıklar toplam sayısı platformu, sıralama veri yakalama Library için gerekli miktarı ile birlikte kullanılan ve çıkış özellikleri tarafından belirlenir.
    1. Lane birleştirilebilir dizin sayısı platform kapasiteye göre hesaplar. Bir tek sıralama şeritte multiplexed dizin oluşturulmuş kitaplıklar toplam sayısı platformu, sıralama veri yakalama Library için gerekli miktarı ile birlikte kullanılan ve çıkış özellikleri tarafından belirlenir. Örneğin, insan bütün Exon v5 kitaplığı için önerilen sıralama veri dizini Kütüphane başına 4 Gb ve önerilen sıralama veri yakalama öncesi havuzu başına 32 Gb (8-dizin havuzları).
12. Kütüphaneler sıra.
    1. Seçim sonraki nesil sıralama platformda kitaplık yükleme ve enstrüman özelliklerine göre çalıştırmak sıralama gerçekleştirin.
13. Exome sıralama veri analiz.
    1. Boru hattı ve temel arama için yazılım çalıştırın. Örneğin, silindir okunma²⁰harita, Picard ile (http://broadinstitute.github.io/picard/) Yinelenenleri kaldırmak ve tek nükleotid polimorfizmleri ve ekleme veya silme (indels) üslerinin Platypus²¹ile tanımlamak için kullanın. Eşanlamlı türevleri ve bu bir gen frekansta gözlenen filtre < %5 ve de novo türevlerini tanımlamak için ebeveyn exomes gelen verilerle karşılaştırın.

4. plazmid DNA hazırlık rahim içinde adım için

1. Tasarım kodlama dizisi veya 3' UTR²²daha önce açıklandığı gibi aday gen hedefleyen birkaç kısa saç tokası RNA'ların (shRNAs).
2. Hedeften uzak önlemek için etkileri shRNAs özgüllük patlama arama standart yöntemlerle veritabanları karşı sınayın. Diğer fare genler ile tamamlayıcılık fazla % 50 görüntüleme shRNAs hariç.
3. Tavlanmış klon oligonucleotides mU6-pro vektör olarak içine daha önce²³açıklanan.
4. Plazmid DNA ile üreticinin yönergelerine uygun bir Maxi-prep arındırmak ve 3 µg/µL son bir konsantrasyon olun.
5. Aliquot 20 µl DNA (0,5 mg/ml pCAGGS-ya tek başına veya 1.5 mg/ml shRNA ile inşa GFP) ve hızlı 2 µL eklemek yeşil görsel enjeksiyon izleme izin vermek için boya (2 mg/mL).

5. rahim içinde elektroporasyon

1. Cerrahi müdahale
   1. Ketamin/xylazine karışımı ile bir arada kullanarak (e0'ın onay sperm pozitif vajinal fiş gün tanımlanmış) E15.5 hamile dişi rats, anestezi (0.1 ve 0.01 mg-vücut ağırlığı, sırasıyla), hangi bir mayi yolu ile verilir anestezik indüksiyon için enjeksiyon.
   2. Hayvan tam ayak çimdik refleks kaybolması gözlemleyerek anestezi emin olun.
   3. Hayvanın alt karin kürk kaldırmak için bir kesme makinesi kullanarak tıraş. Deri önlük povidone-iyot ve % 70 alkol kullanarak dezenfekte. Veteriner merhem gözleri kuruluk anestezi iken altında önlemek için uygulayın.
   4. Hayvan bir ısı kaynağı yerleştirin ve steril örtü (ile açık bir pencere ortasında 4-5 cm) kesi sitesi üzerinden koymak. Facemasks, laboratuvar önlüğü, kapaklar ve steril cerrahi eldiven giymek. Kısırlık ameliyatı sonuna kadar korumak.
   5. Kaudal karın orta çizgi boyunca cilt dikey kesi (2-2,5 cm) yapmak ve deri altındaki kas duvarının bir kesi yapmak keskin makas kullanarak — Ayrıca 2,5 cm, — orta çizgi boyunca.
   6. Dikkatle karın boşluğu üzerinden bir rahim boynuz ortaya çıkarmak. Embriyo nemlendirmek 37 ° C Önceden ısıtılmış normal tuzlu eriyik-e doğru damla. Rahim sürekli nemli tutmak.
2. DNA ve elektroporasyon enjeksiyon
   1. Yavaşça rahim boynuzları biri halkalı Forseps ile tutun ve bir embriyo rahim duvarına dikkatle itin. Embriyo bir yandan ve diğer el eklemek ile dikkatli bir şekilde cam kılcal orta hat üzerinden 1 mm sol lateral ventrikül (2-3 mm derin) tutun ve yaklaşık 1 µL enjeksiyon kullanarak görsel izleme izin vermek için hızlı yeşil ile DNA enjekte bir microinjector.
   2. Normal tuzlu çözüm 3 x 7 mm² elektrotlar yüzey üzerinde bırak. (Sol lateral ventrikül) enjekte tarafında olumlu steril elektrot ve negatif steril elektrot üzerinde sağ ventrikül yerleştirin. 5 elektrik darbeleri 950 ms aralıklarla bir ayak kontrollü pedallı (40 V bir electroporator ile tahsil 4000 mF kondansatör) teslim etmek.
3. Elektroporasyon yordamları deftere
   1. Rahim boynuzları için karın boşluğu koy, boşluğuna embriyolar daha doğal olarak konumlandırılmış izin vermek için ve intraoperatif sıvı kaybı için hesabınıza normal tuzlu çözüm damla ekleyin.
   2. Absorbe cerrahi dikişler, karın kas duvarla sonra deri basit kesintiye dikiş kullanarak kapatın.
   3. Sıçanı kafese geri koymak ve anestezi çıkar kadar hayvan izlemek.
   4. Ağrı yönetimi için buprenorfin (0.03 mg/kg) en fazla 48 saat için her 8-12 h bir subkutan enjeksiyon tarafından hayvan için yönetmek.

6. beyin numune hazırlama

1. Fiksasyon yöntemi
   1. Gebe iri fare 5 gün sonra hızlı servikal yerindençıkmasına tarafından takip gaz anestezi (isoflurane) kullanarak cerrahi işlem kurban.
   2. Karın boşluğu yeniden açmak için bir dikey kesi yapmak.
   3. Rahim boynuzları ortaya çıkarmak, embriyoların rahim kaldırmak ve onları başını kesmek keskin makas kullanarak.
   4. Beyin doku için en az hasarla çıkarmak: keskin makas kullanırken, arka (beyincik) boyunca küçük bir kesi yapmak / deri ve forseps bir çift kullanarak kafatasını delip başın ön (olfactive ampuller) eksen kabuğu uzakta ortaya çıkarmak için kafatası beyin ve küçük bir spatula kullanarak kaldırın.
   5. Beyin gecede 4 ° C'de % 4 olarak bırakın 1 fosfat Buffered Saline (PBS) x Paraformaldehyde.
2. Beyin kesit
   1. 1 x PBS için 10 dk beyinlerinde yıkayın.
   2. Beyin %4 agar plastik kalıpları katıştırma katıştırın.
      1. 50 mL 1 x PBS %4 agar 5 embriyonik beyin gömmek için hazırlayın. En fazla 50 ° C'de çözünmüş o özel olduğundan emin olun
   3. Beyin için en az 1 h 4 ° C'de polimerize özel tutmak Beyin çevresinde aşırı özel kaldırın.
   4. Yani beynin ön/arka eksen için blade dikey odaklı vibratome taban plakası beyne tutkal. Kuru ve yapıştırılmış beyin ile plaka vibratome odanın içine yerleştirmek tutkal için birkaç dakika bekleyin.
   5. Vibratome 1 x PBS ile doldurun. 100 µm kalınlığında kesitler dilim.
   6. Beyin dilimleri slaytlarda aktarmak, aşırı sıvı kaldırmak, montaj orta birkaç damla ekleyin ve bir coverslip beyin üzerine yerleştirin

7. confocal görüntüleme ve kantitatif analiz

1. Gecede daha önce Imaging montaj orta kuru izin. 10 X lazer tarama confocal mikroskop olarak görüntü bölümler.
2. Yazılım için nicel görüntü analizi kullanarak, görüntüyü 8 bitlik, select bir hücredeki temsilcisi GFP olumlu floresan dönüştürün ve el ile şeklini tanımlayın. Bunu yapmak için üzerinde "tahmin"'ı tıklatın ve serbest seçim aracını kullanarak hücrenin kenarlığını çizin. Bu şekilde çapı ve yoğunluk eşik hücrenin otomatik olarak yazılım tarafından korunur.
3. Tıkırtı üstünde "Bul hücreleri" korteks boyunca transfected hücreleri yerelleştirmek belgili tanımlık bilgisayar yazılımı sağlamak için. Daha sonra gerekirse el ile yanlış pozitif kaldırın.
4. Korteksin bütün kalınlığı 8 araştırma alanları tek tek bölümlerde normalleştirilmiş bölün. Bunu başarmak için "Bölge araç" tıklatın, nerede 8 "bölge Stripes" seçin (1) ilk ve son (8) çizgili VZ ve CP üst sırasıyla karşılık gelir. "Uygula" tüm korteks transfected GFP hücreleri göreli konumunu saymak yazılım izin vermek için tıklatın. Son olarak "Miktar analizi için Excel dosyasındaki verileri vermek için Kaydet" tıklayın.

Sonuçlar

Roman MCD sorumlu genlerin tanımlamak için tasarlanmış deneysel strateji şekil 1' de recapitulated.

Degisken PNH (şekil 2A), corpus callosum dysgenesis, colpocephaly, serebellar hipoplazi ve epilepsi ile ilişkili polymicrogyria birleştirerek gelişimsel beyin anomalileri ile 155 hastalar kohort içinde dizi-CGH gerçekleştirerek ataksi ve kognitif bozukluk, 1.2 Mb en az kritik silme 12 ...

Tartışmalar

MCD'ler Fikri Engellilik ve ilaca dirençli çocukluk epilepsi^1,%220-40 oranında hesaba önemli nedenleri. MCD'ler ilgi önemli ölçüde iki önemli faktörler sonucunda son on yıl içinde artmıştır. İlk gelişmedir (özellikle MRG) görüntüleme beyinde sağlayan doktorlar ve bilim adamları daha önce tanınmayan birçok beyin malformasyonlar görselleştirmek. Diğer birçok roman MCD sorumlu genlerin tanımlaması sağladı genetik araçları evrimidi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Picospritzer III	Parker Hannifin Corp	P/N 051-0500-900	Intracellular Microinjection Dispense Systems
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252	Fast green allow visual monitoring of the injection
BTX ECM 830 electroporator	BTX Harvard Apparatus	45-0002	The ECM 830 is a Square Wave Pulse generator designed for in vitro and in vivo applications
Microtome HM 650 V	Microm	10076838	Microtome HM 650 V vibratome 240V 50/60Hz with vibrating blade
FluoView 300	Olympus		The Olympus FluoViewTM 300 is a point-scanning, point-detection, confocal laser scanning microscope designed for biology research application
eCELLence software	Glance Vision Technologies		eCELLence is software designed for the quantitive analysis of cell migration
Agilent Microarray Scanner Bundle			Array slides
for 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K or 8 x 15K	Agilent	Agilent p/n G4900DA, G2565CA or G2565BA
for 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K or 8 x 60K	Agilent	Agilent p/n G4900DA or G2565CA
Hybridization Chamber, stainless	Agilent	Agilent p/n G2534A	Chamber for array CGH hybridization
Hybridization Chamber gasket slides, 5-pack			Gasket for array CGH hybridization
for 1-pack microarrays or	Agilent	Agilent p/n G2534-60003
for 2-pack microarrays or	Agilent	Agilent p/n G2534-60002
for 4-pack microarrays or	Agilent	Agilent p/n G2534-60011
for 8-pack microarrays	Agilent	Agilent p/n G2534-60014
Hybridization oven	Agilent	Agilent p/n G2545A
Hybridization oven rotator for Agilent Microarray Hybridization Chambers	Agilent	Agilent p/n G2530-60029
Thermal cycler with heated lid	Agilent	Agilent p/n G8800A or equivalent	Termal cycler for incubations
1.5 mL RNase-free Microfuge Tube	Ambion	p/n AM12400 or equivalent	Microcentrifuge
Magnetic stir bar	Corning	p/n 401435 or equivalent	Instrument for stirring
Qubit Fluorometer	Life Technologies	p/n Q32857	Instrument for DNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit, for use with the Qubit fluorometer	Invitrogen	p/n Q32850	Kit for Qubit fluorometer
UV-VIS spectrophotometer	Thermo Scientific	NanoDrop 8000 or 2000, or equivalent	Instrument for DNA quantification
P10, P20, P200 and P1000 pipettes	Pipetman or equivalent		DNA dispensation
Vacuum Concentrator	Thermo Scientific	p/n DNA120-115 or equivalent	Instrument to concentrate DNA
SureTag Complete DNA Labeling Kit	Agilent	p/n 5190-4240	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
Purification Columns (50 units)	Agilent	p/n 5190-3391	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
AutoScreen A, 96-well plates	GE Healthcare	p/n 25-9005-98	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
GenElute PCR Clean-Up Kit	Sigma-Aldrich	p/n NA1020	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
Human Genomic DNA		p/n G1521	DNA Labeling Kit (for Human Samples)
For CGH microarrays:	Promega	(female) or p/n G1471 (male)	Array CGH control DNA
For CGH+SNP microarrays:	Coriell	p/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878, or NA18579	Array CGH control DNA
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer Kit or	Agilent	p/n 5188-5226	Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and	Agilent	p/n 5188-5221	Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2	Agilent	p/n 5188-5222	Array CGH hybridization and wash
Stabilization and Drying Solution	Agilent	p/n 5185-5979	Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit	Agilent	p/n 5188-5220 (25) or p/n 5188-5380 (100)	Array CGH hybridization and wash
Human Cot-1 DNA	Agilent	p/n 5190-3393	Array CGH hybridization and wash
Agilent C scanner	Agilent		Scanner for array CGH slides
SureSelect XT2 Reagent Kit			Kit for target enrichment
HiSeq platform (HSQ), 16 Samples	Agilent	p/n G9621A
HiSeq platform (HSQ), 96 Samples	Agilent	p/n G9621B
HiSeq platform (HSQ), 480 Samples	Agilent	p/n G9621C
MiSeq platform (MSQ), 16 Samples	Agilent	p/n G9622A
MiSeq platform (MSQ), 96 Samples	Agilent	p/n G9622B
MiSeq platform (MSQ), 480 Samples	Agilent	p/n G9622C
DNA 1000 Kit	Agilent	p/n 5067-1504	Kit for the separation, sizing and quantification of dsDNA fragments from 25 to 1000 bp.
High Sensitivity DNA Kit	Agilent	p/n 5067-4626	Kit for analysis of fragmented DNA or DNA libraries.
AMPure XP Kit			Kit for automated PCR purification.
5 mL	Agencourt	p/n A63880
60 mL	Agencourt	p/n A63881
450 mL	Agencourt	p/n A63882
Dynabeads MyOne Streptavidin T1			Isolation and handling of biotinylated nucleic acids
2 mL	Life Technologies	Cat #65601
10 mL	Life Technologies	Cat #65602
Quant-iT dsDNA BR Assay Kit, for the Qubit fluorometer			DNA quantification
100 assays, 2-1000 ng	Life Technologies	Cat #Q32850
500 assays, 2-1000 ng	Life Technologies	Cat #Q32853
Qubit assay tubes	Life Technologies	p/n Q32856	DNA quantification
SureSelec tXT2 Capture Libraries	Agilent	depending on the experiment	Kit for libraries capture
SureCycler 8800 Thermal Cycler	Agilent	p/n G8800A	DNA amplification
96 well plate module for SureCycler 8800 Thermal Cycler	Agilent	p/n G8810A	DNA amplification
SureCycler 8800-compatible 96-well plates	Agilent	p/n 410088	DNA amplification
Optical strip caps	Agilent	p/n 401425	DNA amplification
Tube cap strips, domed	Agilent	p/n 410096	DNA amplification
Compression mats	Agilent	p/n 410187	DNA amplification
2100 Bioanalyzer Laptop Bundle	Agilent	p/n G2943CA	DNA amplification
2100 Bioanalyzer Electrophoresis Set	Agilent	p/n G2947CA	DNA amplification
Covaris Sample Preparation System, E-series or S-series	Covaris		DNA shearing
Covaris sample holders		p/n 520078	DNA shearing
Nutator plate mixer	BD Diagnostics	p/n 421105 or equivalent	Plate Mixer
GaIIx	Illumina		next generation sequencing machine