El aislamiento y la canulación del parénquima cerebral arteriolas

Resumen

This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Resumen

arteriolas del parénquima intracerebrales (AP), que incluyen las arteriolas, arteriolas penetrantes del parénquima y arteriolas pre-capilares, vasos sanguíneos son de alta resistencia que ramifican hacia fuera de las arterias y arteriolas pial y el buceo en el parénquima cerebral. PA individual perfundir un territorio cilíndrica discreta del parénquima y las neuronas que contiene. Estas arteriolas son un actor central en la regulación del flujo sanguíneo cerebral tanto a nivel mundial (autorregulación cerebrovascular) y local (hiperemia funcional). AP son parte de la unidad neurovascular, una estructura que coincide con el flujo de sangre regional a la actividad metabólica en el cerebro y también incluye neuronas, interneuronas, y astrocitos. La perfusión a través de las AP está directamente relacionada con la actividad de las neuronas en ese territorio particular, y el aumento de plomo metabolismo neuronal a un aumento en la perfusión de la zona por la dilatación de la alimentación de PA. Reglamento de las AP difiere de la de mejor caracterizadopial arterias. vasoconstricción inducida por presión es mayor en las áreas protegidas y los mecanismos vasodilatadores varían. Además, las áreas protegidas no reciben inervación extrínseca de los nervios perivasculares - inervación es intrínseca e indirecta en la naturaleza a través del contacto con los pies terminales astrocíticos. Por lo tanto, los datos relativos a la regulación contráctil acumulados por los estudios que utilizan arterias pial no se traduce directamente a la comprensión de la función PA. Además, sigue sin determinarse cómo los estados patológicos, como la hipertensión y la diabetes, afectan a la estructura y reactividad PA. Esta brecha de conocimiento es en parte consecuencia de las dificultades técnicas relacionadas con el aislamiento de PA y la canalización. En este manuscrito se presenta un protocolo para el aislamiento y la canalización de las AP de roedores. Además, se muestran ejemplos de experimentos que se pueden realizar con estas arteriolas, incluyendo constricción inducida por el agonista y reactividad miogénica. Aunque el objetivo de este manuscrito es el PA canulación y myography presión, aislado PAs también se puede utilizar para estudios bioquímicos, biofísicos, moleculares y de imagen.

Introducción

La circulación cerebral se organiza única para apoyar las demandas metabólicas de las neuronas centrales, las células que han limitado las reservas de energía y en consecuencia son muy sensibles a los cambios en la presión de oxígeno y el suministro de nutrientes necesarios. Como determinadas subpoblaciones neuronales se vuelve activo cuando se realizan tareas específicas, la vasculatura promueve un aumento muy localizada en la perfusión para evitar la hipoxia local y el agotamiento de los nutrientes ^1. Esta es una forma de hiperemia funcional conocido como acoplamiento neurovascular, y depende de la operación correcta de la unidad neurovascular, compuesto de neuronas activas, astrocitos y las arterias cerebrales ^2. Arteriolas parenquimatosas intracerebral, un grupo de los vasos sanguíneos que abarcan del parénquima, penetrantes y arteriolas pre-capilares, son centralmente importante para esta respuesta y entonces es fundamental para estudiar de forma individual con el fin de investigar el acoplamiento neurovascular ^3.

arteriolas parenquimatosas son pequeñas (20 a 70 micras de diámetro interno) los vasos sanguíneos de alta resistencia que perfunden distintas poblaciones neuronales en el cerebro. Diversificación de las arterias pial en la superficie, arteriolas parenquimatosas penetran en el parénquima cerebral en un ángulo de casi 90 ^ᵒ para alimentar la microcirculación subsuelo (Figura 1). Estas arteriolas juegan un papel crítico en el mantenimiento de la presión de perfusión adecuada, ya que son los vasos que contiene músculo liso más distales que protegen a los capilares. En contraste con la circulación pial superficie, arteriolas parenquimatosas carecen de ramas colaterales y anastomosis, y por lo tanto son "cuellos de botella" de la circulación cerebral ^4. Como resultado de ello, la disfunción de las arteriolas del parénquima contribuye al desarrollo de las enfermedades cerebrovasculares tales como deterioro cognitivo vascular y pequeños accidentes cerebrovasculares isquémicos (también conocido como accidentes cerebrovasculares silenciosos o lacunares). estudios iNDICATe que la disfunción del parénquima arteriolas puede ser inducida por la hipertensión esencial ^5, el estrés crónico ^6, y es un evento temprano en la enfermedad de vasos pequeños modelo de ratón genético ^7. Oclusión Además, inducida experimentalmente de las arteriolas penetrantes individuales en ratas es suficiente para provocar pequeños accidentes cerebrovasculares isquémicos que son de forma cilíndrica, similar a los observados en los seres humanos de edad avanzada ^8.

Además de estas distinciones anatómicas, mecanismos que regulan la función contráctil difieren entre arterias y arteriolas pial parenquimatosas. Vasoconstricción miogénica es mayor en las arteriolas del parénquima ^9, posiblemente debido a la falta de inervación extrínseca ^10, modos distintos de mechanotransduction ^11, y las diferencias en la señalización intracelular ^de Ca2 ^{+ 12,13} en las células del músculo liso vascular. La evidencia sugiere que los mecanismos vasodilatadores dependientes del endotelio también difieren entre estos Vascusegmentos lar, con arterias del parénquima que exhiben una mayor dependencia de los mecanismos que implican Ca2 ⁺ activados por los canales de K ⁺ y la comunicación electrotónico dentro de la pared vascular en comparación con los factores difusibles como el óxido nítrico y prostaciclinas ^14. Por lo tanto, los datos reunidos en experimentos utilizando arterias pial no necesariamente puede aplicarse a las arteriolas del parénquima, dejando un vacío en nuestro conocimiento del control local de la perfusión cerebral.

A pesar de su importancia, las arteriolas del parénquima son muy insuficientemente estudiada, principalmente debido a las dificultades técnicas con el aislamiento y el montaje para el estudio ex vivo. En este manuscrito se describe una metodología para aislar y canular arteriolas del parénquima cerebral, que puede ser utilizado para myography presión, o para aislar el tejido para immunolabeling, la electrofisiología, la biología molecular y el análisis bioquímico.

Protocolo

1. cánula y cámara de preparación de

1. Inserte capilares de vidrio de borosilicato limpia (diámetro exterior: 1,2 mm; diámetro interior: 0,69 mm; 10 mm de longitud) en las ranuras de un extractor de pipeta con un filamento de platino (diámetro: 100 micras).
2. Utilización de las configuraciones adecuadas, tire del capilar para generar una cánula con una punta larga y delgada (Figura 2) utilizando un extractor de micropipeta. Los ajustes que se utilizan son: Heat - 700, Pull - 100, velocidad - 50, Tiempo - 10.
3. Insertar la cánula en el soporte de la cámara de myograph presión. Alinear las cánulas apropiadamente.
4. romper cuidadosamente la punta de las cánulas mediante el uso de un fórceps bajo el microscopio de disección para el diámetro deseado. Aquí mostramos una cánula con una punta de 10 mm (Figura 2).
5. Llene los dos cánulas con líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) que contiene 1,8 mM ^de Ca2 ^+; llenar la cámara con Ca ^{2 +} libre LCRa suplementado con suero bovino 1%albúmina (BSA) + 10 M Diltiazem (todas las soluciones se deben preparar fresco antes del comienzo del experimento). Dependiendo del tamaño de la cámara, variar el volumen de LCRa entre 5 a 20 ml. Almacenar la cámara a 4 ^ᵒ C hasta que esté listo para comenzar la canalización.
   NOTA: Diltiazem es un inhibidor de calcio cerrada tensión reversible de tipo L que hará que la dilatación de las arteriolas, lo que facilita la canulación

2. Aislamiento del parénquima arteriolas

1. La eutanasia del animal inmediatamente antes de la disección a través de protocolos estándar en el laboratorio que se aprobado por el comité de cuidado de animales de la institución. Se prefiere el uso de barbitúricos o dióxido de carbono, como otros anestésicos usados ​​comúnmente pueden tener efectos vasodilatadores en la circulación cerebral ^15. Todos los animales procedimientos mostrados aquí han sido aprobados por Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión de la Universidad de Nevada, Facultad de Medicina, y están en agreement con los Institutos Nacionales de la Salud "Principios rectores en el Cuidado y Uso de los Animales".
2. La eutanasia a los animales utilizando dióxido de carbono. Antes de la decapitación, asegúrese de que el animal ha dejado de respirar y no responde cuando se pellizca sus patas.
3. Decapitar al animal usando una tijera afilada (ratón) o guillotina (rata). Quitar la piel de la cabeza del animal y cortar a lo largo de la sutura craneal línea media usando una tijera de punta fina. Usando unas pinzas romas (ratón) o una pinza de hueso retirar con cuidado los huesos del cráneo y exponer el cerebro. Retire el cerebro lentamente y con cuidado para no dañar las arterias pial superficie. Coloque el cerebro en un recipiente lleno con 20 ml de Ca ^{2 +} libre LCRa suplementado con 1% de BSA en hielo.
4. Llenar un plato de disección que contiene una almohadilla con helado libre de Ca2 + LCRa suplementado con 1% de BSA y transferir el cerebro con la superficie ventral hacia arriba a este plato (Figura 2A). Coloque el plato bajo una disecciónmicroscopio Ting (Figura 3A). Pin el cerebro a la plataforma usando agujas de calibre 27. Tenga cuidado de evitar la colocación de pasadores, cerca de la arteria cerebral media (ACM).
5. Localizar el Círculo de Willis y el MCA ramificación de ella. Con unas tijeras afiladas y alineadas primavera Vannas, cortar un pequeño rectángulo alrededor de la MCA. Asegúrese de que rectángulo es cerca de 5 mm de diámetro a través de toda la longitud de la MCA. La parte superior del rectángulo debe estar más allá del punto de ramificación del Círculo de Willis (próxima al polígono de Willis, la figura 2B, flecha).
6. Uso de las tijeras de primavera Vannas, realice un corte en la profundidad del tejido durante aproximadamente 2 a 3 mm.
   NOTA: Esta parte es fundamental para un buen aislamiento de las arteriolas del parénquima, y ​​puede tomar unos pocos ensayos para hacerlo bien. Si el corte es la nota hecha lo suficientemente profundo, las arteriolas aisladas del parénquima será corta; Si el corte es demasiado profundo, las arteriolas se romperá en su punto de ramificación cuando el diseccionadoSe extirpa el tejido.
7. Precisar el extremo más distal de la sección de cerebro en el plato de disección con la CRM hacia arriba (distal del Círculo de Willis) usando pasadores de insectos. Hacer una incisión poco profunda para cortar la pia cerca del pasador, teniendo cuidado de no cortar demasiado profundamente en la corteza cerebral subyacente (de lo contrario los pines no se mantendrá).
8. agarrar con cuidado cada lado de la pia con pequeñas pinzas y comenzar el pelado de la pia de la corteza. Si es necesario, se aferran a la MCA, asegurando que la membrana pial circundante no está dañado.
9. Mantenga pelar hasta que la pia que contiene la MCA está libre de la corteza. Tenga en cuenta que la resistencia contra el pelado aumentará cerca del Círculo del Willis. Tenga mucho cuidado en este punto, debido a que las arteriolas del parénquima más largos estarán en esta región.
10. Una vez que la PIA es libre, lo coloca cuidadosamente en la parte superior de la almohadilla en el plato de disección con la superficie opuesta a la del parénquima arteriolas orientados hacia abajo (Figura 2B).
11. Uso de tijeras de primavera Vannas, cortar las arteriolas disecados libres de la CRM, asegurándose de que los extremos del vaso se cortan sin rodeos.
12. arteriolas recogidos pueden ser utilizados para myography presión, el análisis molecular, o el aislamiento de músculo liso nativo o células endoteliales.

Miografía 3. Presión

1. Preparar la sutura antes de tiempo. Cortar el hilo de nylon de color verde oscuro en piezas de 5 mm y colocar en el lado adhesivo de una cinta de doble cara en una placa de Petri. Bajo el microscopio de disección, separar cada pieza en sus filamentos utilizando unas pinzas finas, y sin apretar preparar un nudo simple medio nudo haciendo pasar un extremo del filamento en la otra.
2. Con unas pinzas, elegir un nudo de la cinta de doble cara, teniendo cuidado de no agarrar con demasiada presión. Tirar de la sutura en la solución del baño, nudo deslizante en la cánula y apretarlo a una distancia desde la punta de la cánula. Repita este proceso para tener 2 puntos de sutura en cada cánula.
3. Escudo un vasomicropipeta con una solución de BSA al 10% y luego enjuague el exceso con Ca ^{2 +} LCRa exento suplementado con 1% de BSA.
4. Tire 50 l de solución en la micropipeta de vidrio, tire hacia arriba de una arteriola del parénquima y la transferencia a la cámara de presión myography. Empuje émbolo en un movimiento fluido para dispensar la arteriola del parénquima en la cámara para evitar que se pegue a la cámara interna de la micropipeta de vidrio.
5. El uso de dos pinzas de la multa estupenda, abrir el lumen del PA, con cuidado de tocar solamente el final de la embarcación.
6. Usando las pinzas para sujetar los bordes de la arteriola del parénquima, tire con cuidado el recipiente sobre la cánula. Tire lo suficientemente lejos en la cánula de modo que el buque no está en el extremo muy afilada de la cánula (Figura 3A).
7. Aflojar los 2 puntos de sutura en la cánula y apretarlos en el buque (Figura 3B). Espacio de las suturas separadas un poco en el recipiente, y tire hacia el operador, mientras que tighcada diez. Asegúrese de que las ramas se atan antes de cerrar el extremo opuesto de la arteriola del parénquima.
8. Girar cámara alrededor y cerrar el extremo opuesto de la arteriola parénquima como una persiana salida. Para ello, abrir los lazos en la cánula opuesto y dárselo a la arteriola. Cierre lentamente el nudo de tal manera que la arteriola parénquima estará ligado a un lado de la cánula. Evitar el estiramiento longitudinal de la arteriola. (Figura 3C).
   NOTA: Si el objetivo del estudio es para perfundir los medicamentos a través del lumen, canular el extremo opuesto en lugar de atar la arteriola del parénquima en el lado de la cánula. Asegúrese de que las cánulas no tienen cristales de sal o acumulaciones internas que bloquean el flujo intraluminal. Regular la velocidad de flujo apropiada a fin de mantener la tensión de cizallamiento dentro de los niveles fisiológicos. Un estudio realizado por Shih et al. Muestra las tasas de flujo en el interior de penetración arteriolas en ratas de ^8, y puede servir como una guía inicial para piLos estudios mucho.
9. transferir con cuidado la cámara a la platina del microscopio para ser utilizado para la grabación de diámetro de los vasos. Coloque la cámara en la platina del microscopio, la conexión de la sonda de temperatura y entradas y salidas para la perfusión a los tubos correctos. Presurizar la arteriola a 40 mmHg de presión intraluminal para arteriolas del parénquima de ratón o de 50 mmHg para arteriolas de rata, usando un sistema de presión disponible en el laboratorio (columna de agua, bomba peristáltica acoplada a un transductor de presión, etc.). La Figura 4D muestra un ejemplo de una bomba peristáltica acoplada a un transductor de presión para presurizar la arteriola canulado.
10. Encienda el sistema se utiliza para detectar cambios en el diámetro (Figura 3E). Ajustar la configuración de un microscopio, tales como la iluminación y el contraste, con el fin de obtener la mejor detección posible. Lo ideal sería que las paredes de las arteriolas deben ser oscuro y la luz translúcida. Una vez que la detección es el caso, iniciar la grabación tque experimentar.
11. Iniciar el sistema de superfusión. Lavar el canulado, arteriola parénquima presurizado con LCRa caliente (37 ^ᵒ C) que contiene mM Ca ^{2 +} 1,8 para 15 a 20 minutos a una velocidad de flujo entre 3-5 ml / min. Este ACSF no debe contener Diltiazem o BSA.
12. Sustituir el LCRa regular con 60 mM KCl LCRa para evaluar la viabilidad de la preparación. En este punto las AP deben exposición 10 - 20% de la constricción de KCl 60 mM. Si la arteriola no se contraen en esa medida, quitar y cannulate otra de las arteriolas.
13. Lavar el KCl 60 mM con ACSF regular. Espere hasta que la generación del tono miogénico espontánea, lo que podría tardar hasta una hora. Si arteriolas no tiene tono miogénico para entonces, sustituirla por otra de las arteriolas.
    NOTA: miogénica tono se observa como un gradual, y a veces lento, la reducción del diámetro de la luz del vaso sin estimulación por agonistas contráctiles o solución de alta KCl. tono miogénico se calcula mediante la siguiente formula: (1 - (diámetro de lumen activo / diámetro lumen pasivo)) x 100 ⁵ Una cantidad apropiada de tono miogénico puede variar de acuerdo a los tratamientos, las cepas, especies, transgénicos, etc.. En general, el tono miogénico fisiológica oscila desde 15 hasta 30% ^5.

4. Ejemplo de presión Experimentos Miografía: inducida por agonista constricción y miogénica reactividad

1. Preparar una serie de diluciones de un agonista de elección en LCRa usando concentraciones apropiadas. Para el ejemplo actual se utilizó el U46619 agonista del receptor de tromboxano A _2. Se preparó una solución madre de 1 ml de U46619 a una concentración de 1 mM. Transferir 100 l de la solución 1 mM a un nuevo tubo que contiene 900 l de LCRa para hacer una dilución de 10 veces de la droga, lo que resulta en una solución que contiene 100 U46619 M. Repita este procedimiento para 6 diluciones, que van desde 1 mM a 100 nM para preparar una curva de concentración-respuesta constrictor.
2. Añadir latodo el volumen de la solución que contiene el agonista (1 ml para la primera dosis, seguido de 900 l de todas las dosis subsiguientes) a 100 ml de superfusión LCRa. Esto dará lugar a una dilución adicional de 100 veces del agonista. Por lo tanto, las concentraciones finales de agonista en el intervalo de baño de 10 pM a 10 mM. Permitir arteriolas incubar durante ~ 10 min en cada concentración, hasta el diámetro de la luz alcanza un estado estacionario.
3. Lavar el agonista por superfusión AP de ACSF sin ninguna droga hasta que el diámetro PA está de nuevo al valor original. Incubar la arteriola del parénquima en Ca ^{2 +} libre ^de LCRa (sin BSA) suplementado con 10 mM Diltiazem + 2 mM EGTA para inducir la dilatación máxima y registrar diámetro pasiva de la arteriola.
4. Retire la arteriola del parénquima de la cánula tirando con cuidado a cabo mientras se mantiene en el extremo de los lazos. Se lava la cámara de recipiente con agua doblemente desionizada para eliminar los desechos y el exceso de agonista. Llenar la cámara con Ca2 + LCRa + exento de BSA y cannulate otra de las arteriolas. No se recomienda realizar más de un experimento por las arteriolas.
5. Para llevar a cabo un experimento de reactividad miogénica, permite la arteriola del parénquima se equilibre a 40 mmHg de presión intraluminal hasta que se genera el tono miogénico espontánea (descrito anteriormente). Reducir la presión intraluminal de 5 mmHg y permitir que se equilibre durante PA ~ de 5 - 10 minutos, hasta que el diámetro luminal alcanza el estado de equilibrio. Aumentar la presión paso a paso intraluminal utilizando el intervalo de elección (por ejemplo de 5 a 140 mmHg en incrementos de 20 mm de Hg).
6. No exponga la arteriola a la presión intraluminal por debajo de 5 mmHg, ya que ello podría causar el colapso y dañar el endotelio, alterando así los resultados del experimento.
7. Al final de la curva de presión, superfuse la arteriola parénquima con Ca ^{2 +} libre ^de LCRa (sin BSA) suplementado con 10 mM Diltiazem + EGTA 2 mM y repetir los pasos de presión, a partir de los lowest presión.
   NOTA: Esto le dará a los diámetros pasivos de la AP, que son necesarios para calcular el% tono miogénico, definidos por la fórmula:% tono = (1 - (diámetro activa / pasiva de diámetro)) x 100.

Resultados

La Figura 5A muestra una constricción representante de las AP de ratón a 60 mM KCl LCRa para evaluar la integridad de la preparación. AP debe constreñir entre 15 - 30% en presencia de KCl 60 mM. Si el estrechamiento es inferior al 15%, desechar la AP y cannulate otro, ya que sugiere que la arteriola fue dañado durante el proceso de aislamiento y la canalización.

La Figura 5B ilustra PA c...

Discusión

arteriolas del parénquima cerebral son las arteriolas de alta resistencia con pocas anastomosis y ramas que irrigan distintas poblaciones neuronales. Estos vasos sanguíneos especializados son actores centrales en la autorregulación cerebrovascular y acoplamiento neurovascular a través de la vasodilatación mediada por ^astrocito-1. La importancia de estos vasos sanguíneos especializados en la enfermedad vascular cerebral se conoce desde hace aproximadamente 50 años, cuando el trabajo pionero del Dr. Mill...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial Cerebrospinal Fluid
NaCl	Fisher Scientific	S-640
KCl	Fisher Scientific	P217
MgCl Anhydrous	Sigma-Aldrich	M-8266
NaHCO3	Fisher Scientific	S233
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9638
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G2870
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9647
Isolation/Cannulation
Stereo Microscope	Olympus	SZX7
Super Fine Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-00
Wiretrol 50 μl	VWR Scientific	5-000-1050
0.2 μm Sterile Syringe Filter	VWR Scientific	28145-477
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97
Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm	Sutter Instruments	B120-69-10
Dark Green Nylon Thread	Living Systems Instrumentation	THR-G
Linear Alignment Single Vessel Chamber	Living Systems Instrumentation	CH-1-LIN
Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump	Living Systems Instrumentation	PS-200
Video Dimension Analyzer	Living Systems Instrumentation	VDA-10
Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software	Living Systems Instrumentation	DAQ-IWORX-404
Heating Unit	Warner Instruments	64-0102
Automatic Temperature Controller	Warner Instruments	TC-324B