Isolamento e Incannulazione di cerebrale parenchimale Arteriole

Riepilogo

This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Abstract

arteriole parenchimali intracerebrali (AP), che comprendono arteriole parenchimali, arteriole penetranti e arteriole pre-capillari, sono i vasi sanguigni ad alta resistenza si ramificano fuori dalle arterie piale e arteriole e le immersioni nel parenchima cerebrale. Individuale PA defluire in un territorio cilindrica discreta del parenchima e neuroni contenuti all'interno. Questi sono arteriole un ruolo centrale nella regolazione del flusso ematico cerebrale sia a livello globale (autoregolazione cerebrovascolare) e locale (iperemia funzionale). PAs sono parte dell'unità neurovascolare, una struttura che corrisponde flusso sanguigno regionale per attività metabolica nel cervello e comprende anche neuroni, interneuroni e astrociti. Perfusione attraverso PA è direttamente collegato con l'attività dei neuroni in quel particolare territorio e gli aumenti di portare il metabolismo neuronale ad un aumento della perfusione locale causata dalla dilatazione del feed PA. Regolamento dei PA differisce da quello di meglio caratterizzatoarterie piali. vasocostrizione pressione indotta è maggiore in PA e meccanismi vasodilatatori variano. Inoltre, PA non ricevono innervazione estrinseca dai nervi perivascolari - innervazione è intrinseca ed indiretta in natura attraverso il contatto con endfeet astrociti. Così, i dati riguardanti il ​​regolamento contrattile accumulati da studi che utilizzano arterie piali non direttamente traducono per comprendere la funzione PA. Inoltre, rimane indeterminata come stati patologici, quali ipertensione e diabete, influiscono struttura PA e reattività. Questo gap di conoscenza è in parte una conseguenza delle difficoltà tecniche relative all'isolamento PA e cannulazione. In questo manoscritto vi presentiamo un protocollo per l'isolamento e l'incannulamento della PA roditori. Inoltre, mostriamo esempi di esperimenti che possono essere eseguite con queste arteriole, tra costrizione agonisti indotta e reattività miogenico. Anche se il focus di questo manoscritto è in PA incannulazione e myography pressione, isolato PAs può essere utilizzato anche per studi biochimici, biofisici, molecolari, e di imaging.

Introduzione

La circolazione cerebrale è organizzata unicamente per supportare le richieste metaboliche dei neuroni centrali, le cellule che hanno limitato riserve di energia e di conseguenza sono molto sensibili alle variazioni di pressione di ossigeno e di sostanze nutritive necessarie. Come particolari sottopopolazioni neuronali diventa attivo quando vengono eseguite attività specifiche, la vascolarizzazione promuove un aumento altamente localizzato in perfusione per prevenire ipossia locale, e l'esaurimento delle sostanze nutritive ^1. Questa è una forma di iperemia funzionale noto come accoppiamento neurovascolare, e dipende dal corretto funzionamento dell'unità neurovascolare, composto di neuroni attivi, astrociti, e le arterie cerebrali ^2. Intracerebrale arteriole parenchimali, un gruppo di vasi sanguigni che comprende parenchimale, penetranti e arteriole pre-capillari, sono di importanza fondamentale per questa risposta, ed è quindi fondamentale per studiarli singolarmente al fine di indagare l'accoppiamento neurovascolare ^3.

arteriole parenchimali sono piccole (20 - 70 micron di diametro interno) vasi sanguigni ad alta resistenza che profumato popolazioni neuronali distinti all'interno del cervello. Branching out dalle arterie piali sulla superficie, arteriole parenchimali penetrano nel parenchima cerebrale con un angolo di circa 90 ^ᵒ per alimentare la microcircolazione sottosuolo (Figura 1). Questi arteriole giocano un ruolo fondamentale nel mantenere adeguata pressione di perfusione in quanto sono i lisci vasi più distali muscolari contenenti proteggono i capillari. In contrasto con la circolazione superficie piale, arteriole parenchimali mancano rami collaterali e anastomosi, e di conseguenza sono "colli di bottiglia" della circolazione cerebrale ^4. Come risultato, la disfunzione delle arteriole parenchimali contribuisce allo sviluppo di malattie cerebrovascolari, come le disabilità cognitive vascolari e piccole ictus ischemici (noto anche come ictus silenziosi o cassettoni). studi indicate che la disfunzione del parenchima arteriole può essere indotta da ipertensione essenziale ^5, lo stress cronico ^6, ed è un evento precoce nella malattia dei piccoli vasi modello di topo genetica ^7. Occlusione Inoltre, sperimentalmente indotta singoli arteriole che penetrano nei ratti è sufficiente a causare piccoli colpi ischemici che sono di forma cilindrica, simile a quelli osservati negli esseri umani vecchi ^8.

In aggiunta a queste distinzioni anatomiche, meccanismi che regolano la funzione contrattile differiscono tra arterie e arteriole piale parenchimali. Vasocostrizione Miogenica è maggiore nelle arteriole parenchimali ^9, probabilmente a causa della mancanza di innervazione estrinseca ^10, diverse modalità di mechanotransduction ^11, e le differenze in intracellulare Ca ^{2 +} Segnalazione ^12,13 nelle cellule muscolari lisce vascolari. L'evidenza suggerisce che i meccanismi vasodilatatori endotelio-dipendente differiscono anche tra questi vascusegmenti lar, con arterie parenchimali espositrici maggiore affidamento sui meccanismi che coinvolgono Ca ²⁺ -activated K ⁺ canali e comunicazione elettrotonica all'interno della parete vascolare rispetto ai fattori diffusibili come l'ossido nitrico e prostacicline ^14. Pertanto, i dati raccolti in esperimenti usando arterie piali non necessariamente applicarsi a parenchimale arteriole, lasciando una lacuna nella nostra conoscenza di controllo locale della perfusione cerebrale.

Nonostante la loro importanza, arteriole parenchimali sono di gran lunga sotto-studiato, principalmente a causa delle sfide tecniche con isolamento e di montaggio per lo studio ex vivo. In questo manoscritto descriviamo un metodo per isolare e cannulare arteriole cerebrali parenchimali, che può essere utilizzato per myography pressione, o per isolare il tessuto per immunomarcatura, elettrofisiologia, biologia molecolare e analisi biochimiche.

Protocollo

1. cannula e Camera di preparazione

1. Inserire capillari di vetro borosilicato pulito (diametro esterno 1,2 mm, diametro interno: 0,69 mm, 10 mm di lunghezza) nelle scanalature di un estrattore pipetta con un filamento di platino (diametro: 100 micron).
2. Utilizzo delle impostazioni appropriate, tirare la capillare per generare una cannula con una lunga e sottile punta (Figura 2) con un estrattore micropipetta. Le impostazioni utilizzate sono: Heat - 700, Pull - 100, Velocity - 50, - 10.
3. Inserire la cannula nel supporto della camera di myograph pressione. Allineare le cannule in modo appropriato.
4. rompere attentamente le punte delle cannule utilizzando una pinza sotto il microscopio da dissezione al diametro desiderato. Qui mostriamo una cannula con una punta 10 micron (Figura 2).
5. Riempire le due cannule con liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) contenente 1,8 mm Ca ^2+; riempire la camera con Ca2 ⁺ -free aCSF supplementato con siero bovino 1%(BSA) + 10 mM Diltiazem (tutte le soluzioni devono essere preparate di fresco prima dell'inizio dell'esperimento). A seconda delle dimensioni della camera, variare il volume di aCSF tra 5 e 20 ml. Conservare la camera a 4 ^ᵒ C fino al momento di iniziare cannulazione.
   NOTA: Diltiazem è un inibitore di calcio gated tensione reversibile di tipo L che causerà la dilatazione delle arteriole, che facilita la cannulazione

2. Isolamento di parenchimale Arteriole

1. Eutanasia dell'animale immediatamente prima dissezione utilizzando protocolli standard di laboratorio che sono stati approvati dal comitato di cura degli animali dell'istituzione. L'uso di barbiturici o anidride carbonica è preferito, come altri anestetici comunemente usati possono avere effetti vasodilatatori nella circolazione cerebrale ^15. Tutte le procedure sugli animali indicati qui sono stati approvati dalla Institutional Animal Care e Usa Comitato presso la University of Nevada School of Medicine, e sono in agreement con i National Institutes of Health "principi guida nella cura e uso degli animali".
2. Eutanasia l'animale con anidride carbonica. Prima di decapitazione, assicurarsi che l'animale ha smesso di respirare e non risponde quando pizzicare le zampe.
3. Decapitare l'animale utilizzando una forbice tagliente (mouse) o ghigliottina (ratto). Togliere la pelle dalla testa dell'animale e tagliare lungo la sutura cranica linea mediana utilizzando una forbice punta fine. Utilizzando una pinza smussato (mouse) o una pinza osso rimuovere con attenzione le ossa craniche e esporre il cervello. Rimuovere il cervello lentamente e con attenzione per non danneggiare le arterie superficie piale. Posizionare il cervello in un contenitore riempito con 20 ml di Ca ²⁺ -free aCSF integrato con 1% BSA in ghiaccio.
4. Riempire un piatto dissezione contenente un pad con ghiacciata Ca2 + -free aCSF integrato con 1% BSA e trasferire il cervello con la superficie ventrale rivolta verso l'alto a questo piatto (Figura 2A). Porre la capsula in una dissezioneTing microscopio (Figura 3A). Pin il cervello per il pad con aghi calibro 27. Fare attenzione a evitare di mettere i perni nei pressi della cerebrale media (MCA).
5. Localizzare il circolo di Willis e la MCA ramificazione da esso. Utilizzando forbici primavera nitide e allineate Vännäs, tagliare un piccolo rettangolo intorno alla MCA. Assicurarsi che rettangolo è vicino a 5 mm di diametro attraverso l'intera lunghezza della MCA. La parte superiore del rettangolo dovrebbe essere oltre il punto di diramazione dal Circolo di Willis (prossimale al circolo di Willis, figura 2B, freccia).
6. Utilizzando le forbici primavera Vännäs, eseguire un sottosquadro nella profondità del tessuto per circa 2 - 3 mm.
   NOTA: Questa parte è fondamentale per un buon isolamento delle arteriole parenchimali, e può richiedere un paio di prove per farlo bene. Se il taglio è nota fatta abbastanza in profondità, le arteriole isolati parenchimali sarà breve; se il taglio è troppo profondo, arteriole si rompono al loro punto di diramazione quando la sezionatotessuto viene rimosso.
7. Definire con precisione la fine più distale della fetta cerebrale nel piatto dissezione con la MCA rivolta verso l'alto (distale dal Circolo di Willis) con perni di insetti. Effettuare una incisione superficiale per tagliare il pia vicino al perno, facendo attenzione a non tagliare troppo in profondità nella corteccia cerebrale sottostante (altrimenti i perni non tenere).
8. afferrare con attenzione ogni lato della pia con piccole pinze e iniziare peeling la pia dalla corteccia. Se necessario, trattenere la MCA, assicurando che la membrana piale circostante non sia danneggiato.
9. Mantenere peeling fino alla pia contenente la MCA è libero dalla corteccia. Si noti che la resistenza contro peeling aumenta vicino al Circolo della Willis. Prestare la massima attenzione a questo punto, perché le arteriole parenchimali più lunghi saranno in questa regione.
10. Una volta che la pia è libero, posizionarla con cautela sulla parte superiore del pad sul piatto dissezione con la superficie opposta a parenchimale arteriole rivolti verso il basso (Figura 2B).
11. Utilizzando le forbici primavera Vännäs, tagliare le arteriole sezionati libero dalla MCA, assicurandosi che le estremità della nave sono tagliati senza mezzi termini.
12. arteriole raccolti possono essere utilizzati per myography pressione, analisi molecolare, o l'isolamento del muscolo liscio nativo o cellule endoteliali.

Myography 3. Pressione

1. Preparare la sutura prima del tempo. Tagliare il filo di nylon verde scuro in pezzi da 5 mm e posizionare sul lato adesivo di un nastro biadesivo su una capsula di Petri. Al microscopio da dissezione, separare ogni pezzo suoi filamenti utilizzando una pinza sottile, e vagamente preparare un nodo semplice mezzo-intoppo facendo passare una estremità del filamento nell'altra.
2. Utilizzando pinze, scegliere un nodo fuori dal nastro biadesivo, facendo attenzione a non afferrare con troppa pressione. Estrarre la sutura nella soluzione del bagno, scivolo nodo sulla cannula e serrare ad una distanza dalla punta della cannula. Ripetere la procedura per avere 2 punti di sutura su ogni cannula.
3. Coat un bicchieremicropipetta con una soluzione di BSA 10% e poi risciacquare l'eccesso con Ca2 ⁺ -free aCSF integrato con 1% BSA.
4. Estrarre 50 ml di soluzione nel micropipetta di vetro, tirare su una arteriola parenchimale e trasferire alla camera myography pressione. Premere stantuffo in un movimento fluido per erogare la arteriole parenchimale nella camera per evitare che si attacchino alla camera interna della micropipetta di vetro.
5. Utilizzando due pinze super-sottili, aprire il lume della PA, facendo attenzione a toccare solo la fine della nave.
6. Usando le pinze per tenere i bordi del arteriole parenchimale, tirare con cautela la nave sulla cannula. Tirare abbastanza lontano sulla cannula in modo che la nave non è alla fine molto rastremata della cannula (Figura 3A).
7. Allentare le 2 suture sulla cannula e serrarle sulla nave (Figura 3B). Spazio i punti di sutura a parte un po 'sul recipiente, e tirare verso l'operatore, mentre tighdieci esso. Assicurarsi che i rami sono legati fuori prima di chiudere l'estremità opposta del arteriole parenchimale.
8. Ruotare camera intorno e chiudere l'estremità opposta arteriole parenchimale come un cieco senza uscita. A tal fine, aprire i legami sulla cannula opposto e passarlo sul arteriole. Chiudere lentamente il nodo in modo tale che il arteriole parenchimale sarà legato al lato della cannula. Evitare tratto longitudinale del arteriole. (Figura 3C).
   NOTA: Se l'obiettivo dello studio è di perfusione farmaci attraverso il lume, incannulare l'estremità opposta invece di legare arteriole parenchimale al lato della cannula. Assicurarsi che le cannule non hanno alcun cristalli di sale o build-up interni che bloccano il flusso endoluminale. Regolare la portata in modo appropriato al fine di mantenere sforzo di taglio entro livelli fisiologici. Uno studio di Shih et al. Mostra portate all'interno penetrante arteriole nei ratti ^8, e può servire come guida iniziale per pistudi lotto.
9. trasferire accuratamente la camera alla fase del microscopio da utilizzare per la registrazione diametro del vaso. Fissare la camera sul palco microscopio, che collega la sonda di temperatura e di ingresso e le prese per la perfusione ai tubi corretti. Pressurizzare arteriole a 40 mmHg pressione intraluminale per topo arteriole parenchimali o 50 mmHg per arteriole ratto, utilizzando un sistema di pressione disponibile in laboratorio (colonna d'acqua, la pompa peristaltica accoppiato ad un trasduttore di pressione, ecc.). La figura 4D mostra un esempio di un pompa peristaltica accoppiato ad un trasduttore di pressione per pressurizzare il arteriole cannulata.
10. Accendere il sistema utilizzato per rilevare variazioni di diametro (Figura 3E). Regolare le impostazioni del microscopio, come illuminazione e contrasto, in modo da ottenere la migliore rilevazione possibile. Idealmente le pareti della arteriole dovrebbero essere scuro e il traslucido lume. Una volta che il rilevamento è opportuno, avviare la registrazione tegli esperimento.
11. Avviare il sistema superfusione. Lavare il cannulato, arteriole parenchimale pressurizzato con calda aCSF (37 ^ᵒ C) contenente 1,8 mM Ca ²⁺ per 15 a 20 minuti a una portata tra 3 - 5 ml / min. Questo aCSF non deve contenere Diltiazem o BSA.
12. Sostituire il regolare aCSF con 60 mm KCl aCSF per valutare la fattibilità della preparazione. A questo punto PAs devono mostrare 10 - 20% costrizione 60 mM KCl. Se il arteriole non si restringono fino a quel punto, rimuovere e cannulate un'altra arteriole.
13. Lavare il 60 mm KCl con regolare aCSF. Attendere fino a quando la generazione del tono miogenico spontanea, che potrebbe richiedere fino a un'ora. Se arteriole non ha il tono miogenico da allora, sostituirlo con un altro arteriole.
    NOTA: Miogenica tono è osservato come una graduale, e talvolta lenta, riduzione del diametro del lume del vaso senza stimolazione da agonisti contrattili o alta soluzione KCl. tono miogenico è calcolata con la seguente Formula: (1 - (diametro del lume attivo / diametro del lume passivo)) x 100 ⁵ Una quantità appropriata di tono miogena può variare in base ai trattamenti, ceppi, specie, transgenici, ecc.. In generale, fisiologico tono miogenico varia da 15 - 30% ^5.

4. Esempio di pressione Esperimenti Myography: agonista-indotta costrizione e Miogenica reattività

1. Preparare una serie di diluizioni di un agonista di scelta in aCSF usando concentrazioni appropriate. Per l'esempio attuale è stato utilizzato il trombossano _A2 agonista del recettore U46619. Una soluzione stock di 1 ml di U46619 ad una concentrazione di 1 mM è stato preparato. Trasferire 100 microlitri della soluzione 1 mM in una nuova provetta contenente 900 ml di aCSF per fare una diluizione di 10 volte del farmaco, risultante in una soluzione contenente 100 mM U46619. Ripetere questo processo per 6 diluizioni, che vanno da 1 mm fino a 100 nM per preparare una curva constrictor concentrazione-risposta.
2. Aggiungi ilintero volume della soluzione contenente l'agonista (1 ml per la prima dose, seguita da 900 ml di tutte le dosi successive) a 100 ml di superfusing aCSF. Questo porterà ad un ulteriore diluizione 100 volte del agonisti. Così, le concentrazioni finali di agonisti nell'intervallo vasca da 10 PM a 10 pM. Lasciare arteriole a incubare per ~ 10 minuti in ciascuna concentrazione, fino a quando il diametro luminale raggiunge uno stato stazionario.
3. Lavare l'agonista da superfusing PA con aCSF senza farmaci fino a quando il diametro PA è di nuovo al valore originale. Incubare la arteriole parenchimale a Ca ²⁺ -free aCSF (senza BSA) supplementato con 10 mM Diltiazem + 2 mM EGTA per indurre la massima dilatazione e registrare il diametro passiva del arteriole.
4. Rimuovere il arteriole parenchimale dalla cannula tirando con attenzione fuori mentre si tiene nella fine dei legami. Lavare la camera recipiente con acqua deionizzata doppia per rimuovere i detriti e l'eccesso di agonisti. Riempire la camera con Ca2+-free aCSF + BSA e cannulate un'altra arteriole. Non è raccomandato di eseguire più di un esperimento per arteriole.
5. Per eseguire un esperimento reattività miogenico, permettono al arteriole parenchimale equilibrare a 40 mmHg della pressione endoluminale fino a quando viene generato il tono miogenico spontanea (sopra descritto). Ridurre la pressione endoluminale di 5 mmHg e consentire PA si stabilizzi per ~ 5 - 10 minuti, fino a quando il diametro luminale raggiunge lo stato stazionario. Aumentare la graduale pressione intraluminale utilizzando l'intervallo di scelta (ad esempio da 5 a 140 mmHg in 20 mmHg incrementi).
6. Non esporre il arteriole di pressione endoluminale sotto 5 mmHg, in quanto ciò potrebbe causare il collasso e danneggiare l'endotelio, alterando così i risultati dell'esperimento.
7. Alla fine della curva di pressione, superfuse arteriole parenchimale con Ca ^{2 +} -free aCSF (senza BSA) supplementato con 10 mM Diltiazem + 2 mM EGTA e ripetere le operazioni di pressione, a partire dalla lowespressione t.
   NOTA: Questo darà i diametri passivi della PA, che sono necessarie per calcolare% tono miogenico, definiti dalla formula:% tono = (1 - (diametro attivo / diametro passiva)) x 100.

Risultati

La figura 5A mostra una costrizione rappresentante PAs topo a 60 mM KCl aCSF per valutare l'integrità del preparato. PAs dovrebbe costringere tra il 15 - 30% in presenza di 60 mM KCl. Se la costrizione è inferiore al 15%, scartare il PA e cannulate altro, in quanto suggerisce che l'arteriole stato danneggiato durante il processo di isolamento e cannulazione.

La figura 5B illustra PA ...

Discussione

arteriole parenchima cerebrale sono arteriole ad alta resistenza con poche anastomosi e rami che profumato popolazioni neuronali distinti. Questi vasi sanguigni specializzati sono giocatori centrali di autoregolazione cerebrovascolare e accoppiamento neurovascolare attraverso la vasodilatazione mediata ^astrociti-1. L'importanza di questi vasi sanguigni specializzati nella malattia vascolare cerebrale è noto da circa 50 anni, quando il lavoro pionieristico del Dr. Miller Fisher descritto alterazioni strut...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial Cerebrospinal Fluid
NaCl	Fisher Scientific	S-640
KCl	Fisher Scientific	P217
MgCl Anhydrous	Sigma-Aldrich	M-8266
NaHCO3	Fisher Scientific	S233
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9638
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G2870
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9647
Isolation/Cannulation
Stereo Microscope	Olympus	SZX7
Super Fine Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-00
Wiretrol 50 μl	VWR Scientific	5-000-1050
0.2 μm Sterile Syringe Filter	VWR Scientific	28145-477
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97
Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm	Sutter Instruments	B120-69-10
Dark Green Nylon Thread	Living Systems Instrumentation	THR-G
Linear Alignment Single Vessel Chamber	Living Systems Instrumentation	CH-1-LIN
Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump	Living Systems Instrumentation	PS-200
Video Dimension Analyzer	Living Systems Instrumentation	VDA-10
Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software	Living Systems Instrumentation	DAQ-IWORX-404
Heating Unit	Warner Instruments	64-0102
Automatic Temperature Controller	Warner Instruments	TC-324B