분리 및 대뇌 실질 세동맥의 캐 뉼러

요약

This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

초록

실질 소동맥, 관통 소동맥 및 사전 모세관 세동맥을 포함 뇌내 실질 세동맥 (PA는), 뇌 실질에 pial 동맥과 소동맥과 다이빙에서 밖으로 분기 높은 저항 혈관이다. 개별 PA는 실질의 개별 원통형 영역 및 포함 된 뉴런 관류. 이 동맥은 국소 뇌 혈류량 모두 전역 (뇌 자동 조절) 및 (기능 충혈)의 조절에서 중요한 플레이어이다. 전력 증폭기는 신경 혈관 부 뇌 내의 대사 활동 지역 혈류 일치하는 구조의 일부이며 또한 신경의 interneurons 및 성상 세포를 포함한다. 학부모 협의회를 통해 관류 직접 공급 PA의 팽창에 의한 지역 관​​류의 증가에 특정 지역에서 신경 세포 및 신경 세포의 신진 대사를 리드 증가의 활동에 연결되어 있습니다. 보호 지역의 규제는 더 나은 특징의 차이가pial 동맥. 압력에 의한 혈관 수축은 보호 지역에 크고 혈관 확장 메커니즘은 다양합니다. 또한, PA는 혈관 주위 신경에서 외부 신경 분포를받지 않습니다 - 신경 분포가 성상 세포 endfeet와의 접촉을 통해 고유의 자연에 간접적이다. 따라서, pial 동맥을 사용하여 연구에 의해 축적 된 수축 규제에 관한 데이터를 직접 PA 기능을 이해하는 번역하지 않습니다. 고혈압과 당뇨병과 같은 병적 인 상태는, PA 구조와 반응성에 미치는 영향 또한, 확인되지 않은 남아있다. 이 지식 격차는 부분적으로 PA 분리 및 삽관에 관한 기술적 인 문제의 결과이다. 이 논문에서 우리는 고립과 설치류 보호 지역의 삽관을위한 프로토콜을 제시한다. 또한, 우리는 작용제에 의한 수축과 근육 조직 반응성을 포함하여 이러한 세동맥, 수행 할 수있는 실험의 예를 보여줍니다. 이 논문의 초점은 PA 삽관 및 압력 myography에 있지만, PA 고립S는 또한, 생물 리 학적, 생화학, 분자, 및 이미징의 연구에 사용될 수있다.

서문

대뇌 순환 고유 중추 신경 에너지 저장소를 한정 산소 압력과 필요한 영양분 공급의 변화에​​ 따라서 매우 민감 한 세포의 대사 요구 사항을 지원하도록 구성된다. 특정 작업을 수행 할 때 특히 신경 개체군이 활성화 될 때, 혈관 지역 저산소증과 영양분 ^1의 고갈을 방지하기 위해 관류에 매우 지역화 증가를 촉진한다. 이것은 활성 뉴런, 아스트로 사이트, 및 ^뇌동맥이 이루어지는, 신경 혈관 결합이라고도 충혈 기능의 한 형태이며, 신경 혈관 장치의 적절한 작동에 의존한다. 뇌내 실질 세동맥은 혈관 실질 포괄 관통 전 모세관 세동맥의 그룹은,이 응답에 대한 중앙 중요하며, 이는 신경 혈관 커플 링 ^(3)을 조사하기 위해 개별적으로 학습하는 다음 중요하다.

<뇌 내에서 뚜렷한 신경 인구를 관류 - (70 μm의 내경 20) 고 저항 혈관 P 클래스 = "jove_content은"> 실질 소동맥은 작다. 표면에 pial 동맥으로부터 분기, 실질 세동맥은 지하 미세 (그림 1)을 공급하기 위해 거의 90 ^ᵒ 각도로 뇌 실질에 침투. 이 동맥은 모세관 보호 가장 후방 평활근 함유 혈관과 마찬가지로 적절한 관류 압력을 유지하는 데 중요한 역할을한다. 표면 pial 순환 달리 실질 세동맥 담보 지점과 문합이 부족하고, 그 결과 뇌 순환 ^(4)의 "병목 현상"이다. 이 결과, 실질 세동맥의 혈관 장애는인지 손상 및 작은 허혈성 뇌졸중 (또한 자동 또는 열공 스트로크로 알려진)와 같은 뇌 혈관 질환의 발전에 기여한다. 연구 indicat전자가 실질 동맥 부전은 본 태성 고혈압 ^(5), 만성 스트레스 ^(6)에 의해 유도, 작은 혈관 질환 유전 마우스 모델 ^7의 초기 이벤트입니다 수 있습니다. 쥐 단일 관통 세동맥의 추가의 실험적 유도 폐색 이전 인간 ^8에서 관찰되는 원통형, 유사한 작은 허혈성 뇌졸중을 야기하기에 충분하다.

이러한 해부학 적 차이에 더하여, 수축 기능을 조절하는 메커니즘 pial 동맥 및 실질 세동맥 사이에서 다르다. 근육 조직 수축이 가능하기 때문에, 혈관 평활근 세포에서 세포 내 신호 전달 ^12,13 CA의 외인성 신경 분포 ¹⁰ mechanotransduction ^(11)의 고유 모드와 다름이 부족 ^2+, 실질 세동맥 ⁹ 크다. 증거는 내피 세포 의존성 혈관 확장 메커니즘은 이러한 vascu 사이에 차이가 있음을 시사한다^{칼슘을 포함하는} 메커니즘에 더 의존을 나타내는 실질 동맥과 LAR 세그먼트는, 이러한 산화 질소와 prostacyclins ⁽¹⁴⁾ 확산 요인에 비해 혈관 벽에서 K ⁺ 채널과 electrotonic 통신을 부활. 따라서, 데이터는 뇌 관류의 로컬 제어에 대한 지식의 격차를 떠나, 반드시 세동맥을 실질에게 적용되지 않을 수도 있습니다 pial 동맥을 사용하여 실험에 모였다.

그 중요성에도 불구하고, 실질 동맥은 주로 인해 분리 및 생체 연구 실장과 기술적 인 도전에, 아래에 연구 된 광대입니다. 이 논문에서는 분리 압력 myography 사용될 수 있거나 immunolabeling, 전기 생리학, 분자 생물학 및 생화학 적 분석을위한 조직을 분리하는 뇌 실질 세동맥을 cannulate하는 방법을 설명한다.

프로토콜

1. 정맥 및 상공 회의소 준​​비

1. (외경 : 1.2 mm, 내부 직경 : 0.69 mm, 길이 10 mm) 깨끗한 붕규산 유리 모세관을 삽입 백금 필라멘트 (100 μm의 직경)와 피펫 풀러의 홈으로합니다.
2. 적절한 설정을 사용하여 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 길고 얇은 팁 (그림 2)와 캐 뉼러를 생성하는 모세관을 당기십시오. 사용되는 설정은 다음과 같습니다 열 - 700, 당겨 - 100, 속도 - 50 시간 - 10.
3. 압력 myograph 챔버의 홀더에 캐 뉼러를 삽입합니다. 적절하게 캐 뉼러를 맞 춥니 다.
4. 조심 원하는 직경에 대한 해부 현미경 겸자를 사용하여 캐 뉼러의 선단을 깰. 여기서 우리는 10 μm의 팁과 정맥을 (그림 2)를 보여줍니다.
5. 1.8 mM의 ^{칼슘을 포함하는} 인공 뇌척수액 (ACSF)를 모두 캐 뉼러를 채우기; 1 % 소 혈청 ^칼슘 - 무료 ACSF와 챔버를 채우기알부민 (BSA) + 10 μM 딜 티아 젬 (Diltiazem) (모든 용액은 실험 시작 전에 새로운 제조한다). 챔버의 크기에 따라, 5 내지 20 ml의 ACSF 사이의 체적을 변화. 삽관을 시작할 준비가 될 때까지 4 ^ᵒ C의 챔버를 저장합니다.
   참고 : 딜 티아 젬 (Diltiazem)는 삽관을 용이하게 소동맥의 팽창의 원인이됩니다 가역 L 형 전압 게이트 칼슘 억제제이다

실질 소동맥 2. 분리

1. 기관의 동물 관리위원회의 승인을 실험실에서 표준 프로토콜을 사용하여 직전 해부에 동물을 안락사. 일반적으로 사용되는 마취제 대뇌 순환 ¹⁵ 혈관 확장 효과를 가질 수 있으므로 바르 비탈 또는 이산화탄소의 사용이 바람직하다. 여기에 표시된 모든 동물의 절차는 기관 동물 관리 및 의학의 네바다 대학의 대학에서 사용위원회의 승인을, 그리고 AG에있다"동물의 관리 및 사용의 기본 원칙"국립 보건원 (National Institutes of Health)와 reement.
2. 이산화탄소를 이용하여 동물을 안락사. 잘린하기 전에 동물이 호흡을 중지하고 그것의 발을 장착 할 때 응답하지 않았는지 확인합니다.
3. 예리한 가위 (마우스) 또는 길로틴 (쥐)를 사용하여 동물을 참살. 동물의 머리에서 피부를 제거하고 미세 팁 가위를 사용하여 중간 선 두개골 봉합을 따라 절단. 무딘 집게 (마우스) 또는 뼈 플라이어를 사용하여 조심스럽게 두개골 뼈를 제거하고 뇌를 노출합니다. 천천히 조심스럽게 표면 pial 동맥에 손상을주지하기로 뇌를 제거합니다. 얼음에 1 % BSA와 보충 ^칼슘 - 무료 ACSF 20 ㎖로 채워진 용기에 두뇌를 놓습니다.
4. 1 % BSA와 보충 얼음처럼 차가운의 Ca2 + - 무료 ACSF와 패드를 포함하는 해부 접시를 입력하고이 접시 (그림 2A)에 위쪽으로 향하도록 복부 표면과 뇌를 전송합니다. dissec에서 접시를 놓습니다팅 현미경 (그림 3A). 27 게이지 바늘을 사용하여 패드에 머리를 핀. 중간 대뇌 동맥 (MCA) 근처에 핀을 배치 않도록주의하십시오.
5. 윌리스와 그것에서 분파 MCA의 원을 현지화. 날카로운 정렬 Vannas 스프링 가위를 사용하여 MCA 주위에 작은 사각형을 잘라. 그 사각형은 MCA의 전체 길이를 통해에서 5mm 가까이 있는지 확인하십시오. 사각형의 상단 부분은 (윌리스,도 2b, 화살표 원에 인접) 윌리스의 원의 분기점을지나해야합니다.
6. 3mm - Vannas 스프링 가위를 사용하여, 약 2 조직의 깊이에 언더컷을 수행합니다.
   참고 :이 부분은 실질 세동맥의 좋은 절연을위한 핵심이며, 그것은 바로 그걸 얻기 위해 몇 가지 실험이 걸릴 수 있습니다. 절삭 깊이만큼 이루어진 경우 주 단리 실질 세동맥 짧은 것; 상처가 너무 깊은 경우 해부하면 세동맥는 분기점에서 중단 할조직이 제거됩니다.
7. 곤충 핀을 사용하여 위쪽으로 (윌리스의 원에서 말단을) 직면 MCA와 해부 접시에 뇌 슬라이스의 가장 선단을 핀. 얕은 절개가 기본 대뇌 피질 (그렇지 않으면 핀이 유지되지 않음)에 너무 깊이 잘라 않도록 조심하면서, 핀 근처 피아을 절감 할 수 있습니다.
8. 조심스럽게 작은 집게와 피아의 양쪽을 잡고 피질에서 피아를 풀기 시작합니다. 필요한 경우, 주변 pial 멤브레인이 손상되지 않도록 보장 MCA에 잡아.
9. MCA를 포함하는 PIA는 피질에서 나올 때까지 박리 유지합니다. 박리에 대한 저항이 동그라미 윌리스 가까이 증가합니다. 긴 실질 소동맥이 지역에 있기 때문에,이 시점에서 추가주의해야합니다.
10. PIA에는 무료되면 (그림 2B)를 아래로 향하게 세동맥을 실질하기 위해 반대면으로 해부 접시에 패드 위에 조심스럽게 놓습니다.
<리> Vannas 스프링 가위를 사용하여 용기의 끝이 퉁명스럽게 절단되어 있는지 만드는 MCA에서 무료로 해부 동맥을 잘라.
11. 수집 세동맥 압력 myography 분자 분석 또는 기본 평활근 또는 내피 세포의 분리를 위해 사용될 수있다.

3. 압력 Myography

1. 미리 봉합사를 준비합니다. 5mm 조각으로 어두운 녹색 나일론 실을 잘라 페트리 접시에 양면 테이프의 접착면에 배치합니다. 해부 현미경, 미세 집게를 사용하여 필라멘트로 각 부분을 분리, 느슨하게 한쪽 끝을 다른에 필라멘트를 전달하여 간단한 하프 히치 매듭을 준비합니다.
2. 집게를 사용하여, 너무 많은 압력을 잡아하지 않도록하고, 양면 테이프 떨어져 매듭을 선택합니다. 캐 뉼러에 목욕 솔루션, 슬라이드 매듭에 봉합사를 당겨 캐 뉼러의 끝에서 거리를 조입니다. 각 정맥에 2 봉합을 가지고이 과정을 반복합니다.
3. 유리 코트10 % BSA 용액으로 마이크로 피펫 후 1 % BSA와 보충 ^칼슘 - 무료 ACSF와 과잉을 씻어.
4. 유리 마이크로 피펫으로 용액 50 μl를 당깁니다 실질 세동맥을 당겨 압력 myography 챔버로 전송할 수 있습니다. 유리 마이크로 피펫의 내부 챔버에 달라 붙는 것을 방지하기 위해 챔버로 실질 세동맥을 분배하는 하나의 유체 움직임에 플런저를 밀어 넣습니다.
5. 이 슈퍼 미세 집게를 사용하여, 전용 용기의 끝을 터치에주의하면서 PA의 루멘을 엽니 다.
6. 집게를 사용하여 조심스럽게 캐 뉼러에 용기를 당겨 실질 세동맥의 가장자리를 개최합니다. 용기가 캐뉼라 (도 3a)의 가장 테이퍼 된 단부에 있지 않도록 뉼러에 충분히 당긴다.
7. 캐 뉼러에 2 봉합을 풀고 용기 (그림 3B)에이를 조입니다. 공간 용기에 따로 봉합 조금하고, 운전자쪽으로 당겨 tigh 동안열을. 어떤 지점이 실질 세동맥의 반대쪽 끝을 닫기 전에 떨어져 연결되어 있는지 확인합니다.
8. 주위에 실을 켜고 블라인드 골목으로 실질 세동맥의 반대쪽 끝을 닫습니다. 그것을 달성하기 위해, 반대 정맥의 관계를 열고 세동맥에 그것을 전달합니다. 천천히 실질 세동맥이 캐 뉼러의 측면에 연결되는 것 같은 방법으로 매듭을 닫는다. 세동맥의 길이 방향의 신축성을 피하십시오. (그림 3C).
   주 :이 연구의 목적은 루멘을 통해 약을 관류하는 경우, 캐 뉼러의 측면에 실질 세동맥 매 대신 반대쪽 cannulate. 캐 뉼러 어떤 소금 결정 또는 관내 흐름을 차단하는 내부 빌드 업이없는 있는지 확인하십시오. 생리적 수준에서 전단 응력을 유지하기 위해 적절하게 유량을 조절한다. 의 Shih 등.의 연구는 쥐 ⁸ 세동맥을 관통 내부의 유량을 보여주고, 파이의 초기 가이드 역할을 할 수 있습니다많은 연구.
9. 조심 혈관 직경의 기록에 사용되는 현미경의 스테이지로 챔버를 옮긴다. 올바른 튜​​브 관류에 대한 온도 프로브 및 입구와 출구를 연결, 현미경 무대에 챔버를 연결합니다. (압력 변환기에 결합 연동 펌프 등. 물기둥) 실험실에서 사용할 수있는 가압 시스템을 사용하여 40 mmHg의 관내 마우스 실질 세동맥 압력 또는 쥐 세동맥 50 mmHg로에 세동맥 가압.도 4d는 (A)의 예를 도시 압력 변환기에 연결된 연동 펌프는 유관 세동맥을 가압한다.
10. 직경 (그림 3E)의 변화를 감지하는 데 사용되는 시스템을 켭니다. 최상의 검출을 얻기 위해, 이러한 조명 및 콘트라스트 현미경 등의 설정을 조정한다. 이상적으로 세동맥의 벽은 어둡고 루멘 반투명해야한다. 검출이 적절하면, t를 기록하기 시작할그는 실험.
11. superfusion 시스템을 시작합니다. 5 ml / 분 - 3 사이의 유량으로 15 분 20 1.8 밀리미터 칼슘 ^{2 +} 함유 따뜻한 (37 ^ᵒ C) ACSF와 유관, 가압 실질 세동맥을 씻으십시오. 이 ACSF는 딜 티아 젬 (Diltiazem) 또는 BSA를 포함 할 수 없습니다.
12. 준비의 가능성을 평가하기 위해 60 mM의 KCl을 ACSF와 일반 ACSF를 교체합니다. 60 mM의 KCl을 20 % 수축 -이 시점에서 PA는 10을 전시한다. 세동맥 그 정도로 수축되지 않으면 제거하고 다른 세동맥을 cannulate.
13. 일반 ACSF와 60 밀리미터의 KCl을 씻으십시오. 한 시간까지 걸릴 수 자발적인 근육 조직 톤의 생성 때까지 기다립니다. 세동맥 후 근육 조직에서 톤이 없으면 다른 세동맥로 대체.
    주 : 근육 조직 톤 수축 효능 제 또는 고의 KCl 수용액에 의한 자극없이 용기의 내강 직경의 점진적인, 때때로 천천히 감소로서 관찰된다. 근육 조직 톤은 다음에 의해 계산된다 Formula : (1 - (활성 루멘 직경 / 수동 내강 직경)) (100) ⁵ X 근육 조직 톤의 적절한 양 등 치료, 변형, 종의 형질 전환에 따라 다를 수 있습니다.. 30 % ⁽⁵⁾ - 일반적으로 생리 근육 조직 톤 15 범위.

4. 예 압력 Myography 실험 : 작용 물질에 의한 수축과 근육 조직 반응성

1. 적절한 농도를 사용하여 ACSF에서 선택의 작용제의 희석 시리즈를 준비합니다. 현재 예를 들어, 트롬 _{복산로 2} 수용체 작용제 U46619 사용 하였다. 1mm의 농도 U46619 1 ㎖의 스톡 용액을 제조 하였다. 전송 100 μM의 U46619를 함유하는 용액에서 얻어진 약물의 10 배 희석액을 만들어 ACSF 900 μl를 함유 한 새로운 튜브에 1 mM의 용액 100 ㎕. 농도 - 반응 곡선 뱀을 조제 1 mM 내지 100 nm의 범위, 6 희석액이 과정을 반복한다.
2. 추가ACSF을 superfusing 100 ㎖까지 (이후의 모든 투여 량 900 μL이어서 투여 제 1 ㎖,) 작용제를 함유하는 용액의 전량. 이 작용제의 여분의 100 배 희석으로 이어질 것입니다. 따라서, 10 시부 터 10 μM에 목욕 범위에서 작용제의 최종 농도. 내강 직경이 정상 상태에 도달 할 때까지, 세동맥 ~은 각 농도의 10 분 배양 허용.
3. 펜실바니아 직경이 다시 원래 값으로 될 때까지 어떤 약물없이 ACSF와 보호 지역을 superfusing하여 효능을 씻으십시오. 최대 팽창을 유도하고 세동맥의 수동 직경을 기록하는 10 μM 딜 티아 젬 (Diltiazem) + 2 밀리미터 EGTA 보충 (BSA)없이 칼슘 2 ⁺ - 무료 ACSF의 실질 세동맥을 품어.
4. 조심스럽게 관계의 끝으로 잡고 그것을 잡아 당겨 캐 뉼러의 실질 세동맥을 제거합니다. 파편과 효능의 과잉을 제거하기 위해 두 번 탈 이온수로 선박 챔버를 씻으십시오. 칼슘과 챔버를 채우2 + - 무료 ACSF + BSA와는 다른 세동맥을 cannulate. 세동맥 당 하나 이상의 실험을 수행하지 않는 것이 좋습니다.
5. 근원 성 반응성 실험을 수행하기 위해, 자연 근원 성 톤 (전술)가 생성 될 때까지 실질 세동맥 40 mmHg의 관내 압력 평형을 허용한다. 내강 직경이 정상 상태에 도달 할 때까지 10 분 - 5 mmHg로로 관내 압력을 줄이고 PA가 ~ 5 평형을 허용한다. (20 mmHg로 단위로 5 ~ 140 mmHg로에서 예를 들어) 선택의 간격을 이용하여 관내 압력을 단계적으로 증가한다.
6. 그 때문에 실험의 결과를 변경, 내피를 붕괴의 원인과 손상시킬 수 있으므로, 5 mmHg로 아래 관내 압력에 세동맥을 노출시키지 마십시오.
7. 압력 곡선의 끝에서, lowes부터 10 μM 딜 티아 젬 (Diltiazem) + 2 mM의 EGTA 보충 칼슘 (BSA)없이 ^{2 +} -free ACSF와 실질 세동맥을 superfuse와 가압 단계를 반복t 압력.
   주 :이 식으로 정의 % 근육 조직 계조를 계산하는 데 필요한 PA의 수동 직경을 줄 것이다 % 톤 = (1 - (직경 활성 / 비활성 직경)) × 100.

결과

도 5a는 준비의 무결성을 평가하기 위해 60 mM의 KCl을 ACSF에 마우스 학부모 협의회의 대표 수축을 보여줍니다. 60 밀리미터의 KCl의 존재 하에서 30 % - 전력 증폭기 (15) 사이에 수축한다. 협착이 15 % 미만이면, PA 버리고는 세동맥이 단리 삽관 과정에서 손상되었음을 알 수 있듯이, 다른 하나 cannulate.

도 5b는

토론

대뇌 실질 소동맥은 별개의 신경 세포 인구를 관류 몇 문합, 분기와 고 저항 세동맥입니다. 이러한 전문 혈관 성상 세포 매개 성 혈관 확장 ^(1)을 통해 뇌 혈관 자동 조절 및 신경 혈관 커플 링의 중심 선수입니다. 뇌 혈관 질환에서 이러한 전문 혈관의 중요성은 박사 밀러 피셔의 선구적인 작품은 고혈압 환자 사후 ^16의 뇌에서 열공 경색의 영토 내에서 실질 동맥의 구조 변경...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial Cerebrospinal Fluid
NaCl	Fisher Scientific	S-640
KCl	Fisher Scientific	P217
MgCl Anhydrous	Sigma-Aldrich	M-8266
NaHCO3	Fisher Scientific	S233
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9638
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G2870
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9647
Isolation/Cannulation
Stereo Microscope	Olympus	SZX7
Super Fine Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-00
Wiretrol 50 μl	VWR Scientific	5-000-1050
0.2 μm Sterile Syringe Filter	VWR Scientific	28145-477
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97
Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm	Sutter Instruments	B120-69-10
Dark Green Nylon Thread	Living Systems Instrumentation	THR-G
Linear Alignment Single Vessel Chamber	Living Systems Instrumentation	CH-1-LIN
Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump	Living Systems Instrumentation	PS-200
Video Dimension Analyzer	Living Systems Instrumentation	VDA-10
Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software	Living Systems Instrumentation	DAQ-IWORX-404
Heating Unit	Warner Instruments	64-0102
Automatic Temperature Controller	Warner Instruments	TC-324B