Выделение и катетеризация церебральным паренхиматозных артериол

This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Аннотация

Внутримозговые паренхимы артериол (PAS), которые включают в себя паренхимы артериол, проникая артериол и предварительно капиллярные артериол, высокое сопротивление кровеносных сосудов, ветвление из пиальных артерий и артериол и погружения в паренхиму мозга. Индивидуальный PA заливать дискретную цилиндрическую территорию паренхимы и нейроны, содержащиеся в. Эти артериолы являются центральным игроком в регуляции мозгового кровотока как в глобальном масштабе (цереброваскулярные ауторегуляции) и локально (функциональная гиперемия). PAs являются частью нейрососудистое единицы, структура, которая соответствует регионарного кровотока к метаболической активности в головном мозге, а также включает в себя нейроны, интернейронов и астроцитов. Перфузия через ООПТ напрямую связана с активностью нейронов в той или иной территории и увеличение метаболизма нервных клеток, приводят к увеличению в местной перфузии, вызванной дилатации кормов ПА. Регулирование ООПТ отличается от более охарактеризованныйпиальные артерий. Давление индуцированной вазоконстрикции больше в ООПТ и сосудорасширяющие механизмы различаются. Кроме того, ОР не получают примесный иннервации от периваскулярных нервов - иннервации присуща и косвенную в природе через контакт с астроцитов endfeet. Таким образом, данные, касающиеся регулирования сократительной накопленные исследований с использованием пиальных артерий непосредственно не переводят к пониманию функции PA. Кроме того, остается неопределенным, как патологические состояния, такие как гипертония и диабет, влияют на структуру PA и реактивность. Этот пробел в знаниях частично является следствием технических трудностей, связанных с изоляцией ПА и пункции. В этой рукописи мы приводим протокол для изоляции и пункции грызунов ООПТ. Далее, мы покажем примеры экспериментов, которые могут быть выполнены с этими артериол, включая агонист-индуцированную сужением и миогенной реакционной способности. Хотя основное внимание в этой рукописи на П. А. пункции и миографии давления, изолированных PAs также может быть использован для биохимических, биофизических, молекулярных и визуализации исследований.

Введение

Нарушение мозгового кровообращения однозначно организована для поддержки метаболических потребностей центральных нейронов, клеток, которые имеют ограниченные запасы энергии и являются, следовательно, очень чувствительны к изменениям давления кислорода и поставки необходимых питательных веществ. Как отдельные нейронные субпопуляции становится активным , когда конкретные задачи выполняются, сосудистая сеть способствует высоко локализованное увеличение перфузии , чтобы предотвратить местную гипоксию и истощение питательных веществ ^1. Это является одной из форм функциональной гиперемии , известной как нейрососудистое муфте, и зависит от правильной работы нейрососудистое блока, состоящий из активных нейронов, астроциты и мозговых артерий ^2. Внутримозговые паренхимы артериол, группа кровеносных сосудов , охватывающих паренхиматозные, проникающих и предварительно капиллярные артериол, центрально важно для этого ответа и тогда критически изучать их по отдельности, чтобы исследовать сосудисто - нервный муфта ^3.

<р класс = "jove_content"> паренхиматозных артериол небольшие (20 - 70 мкм, внутренний диаметр) высокого сопротивления кровеносных сосудов, что заливать различные популяции нейронов в головном мозге. Ветвление из пиальных артерий на поверхности, паренхиматозные артериолы проникают в паренхиму мозга при почти 90 ^ᵒ угла для подачи подповерхностного микроциркуляцию (рисунок 1). Эти артериолы играют решающую роль в поддержании соответствующего перфузионного давления, поскольку они являются наиболее дистальных гладких мышц сосудов, содержащих защитные капилляры. В отличие от циркуляции поверхности пиальных, паренхиматозные артериол отсутствие побочных ветвей и анастомозов, и , следовательно , являются "узкие места" мозгового кровообращения ^4. В результате дисфункции паренхиматозных артериол способствует развитию сосудистых заболеваний головного мозга, таких как сосудистый когнитивных нарушений и малых ишемических инсультов (также известный как молчащих или лакунарными ударов). Исследования indicatе , что паренхимы артериол дисфункция может быть вызвана гипертонической ^5, ⁶ хронического стресса и является ранним событием в небольшой болезни сосуда модели генетической мыши ^7. Кроме того, экспериментально индуцированной окклюзией одиночных проникающих артериол у крыс достаточно , чтобы вызвать небольшие ишемических инсультов , которые имеют цилиндрическую форму, подобно тем , которые наблюдаются у пожилых людей ^8.

В дополнение к этим анатомических различий, механизмы регуляции сократительной функции различаются между пиальных артерий и артериол паренхимы. Миогенный вазоконстрикции больше в паренхиматозных артериол ^9, возможно , из - за отсутствия внешней иннервации ¹⁰ различных режимов механотрансдукции ^11, а также различия в внутриклеточного Ca ²⁺ сигнализации ^12,13 в клетках гладких мышц сосудов. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что эндотелий-зависимые механизмы сосудорасширяющие также различаются между этими vascuLAR сегменты, с паренхиматозных артериях , проявляющих большую зависимость от механизмов , связанных с Ca ²⁺ -активированную K ⁺ каналы и электротонического связь внутри сосудистой стенки по сравнению с диффундирующих факторов , таких как оксид азота и простациклинов ^14. Таким образом, данные, собранные в экспериментах с использованием пиальных артерий может не обязательно относится к паренхиматозных артериол, оставляя пробелы в наших знаниях местного управления перфузии головного мозга.

Несмотря на их важность, паренхиматозные артериолы являются значительно под изученным, в первую очередь из - за технических проблем , с изоляцией и монтажа для изучения экс естественных условиях. В этой рукописи мы описываем методологию для выделения и вводить иглу церебральных паренхиматозных артериолы, которые могут быть использованы для миография давления, или изолировать ткани для иммунноокрашивания, электрофизиологии, молекулярной биологии и биохимического анализа.

протокол

1. Канюля и Камерный Подготовка

Вставьте чистый боросиликатного стекла капилляров (наружный диаметр: 1,2 мм; внутренний диаметр: 0,69 мм; 10 мм в длину) в пазы пипетки съемник с платиновой нитью (диаметр 100 мкм).
Используя соответствующие настройки, тянуть капилляр , чтобы создать полую иглу с длинным и тонким наконечником (Рисунок 2) с помощью микропипетки съемник. Установки используются: Тепло - 700, Pull - 100, скорость - 50, Время - 10.
Вставьте канюлю в держатель миографа давления камеры. Совместите канюль соответствующим образом.
Осторожно разорвать кончики канюль, используя пинцет под микроскопом рассекает до нужного диаметра. Здесь мы показываем канюлю с наконечником 10 мкм (рисунок 2).
Заполните оба канюль с искусственной цереброспинальной жидкости (ACSF) , содержащего 1,8 мМ Ca ^2+; заполнить камеру с Са ²⁺ -Free ACSF с добавлением 1% телячьей сывороткиальбумин (БСА) + 10 мкМ дилтиазем (все растворы должны быть готовы свежие перед началом эксперимента). В зависимости от размера камеры, варьировать объем ACSF от 5 до 20 мл. Храните камеру при 4 ^ᵒ С до готовности начать катетеризацию.
Примечание: Дилтиазем является обратимым L-типа напряжения закрытого типа ингибитор кальция, который вызывают расширение артериол, что облегчает катетеризацию

2. Выделение паренхиматозных артериол

Усыпить животное непосредственно перед вскрытием с использованием стандартных протоколов в лаборатории, которые одобрены комитетом по уходу за животными учреждения. Использование барбитуратов или диоксида углерода , является предпочтительным, так как другие обычно используемые анестетики могут иметь сосудорасширяющие эффекты в мозгового кровообращения ^15. Все процедуры на животных, показанные здесь, были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета в Университете штата Невада школы медицины, и в АГreement с национальными институтами здоровья "Руководящих принципов в уходе и использовании животного мира".
Эвтаназии животное с использованием углекислого газа. Перед тем как обезглавливание, убедитесь, что животное остановилось дыхание и не отвечает на запросы, когда зажимая лапу.
Обезглавьте животное, используя острый ножницы (мышь) или гильотины (крыса). Удалить кожу от головы животного и разрезают вдоль средней линии черепной швом с использованием тонкого наконечника ножничные. Использование тупым пинцетом (мышь) или костный плоскогубцев осторожно удалить кости черепа и подвергать головной мозг. Удалите мозг медленно и осторожно, чтобы не повредить поверхность пиальных артерии. Поместите мозг в емкость , заполненную 20 мл Ca ²⁺ -Free ACSF , дополненной 1% бычьего сывороточного альбумина на льду.
Заполните рассечение блюдо , содержащее панель с охлажденным льдом Са2 + -Free ACSF , дополненной 1% бычьего сывороточного альбумина и передают в мозг с вентральной поверхностью , обращенной вверх , к этому блюду (фиг.2А). Поместите блюдо под dissecтин микроскоп (рис 3А). Закрепление мозг прокладки с использованием игл 27 размера. Будьте осторожны, чтобы не ставить штифты вблизи средней мозговой артерии (MCA).
Локализуйте Круг Уиллис и MCA разветвлений от него. Используя острые и выровненных весной ножницы Vannas, вырезать небольшой прямоугольник вокруг MCA. Убедитесь, что прямоугольник около 5 мм по горизонтали по всей длине MCA. Верхняя часть прямоугольника должна быть мимо точки ветвления из круга Уиллис (проксимальнее Круг Уиллис, фиг.2В, стрелка).
С помощью пружинных ножниц Vannas, выполнить выточки в глубину ткани в течение примерно 2 - 3 мм.
Примечание: Эта часть имеет решающее значение для хорошей изоляции паренхиматозных артериол, и это может занять несколько попыток, чтобы получить это право. Если разрез примечание сделано достаточно глубоко, изолированные паренхимы артериол будет коротким; если вырезать слишком глубоко, артериол будет перерыв в их точке ветвления, когда вскрывалиткань удаляется.
Придавить самый дальний конец среза мозга в рассекает блюдо с MCA вверх (дистальный от круга Уиллиса) с использованием насекомых булавками. Сделайте неглубокий надрез, чтобы разрезать Пиа рядом с булавкой, соблюдая осторожность, чтобы не порезать слишком глубоко в подстилающий коре головного мозга (в противном случае штырьки не будет держать).
Осторожно захватить каждую сторону Пиа с маленькими щипцами и начинают пилинга Пиа от коры. В случае необходимости, провести на MCA, гарантируя, что окружающая пиальных мембрана не повреждена.
Держите пилинга до Пиа, содержащий MCA не свободен от коры. Обратите внимание, что сопротивление пилинга будет увеличиваться вблизи круга Уиллис. Будьте особенно осторожны в этот момент, потому что чем дольше паренхимы артериол будет в этом регионе.
После того , как Пиа свободен, поместите его тщательно поверх подкладки на рассекает блюдо с поверхности , противоположной паренхиматозных артериол лицевой стороной вниз (рис 2В).
Использование Vannas пружинные ножницы, вырезать расчлененный артериол бесплатно от MCA, убедившись, что концы сосуда вырезают прямо.
Собранные артериолы могут быть использованы для миография давления, молекулярного анализа, или выделения нативной гладкой мускулатуры или эндотелиальных клетках.

Миография 3. Давление

Подготовьте шовный материал раньше времени. Отрежьте темно-зеленый нейлоновой нити на 5 мм кусочки и поместить на липкой стороне двусторонней ленты на чашку Петри. Под микроскопом рассекает, отделить каждую часть в ее нитей с использованием тонких щипцов, и свободно подготовить простую половину сцепки узел, пропуская один конец нити в другую.
Использование щипцов, выбрать узел от двусторонней клейкой ленты, убедившись в том, чтобы не схватить его со слишком большим давлением. Протяните нить в раствор ванны, слайд-узел на канюлю и затяните его на некотором расстоянии от кончика канюли. Повторите этот процесс, чтобы иметь 2 швов на каждом канюлей.
Покройте стекломикропипетка с 10% -ным раствором БСА , а затем смыть избыток с Ca ²⁺ -Free ACSF с добавлением 1% BSA.
Потянуть 50 мкл раствора в стеклянной микропипетки, подтяните паренхимы артериолу и передать Миография давление в камере. Вставьте поршень в одном движении жидкости для дозирования паренхиматозные артериолу в камеру, чтобы предотвратить его от прилипания к внутренней камеры стеклянной микропипетки.
С помощью двух супер тонких щипцов, открыть просвет ПА, соблюдая осторожность, чтобы только прикоснуться к самому концу сосуда.
С помощью щипцов для удержания края паренхимы артериол, аккуратно придерживая сосуд на канюлю. Потяните достаточно далеко на канюле так, чтобы судно не на очень коническим концом полой иглы (фиг.3А).
Ослабьте 2 швов на канюлю и затянуть их на судне (рис 3B). Космические швы друг от друга немного на судне, и тянуть в сторону оператора в то время как Tighдесять его. Убедитесь, что все ветви перевязывают перед закрытием противоположный конец паренхимы артериол.
Включите камеру вокруг и закрыть противоположный конец паренхимы артериол как слепой мешочка. Для достижения этой цели, откройте связи на противоположной канюле и передать его на артериол. Медленно закройте узел таким образом, что через паренхиму артериола будет привязана к стороне канюлей. Избегайте продольный участок артериол. (Рисунок 3C).
Примечание: Если цель исследования состоит в том, чтобы заливать наркотиков через просвет, вводить иглу противоположный конец вместо того, чтобы связывать паренхимных артериолу на сторону канюлей. Убедитесь, что канюля не имеют каких-либо кристаллов соли или внутренние наросты, которые блокируют поток в просвете. Регулируют скорость потока соответствующим образом, чтобы поддерживать напряжение сдвига в пределах физиологических уровней. Исследование, проведенное Shih и др. Показывает скорость потока внутри проникающих артериол у крыс ^8, и может служить в качестве первоначального ориентира для пиМного исследований.
Аккуратно перенести камеру на столик микроскопа, чтобы использовать для записи диаметр сосуда. Закрепить камеру на предметный столик микроскопа, соединяющий датчик температуры и впуск и выходы для перфузии с правильными трубами. Герметизировать артериолу до 40 мм ртутного столба , внутриполостного давления для мыши паренхиматозных артериол или 50 мм рт.ст. для артериолах крыс, используя систему ных давлений в лаборатории (вод.ст., перистальтический насос , соединенный с датчиком давления, и т.д.). На рис 4D показан приведен пример шланговый насос, соединенный с датчиком давления, для создания давления в каннюлирован артериолу.
Включите систему , используемую для обнаружения изменений в диаметре (рис 3Е). Настройка параметров на микроскопе, таких как освещенность и контраст, для того, чтобы получить наилучшее обнаружение возможно. В идеале стенки артериол должны быть темно и просвету полупрозрачными. После обнаружения необходимо, начать запись тон экспериментировать.
Запустите систему суперфузии. Промыть канюлированного, напорная паренхиматозные артериолу с теплым (37 ^ᵒ С) ACSF , содержащего 1,8 мМ Ca ²⁺ в течение 15 до 20 мин при скорости потока между 3 - 5 мл / мин. Это ACSF не должна содержать дилтиазем или БСА.
Замените обычную ACSF с 60 мМ KCl ACSF для оценки жизнеспособности препарата. На данный момент ОО должен демонстрировать 10 - 20% сужением до 60 мМ KCl. Если артериол не сужаются до такой степени, удалять и вводить иглу другой артериолу.
Промойте 60 мМ KCl с регулярным ACSF. Подождите, пока поколение спонтанной миогенной тон, который может занять до одного часа. Если артериол не имеет миогенной тон, а затем, замените его другим артериол.
Примечание: Миогенный тон наблюдается как постепенное, а иногда медленно, уменьшения диаметра просвета сосуда без стимуляции агонистами сократительных или высоким раствором KCl. Миогенный тон рассчитывается по следующей Formula: (1 - (активный диаметр просвета / пассивный диаметр просвета)) х 100 ⁵ Соответствующее количество миогенной тон может варьироваться в зависимости от обработок, штаммы, виды, трансгенов и др.. В общем, физиологические миогенная тона колеблется от 15 - 30% ^5.

4. Пример давления Миография Эксперименты: Агонист-индуцированный Сужение и Миогенный Реакционная

Приготовьте серию разведений агониста выбора в ACSF с использованием соответствующих концентраций. В данном примере был использован тромбоксан А ₂ агониста рецептора U46619. Готовили раствор 1 мл U46619 при концентрации 1 мМ. Передача 100 мкл 1 мМ раствора в новую пробирку, содержащую 900 мкл ACSF, чтобы сделать 10-кратное разведение препарата, в результате чего в растворе, содержащем 100 мкМ U46619. Повторите этот процесс в течение 6 разведений, в пределах от 1 мМ до 100 нМ для получения кривой констриктора концентрация-ответ.
ДобавитьВесь объем раствора, содержащего агонист (1 мл в течение первой дозы, а затем 900 мкл всех последующих доз) до 100 мл superfusing ACSF. Это приведет к дополнительным разбавлением 100-кратным агониста. Таким образом, конечные концентрации агониста в пределах ванны от 10 пМ до 10 мкМ. Разрешить артериол инкубировать в течение ~ 10 минут в каждой концентрации, пока диаметр просвета не достигнет устойчивого состояния.
Промойте агонист по superfusing ОР с ACSF без каких-либо лекарств, пока диаметр ПА не возвращается к исходному значению. Выдержите паренхимы артериолу в Ca ²⁺ -бесплатно ACSF (без БСА) с добавлением 10 мкМ Diltiazem + 2 мМ EGTA , чтобы вызвать максимальное расширение и записывать пассивный диаметр артериол.
Удалите паренхимы артериолу из канюли, осторожно потянув ее, держа в конце связей. Промыть камеру сосуда с двойной деионизированной водой для удаления мусора и избыток агониста. Заполните камеру с Ca2+ -бесплатно ACSF + БСА и другой артериолу иглу. Не рекомендуется выполнять более одного эксперимента для каждого артериол.
Чтобы выполнить миогенный эксперимент реакционной способности, позволяют паренхимных артериола уравновешивают при 40 мм рт.ст. внутриполостного давления до спонтанное миоген- тон не генерируется (описано выше). Уменьшение внутрипросветного давления до 5 мм ртутного столба и позволяют PA уравновешиваться в течение ~ 5 - 10 мин, пока диаметр просвета не достигнет устойчивого состояния. Увеличение внутрипросветного ступенчато давления, используя интервал выбора (например, от 5 до 140 мм ртутного столба, с шагом 20 мм ртутного столба).
Не подвергайте артериолу к внутрипросветного давления ниже 5 мм рт.ст., так как это может вызвать коллапс и повреждение эндотелия, изменяя таким образом результаты эксперимента.
В конце кривой давления, переливать паренхимной артериолу с Ca ²⁺ -бесплатно ACSF (без БСА) с добавлением 10 мкМ Diltiazem + 2 мМ EGTA и повторите шаги давления, начиная с Lowesт давление.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это даст пассивные диаметры ПА, которые необходимы для расчета% миогенной тон, определяется по формуле:% тон = (1 - (активный диаметр / пассивный диаметр)) х 100.

Результаты

На фиг.5А показана репрезентативная перетяжку ОТ мышиных до 60 мМ KCl ACSF для оценки целостности препарата. PAs должны сжиматься в пределах от 15 - 30%, в присутствии 60 мМ KCl. Если сужение менее 15%, отказаться от ПА и иглу еще один, так как она предполагает, что артериол бы...

Обсуждение

Церебральные паренхимы артериол высокие артериол сопротивления с небольшим количеством анастомозов и ветвей, которые заливать различные популяции нейронов. Эти специализированные кровеносные сосуды являются центральными игроками в цереброваскулярной ауторегуляции и нейрососуди?...

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

Funded by NHLBI R01HL091905 (SE), the United Leukodystrophy Foundation CADASIL research grant (FD) and AHA 15POST247200 (PWP). The authors would like to thank Samantha P. Ahchay for providing the image on Figure 1, and Dr. Gerry Herrera, Ph.D., for providing critical comments on the manuscript.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial Cerebrospinal Fluid
NaCl	Fisher Scientific	S-640
KCl	Fisher Scientific	P217
MgCl Anhydrous	Sigma-Aldrich	M-8266
NaHCO₃	Fisher Scientific	S233
NaH₂PO₄	Sigma-Aldrich	S9638
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G2870
CaCl₂	Sigma-Aldrich	C4901
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9647
Isolation/Cannulation
Stereo Microscope	Olympus	SZX7
Super Fine Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-00
Wiretrol 50 μl	VWR Scientific	5-000-1050
0.2 μm Sterile Syringe Filter	VWR Scientific	28145-477
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97
Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm	Sutter Instruments	B120-69-10
Dark Green Nylon Thread	Living Systems Instrumentation	THR-G
Linear Alignment Single Vessel Chamber	Living Systems Instrumentation	CH-1-LIN
Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump	Living Systems Instrumentation	PS-200
Video Dimension Analyzer	Living Systems Instrumentation	VDA-10
Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software	Living Systems Instrumentation	DAQ-IWORX-404
Heating Unit	Warner Instruments	64-0102
Automatic Temperature Controller	Warner Instruments	TC-324B