Isolamento e Canulação da cerebral parenquimatosa Arteríolas

Resumo

This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Resumo

arteríolas parênquima intracerebrais (PAs), que incluem arteríolas parênquima, arteríolas penetrantes e arteríolas pré-capilares, são os vasos sanguíneos de alta resistência que ramificam para fora das artérias e arteríolas pial e mergulhar no parênquima cerebral. PA indivíduo perfundir um território cilíndrica discreta do parênquima e os neurônios contidos. Essas arteríolas é um jogador central na regulação do fluxo sanguíneo cerebral, tanto globalmente (autorregulação vascular cerebral) e localmente (hiperemia funcional). PAs são parte da unidade neurovascular, uma estrutura que corresponde ao fluxo sanguíneo regional de actividade metabólica no interior do cérebro e também inclui neurónios, astrócitos e interneurónios,. Perfusão através PAs está diretamente ligado à atividade de neurônios em que determinado território e aumentos de chumbo metabolismo neuronal a um aumento na perfusão local causado pela dilatação do feed PA. Regulamento das AP é diferente do melhor caracterizadaartérias pial. vasoconstrição induzida pela pressão é maior nos PAs e mecanismos vasodilatadores variar. Além disso, PAs não recebem a inervação extrínseca dos nervos perivasculares - inervação é intrínseca e indireta na natureza através do contato com endfeet astrocitário. Assim, os dados relativos a regulação contrátil acumuladas pelos estudos utilizando artérias pial não se traduz diretamente para a compreensão da função PA. Além disso, permanece indeterminada como os estados patológicos, tais como hipertensão e diabetes, afetar a estrutura PA e reactividade. Essa lacuna de conhecimento é, em parte, uma consequência das dificuldades técnicas relativas ao isolamento PA e canulação. Neste artigo apresentamos um protocolo para o isolamento e canulação de PAs de roedores. Além disso, mostramos exemplos de experiências que podem ser realizadas com estas arteríolas, incluindo constrição induzida por agonista e reactividade miogénica. Embora o foco deste artigo é sobre PA canulação e Miografia pressão, isolado PAs também pode ser utilizado para estudos bioquímicos, biofísicos, moleculares, e de imagem.

Introdução

A circulação cerebral é organizado exclusivamente para suportar as demandas metabólicas dos neurônios centrais, células que têm limitado as reservas de energia e, consequentemente, eram altamente sensíveis a mudanças na pressão de oxigênio e fornecimento de nutrientes necessários. Como particulares subpopulações neuronais torna ativo quando tarefas específicas são realizadas, a vasculatura promove um aumento altamente localizada na perfusão para evitar hipóxia local e esgotamento de nutrientes ^1. Esta é uma forma de hiperemia funcional conhecida como acoplamento neurovascular, e depende do funcionamento adequado da unidade neurovascular, composto de neurónios, astrócitos, activas e artérias cerebrais ^2. Arteríolas parênquima intracerebrais, um grupo de vasos sanguíneos que abrangem parênquima, penetrantes e arteríolas pré-capilares, são centralmente importante para esta resposta e é então crítica para estudá-los individualmente a fim de investigar o acoplamento neurovascular ^3.

arteríolas parenquimatosas são pequenas (20-70 mm de diâmetro interno) vasos sanguíneos de alta resistência que perfundem populações neuronais distintas dentro do cérebro. Ramificação para fora a partir de artérias piais na superfície, arteríolas parenquimatosas penetrar no parênquima cerebral em um ângulo de cerca de 90 ^ᵒ para alimentar a microcirculação subsuperfície (Figura 1). Estes arteríolas desempenhar um papel crítico na manutenção da pressão de perfusão adequada, tal como eles são os vasos contendo musculares lisas mais distais que protegem os capilares. Em contraste com a circulação pial superfície, arteríolas parenquimatosas falta ramos colaterais e anastomose, e, consequentemente, são "estrangulamento" da circulação cerebral ^4. Como resultado, a disfunção das arteríolas parenquimatosas contribui para o desenvolvimento de doenças cerebrovasculares, tais como comprometimento cognitivo vascular e pequenos acidentes vasculares cerebrais isquémicos (também conhecido como acidentes vasculares cerebrais silenciosas ou lacunares). estudos indicade que a disfunção do parênquima arteríolas pode ser induzida por hipertensão essencial ^5, stress crónico ^6, e é um evento precoce em doença dos pequenos vasos modelo de ratinho genética ^7. Oclusão Além disso, induzida experimentalmente das arteríolas penetrantes única em ratos é suficiente para causar pequenos acidentes vasculares cerebrais isquémicos, que são de forma cilíndrica, semelhante aos observados em humanos mais velhos ^8.

Além dessas distinções anatômicas, mecanismos que regulam a função contrátil diferem entre artérias e arteríolas pial do parênquima. Vasoconstrição Miogênica é maior nas arteríolas parenquimatosas ^9, possivelmente devido à falta de inervação extrínseca ^10, modos distintos de mecanotransdução ^11, e diferenças no ^{Ca2 +} intracelular de sinalização ^12,13 nas células musculares lisas vasculares. A evidência sugere que os mecanismos vasodilatadores dependentes do endotélio também diferem entre estes vascusegmentos Lar, com artérias do parênquima que exibem uma maior confiança nos mecanismos que envolvem Ca ²⁺ -activated canais de K ⁺ e comunicação eletrotônicos dentro da parede vascular em comparação com fatores difus�eis tais como óxido nítrico e prostaciclinas ^14. Portanto, os dados reunidos em experimentos usando artérias pial pode não se aplicam necessariamente a do parênquima arteríolas, deixando uma lacuna no nosso conhecimento sobre o controle local da perfusão cerebral.

Apesar da sua importância, arteríolas do parênquima são vastamente sub-estudado, principalmente devido aos desafios técnicos com isolamento e de montagem para o estudo ex vivo. Neste artigo é descrita uma metodologia para isolar e canular arteríolas do parênquima cerebral, o que pode ser utilizado para Miografia pressão, ou para isolar o tecido por imunomarcação, electrofisiologia, biologia molecular, bioquímica e análise.

Protocolo

1. cânula e Preparação Câmara

1. Inserir capilares de vidro de borosilicato limpo (diâmetro externo: 1,2 milímetros; diâmetro interno: 0,69 mm, 10 mm de comprimento) nas ranhuras de um puxador de pipeta com um filamento de platina (diâmetro: 100 mm).
2. Usando as configurações apropriadas, puxar o tubo capilar para gerar uma cânula com uma longa e fina ponta (Figura 2), utilizando um puxador de micropipeta. As definições utilizadas são: Heat - 700, Pull - 100, velocidade - 50, Time - 10.
3. Inserir uma cânula para o titular da câmara de myograph pressão. Alinhe as cânulas de forma adequada.
4. Cuidadosamente quebrar as pontas das cânulas, utilizando um fórceps sob o microscópio de dissecação para o diâmetro desejado. Aqui demonstramos uma cânula com uma ponta de 10 uM (Figura 2).
5. Encha ambas as cânulas com fluido cerebrospinal artificial (aCSF) contendo Ca ²⁺ 1,8 mM; encher a câmara com Ca ^{2 +} livre aCSF suplementado com soro de bovino a 1%albumina (BSA) + Diltiazem 10 uM (todas as soluções devem ser preparadas antes do início da experiência). Dependendo do tamanho da câmara, variar o volume de aCSF entre 5 a 20 ml. Armazenar a câmara a 4 ^ᵒ C até que esteja pronto para começar a canulação.
   NOTA: O diltiazem é um fechado inibidor reversível de cálcio tipo-L de tensão que irá causar a dilatação de arteríolas, que facilita a canulação

2. Isolamento de parenquimatosa Arteríolas

1. Eutanásia do animal imediatamente antes da dissecção utilizando protocolos padrão no laboratório que são aprovados pelo comitê de cuidados com os animais da instituição. A utilização de barbitúricos ou o dióxido de carbono é preferido, como outros anestésicos comumente utilizados podem ter efeitos vasodilatadores na circulação cerebral ^15. Todos os procedimentos com animais mostrados aqui foram aprovados pelo Institutional Animal Care e Use Committee da Universidade de Nevada School of Medicine, e estão em agreement com os Institutos Nacionais de Saúde "Princípios Orientadores do Cuidado e Uso de Animais".
2. Eutanásia do animal utilizando dióxido de carbono. Antes de decapitação, garantir que o animal parou de respirar e não responde quando beliscar suas patas.
3. Decapitar o animal usando uma tesoura afiada (mouse) ou guilhotina (rato). Retire a pele da cabeça do animal e corte ao longo da linha média suturas cranianas usando uma tesoura de ponta fina. Usando uma pinça sem corte (ratinho) ou um alicate óssea remova cuidadosamente os ossos cranianos e expor o cérebro. Remover o cérebro devagar e com cuidado para não danificar artérias pial superfície. Coloque o cérebro em um recipiente cheio com 20 ml de Ca ^{2 +} livre aCSF suplementado com BSA a 1% em gelo.
4. Encher um prato de dissecação contendo um bloco com gelada isenta de Ca2 + aCSF suplementado com 1% de BSA e transferir o cérebro, com a superfície ventral para cima para este prato (Figura 2A). Coloque o prato sob a dissecçãoTing microscópio (Figura 3A). Pin o cérebro para a almofada com agulhas de calibre 27. Tenha cuidado para evitar a colocação de pinos perto da artéria cerebral média (MCA).
5. Localizar o Círculo de Willis eo MCA ramificação dela. Usando Vannas mola tesoura afiada e alinhada, cortar um pequeno retângulo ao redor do MCA. Certifique-se de que rectângulo é cerca de 5 mm de espessura ao longo de todo o comprimento da MCA. A parte superior do retângulo deve ser passado o ponto de ramificação do Círculo de Willis (proximal ao Círculo de Willis, Figura 2B, seta).
6. Usando as tesouras mola Vannas, executar um corte inferior para a profundidade do tecido durante aproximadamente 2-3 mm.
   NOTA: Esta parte é fundamental para um bom isolamento das arteríolas do parênquima, e isso pode levar algumas tentativas para obtê-lo direito. Se o corte é a nota feita a uma profundidade suficiente, as arteríolas parênquima isoladas será curta; se o corte é muito profundo, as arteríolas vai quebrar em seu ponto de ramificação quando a dissecadostecido é removido.
7. Fixar para baixo o final mais distal da fatia do cérebro para o prato de dissecação com o MCA virada para cima (distal do Círculo de Willis), utilizando os pinos de insetos. Faça uma incisão pouco profunda para cortar a pia perto do pino, tomando cuidado para não cortar demasiado profundamente no córtex cerebral subjacente (caso contrário, os pinos não vai segurar).
8. Cuidadosamente pegar cada lado da pia com pequenas pinças e começar a descascar a pia do córtex. Se necessário, segurar o MCA, garantindo que a membrana pial circundante não está danificado.
9. Manter a casca até Pia contendo a MCA é livre a partir do córtex. Note-se que a resistência contra descamação vai aumentar perto do Círculo da Willis. Tenha cuidado extra neste ponto, porque as arteríolas parênquima mais longos será nesta região.
10. Uma vez que a pia é livre, coloque-o cuidadosamente em cima da almofada no prato de dissecação com a superfície oposta à do parênquima arteríolas virados para baixo (Figura 2B).
11. Usando Vannas mola tesoura, cortar as arteríolas dissecados livres do MCA, certificando-se as extremidades do navio são cortadas sem rodeios.
12. arteríolas recolhidos podem ser utilizados para Miografia pressão, a análise molecular, ou o isolamento de músculo liso nativa ou células endoteliais.

Miografia 3. Pressão

1. Prepare a sutura antes do tempo. Cortar o fio de nylon verde escuro em pedaços de 5 mm e coloque no lado pegajoso de uma fita dupla face em uma placa de Petri. Sob o microscópio de dissecação, separar cada parte nos seus filamentos utilizando uma pinça fina e frouxamente preparar um nó meia-engate simples fazendo passar uma extremidade do filamento para o outro.
2. Utilizando uma pinça, pegar um nó fora da fita dupla face, tomando cuidado para não agarrá-lo com muita pressão. Puxar o fio de sutura na solução do banho, nó deslizante na cânula e apertá-lo a uma distância a partir da ponta da cânula. Repita esse processo para ter 2 suturas em cada cânula.
3. Brasão um copomicropipeta com uma solução de BSA a 10% e em seguida enxaguar o excesso de ^{Ca2 +} aCSF -livre suplementado com 1% de BSA.
4. Retire 50 ml de solução para a micropipeta de vidro, puxe uma arteríola do parênquima e transferir para a câmara Miografia pressão. Empurrar o êmbolo com um movimento de fluido para dispensar a arteríola do parênquima para dentro da câmara para evitar que se colem à câmara interna da micropipeta de vidro.
5. Utilizando duas pinças super fino, abra o lúmen do PA, sendo o cuidado de só tocar o final do navio.
6. Usando as pinças para prender os bordos da arteríola parenquimatosa, puxar cuidadosamente o navio para a cânula. Puxar o suficiente sobre a cânula de modo a que o recipiente não é no final muito afunilada da cânula (Figura 3A).
7. Soltar os 2 suturas na cânula e apertá-los a bordo do navio (Figura 3B). Espaço das suturas de distância um pouco sobre o vaso, e puxe para o operador enquanto tighdez lo. Certifique-se de que quaisquer ramos são amarrado antes de fechar a extremidade oposta da arteríola do parênquima.
8. Ligue câmara em torno e fechar a extremidade oposta da arteríola parenquimatosa como um saco-cego. Para conseguir isso, abra os laços sobre a cânula oposto e passá-lo para o arteriole. Lentamente fechar o nó de tal maneira que a arteríola parenquimatosa vai ser ligada ao lado da cânula. Evite estiramento longitudinal da arteríola. (Figura 3C).
   NOTA: Se o objectivo do estudo é para perfundir as drogas através do lúmen, canular a extremidade oposta, em vez de amarrar da arteríola do parênquima para o lado da cânula. Certifique-se as cânulas não tem nenhum cristais de sal ou acúmulos de internos que bloqueiam o fluxo intraluminal. Regular a taxa de fluxo de forma adequada, a fim de manter a tensão de corte dentro dos níveis fisiológicos. Um estudo realizado por Shih et al. Mostra as taxas de fluxo dentro penetrando arteríolas em ratos ^8, e pode servir como um guia inicial para piestudos muito.
9. Transferir cuidadosamente a câmara para a fase do microscópio para ser utilizado para gravar o diâmetro dos vasos. Fixe a câmara para o palco microscópio, ligando sonda de temperatura e entrada e saídas para perfusão aos tubos corretos. Pressurizar a arteríola para 40 mmHg de pressão intraluminal para arteríolas parenquimatosas do rato ou 50 mmHg para arteríolas de rato, usando um sistema de pressão disponíveis no laboratório (coluna de água, a bomba peristáltica acoplada a um transdutor de pressão, etc.). A Figura 4D mostra um exemplo de um bomba peristáltica acoplada a um transdutor de pressão para pressurizar o arteríola canulada.
10. Ligue o sistema usado para detectar alterações no diâmetro (Figura 3E). Ajustar as definições sobre o microscópio, tais como iluminação e contraste, a fim de obter a melhor detecção possível. Idealmente as paredes da arteríola deve ser escuro e translúcido lúmen. Uma vez que a detecção é apropriado, iniciar a gravação de tele experimentar.
11. Inicie o sistema de superfusão. Lava-se a cânula, pressurizado arteríola parenquimatosa com aCSF quente (37 ^ᵒ C) contendo Ca ²⁺ 1,8 mM durante 15 a 20 min a uma taxa de fluxo entre 3-5 ml / min. Este aCSF não deve conter Diltiazem ou BSA.
12. Substitua o aCSF regular com 60 mM KCl aCSF para avaliar a viabilidade da preparação. Neste ponto deve PAs exibem 10-20% constrição ao KCl 60 mM. Se o arteriole não contraem nessa medida, remover e canular outra arteriole.
13. Lavar a KCl 60 mM com aCSF regular. Espere até que geração de tom miogênica espontânea, o que poderia levar até uma hora. Se arteriole não tem tom miogênica até então, substituí-la por outra arteriole.
    NOTA: Miogênica tom é observada como um processo gradual, e por vezes mais lentas, a redução do diâmetro do lúmen do vaso, sem estimulação por agonistas contrácteis ou solução de alta KCl. tom miogênica é calculada pela seguinte formula: (1 - (diâmetro do lúmen ativo / diâmetro luminal passiva)) x 100 ⁵ Uma quantidade apropriada de tom miogênica pode variar de acordo com os tratamentos, distensões, espécie, transgênicos, etc.. Em geral, o tom miogénica fisiológica varia de 15 - 30% ^5.

4. Exemplo Experimentos Miografia Pressão: induzida por agonista constrição e Miogênica reatividade

1. Prepara-se uma série de diluições de um agonista de escolha em aCSF usando concentrações apropriadas. Para o exemplo de corrente foi utilizado o tromboxano _A2 agonista do receptor de U46619. Uma solução de estoque de 1 ml de U46619 a uma concentração de 1 mM foi preparada. Transferir 100 ul da solução de 1 mM para um novo tubo contendo 900 jil de aCSF para obter uma diluição de 10 vezes do fármaco, resultando em uma solução contendo 100 uM U46619. Repetir este processo por 6 diluições, que varia de 1 mM a 100 nM para preparar uma curva de concentração-resposta do constrictor.
2. Adicione otodo o volume da solução que contém o agonista (1 ml para a primeira dose, seguida por 900 ul de todas as doses subsequentes) para 100 ml de superfusing aCSF. Isto irá levar a uma diluição extra de 100 vezes o número de agonista. Assim, as concentrações finais do agonista na gama de banho de 10 pM a 10 uM. Permitir que as arteríolas se a incubar durante ~ 10 minutos em cada concentração, até que atinge um diâmetro luminal de estado estacionário.
3. Lavar o agonista por superfusing PAs com aCSF sem drogas até que o diâmetro PA está de volta ao valor original. Incubar a arteríola do parênquima em Ca ^{2 +} livre aCSF (sem BSA) suplementado com 10 mM Diltiazem + 2 EGTA mM para induzir a dilatação máxima e gravar diâmetro passiva da arteríola.
4. Remova o arteriole parênquima da cânula, puxando-o com cuidado para fora, mantendo na extremidade dos laços. Lava-se a câmara de recipiente com água desionizada duas vezes para remover os detritos e excesso de agonista. Encha a câmara com Ca2+ aCSF -livre + BSA e canular outra arteriole. Não é recomendado para executar mais de uma experiência por arteríolas.
5. Para realizar uma experiência reactividade miogénico, permitir a arteríola parenquimatosa a equilibrar a 40 mmHg de pressão intraluminal até miogénica tom espontâneo é gerado (descrito acima). Reduzir a pressão intraluminal de 5 mmHg e PA permitir a equilibrar durante ~ 5 - 10 min, até diâmetro luminal atinge o estado estacionário. Aumentar a pressão intraluminal por passos usando o intervalo de escolha (por exemplo, de 5 a 140 mmHg, em incrementos de 20 mmHg).
6. Não exponha o arteriole à pressão intraluminal inferior a 5 mmHg, como que poderia causar o colapso e danificar o endotélio, alterando assim os resultados do experimento.
7. No final da curva de pressão, superfuse arteríola parenquimatosa com Ca ^{2 +} livre aCSF (sem BSA), suplementado com 10 uM de diltiazem + EGTA 2 mM e repetir as etapas de pressão, a partir da Lowesa pressão t.
   NOTA: Isto vai dar os diâmetros passivos do PA, que são necessários para calcular% tom miogênica, definidos pela fórmula:% de tom = (1 - (diâmetro ativa diâmetro / passivo)) x 100.

Resultados

A Figura 5A mostra uma constrição representante das AP de ratinho a 60 mM de KCl aCSF para avaliar a integridade da preparação. AP deve constrição entre 15 - 30% na presença de KCI 60 mM. Se a constrição é inferior a 15%, o PA e descartar canular uma outra, uma vez que sugere que a arteríola foi danificado durante o processo de isolamento e a canulação.

A Figura 5B ilustra PA cons...

Discussão

arteríolas parênquima cerebral são arteríolas de alta resistência com poucas anastomoses e ramos que perfundem populações neuronais distintas. Estes vasos sanguíneos especializados são jogadores centrais na auto-regulação cerebrovascular e acoplamento neurovascular através de vasodilatação mediada por astrócitos ^1. A importância destes vasos sanguíneos especializados na doença vascular cerebral é conhecida há aproximadamente 50 anos, quando o trabalho pioneiro do Dr. Miller Fisher descreve...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial Cerebrospinal Fluid
NaCl	Fisher Scientific	S-640
KCl	Fisher Scientific	P217
MgCl Anhydrous	Sigma-Aldrich	M-8266
NaHCO3	Fisher Scientific	S233
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9638
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G2870
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9647
Isolation/Cannulation
Stereo Microscope	Olympus	SZX7
Super Fine Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-00
Wiretrol 50 μl	VWR Scientific	5-000-1050
0.2 μm Sterile Syringe Filter	VWR Scientific	28145-477
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97
Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm	Sutter Instruments	B120-69-10
Dark Green Nylon Thread	Living Systems Instrumentation	THR-G
Linear Alignment Single Vessel Chamber	Living Systems Instrumentation	CH-1-LIN
Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump	Living Systems Instrumentation	PS-200
Video Dimension Analyzer	Living Systems Instrumentation	VDA-10
Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software	Living Systems Instrumentation	DAQ-IWORX-404
Heating Unit	Warner Instruments	64-0102
Automatic Temperature Controller	Warner Instruments	TC-324B