La visualización del parénquima vascular y la regeneración después del 70% hepatectomía parcial en ratones normales

Resumen

Tools used for visualizing vascular regeneration require methods for contrasting the vascular trees. This film demonstrated a delicate injection technique used to achieve optimal contrasting of the vascular trees and illustrate the potential benefits resulting from a detailed analysis of the resulting specimen using µCT and histological serial sections.

Resumen

Un procedimiento de inyección de silicona modificado se utiliza para la visualización del árbol vascular hepática. Este procedimiento consistía en la inyección in vivo del compuesto de silicona, a través de un catéter 26 G, en el portal o vena hepática. Después de la inyección de silicona, los órganos fueron explantados y se prepararon para micro-TC ex-vivo (μCT). El procedimiento de inyección de silicona es un desafío técnico. El logro de un resultado exitoso requiere una amplia experiencia microquirúrgica del cirujano. Uno de los retos de este procedimiento consiste en la determinación de la tasa de perfusión adecuada para el compuesto de silicona. La tasa de perfusión para el compuesto de silicona tiene que ser definido en base a la hemodinámica del sistema vascular de interés. tasa de perfusión inadecuada puede dar lugar a una perfusión incompleta, la dilatación artificial y rotura de árboles vasculares.

La reconstrucción 3D del sistema vascular se basa en la TC y se logró utilizandosoftware preclínica como HepaVision. La calidad del árbol vascular reconstruida estaba directamente relacionada con la calidad de la perfusión de silicona. Posteriormente parámetros vasculares calculadas indicativas de crecimiento vascular, como el volumen vascular total, se calculan en base a las reconstrucciones vasculares. Contrastando el árbol vascular con silicona permitido para la posterior elaboración histológico de la muestra después de μCT de exploración. El espécimen se pueden someter a seccionamiento en serie, el análisis histológico y el escaneo de diapositivas conjunto, y, posteriormente, a la reconstrucción 3D de los árboles vasculares a partir de imágenes histológicas. Este es el requisito previo para la detección de eventos moleculares y su distribución con respecto al árbol vascular. Este procedimiento de inyección de silicona modificada también se puede utilizar para visualizar y reconstruir los sistemas vasculares de otros órganos. Esta técnica tiene el potencial de ser aplicado ampliamente para estudios en relación con la anatomía vascular y crecimiento en varios animales unamodelos de enfermedad de Newcastle.

Introducción

La regeneración hepática es a menudo determinado midiendo el aumento de peso del hígado y el volumen y mediante la evaluación de la tasa de proliferación de hepatocitos ^16. Sin embargo, la regeneración del hígado no sólo es la inducción de la regeneración del parénquima sino también la regeneración vascular ^6. Por lo tanto, el crecimiento vascular debe investigarse más con respecto a su papel en la progresión de la regeneración del hígado. Visualización del sistema vascular hepática es fundamental para avanzar en nuestra comprensión de la regeneración vascular. Numerosos métodos indirectos se han desarrollado para estudiar los mecanismos moleculares subyacentes de la regeneración vascular hepática. Tradicionalmente, la detección de citoquinas (factor de crecimiento endotelial vascular, VEGF) ^14, quimiocinas y sus receptores (CXCR4 / cxcr7 / CXCL12) ⁴ han sido el pilar para el estudio de la regeneración vascular. Sin embargo, un modelo 3D junto con el análisis cuantitativo de la vasculatura añadiría anatómico críticoinformación para obtener una mejor comprensión de la relación importante entre el parénquima hepático y la regeneración vascular.

Para visualizar el sistema vascular hepática, lo que requiere de contraste los árboles vasculares, los ratones fueron inyectados con un agente de contraste de caucho de silicona radiopaca directamente en el portal o árbol vascular venosa hepática. Después de la polimerización de la silicona y la explantación del órgano, las muestras de hígado se sometieron a μCT escaneado con un escáner CT. Las exploraciones dieron lugar a representaciones de imágenes voxel de la silicona de inyección de especímenes ^9.

Para el control de calidad, el sistema vascular se visualizó primero en 3D utilizando software preclínica. La segmentación se realizó mediante el establecimiento de un umbral entre la intensidad de los tejidos blandos y la intensidad del vaso. La máscara buque resultante se visualizan mediante la representación de superficie. El software también permite la determinación manual de los dos parámetros de vascular el crecimiento: la longitud máxima de los vasos y el radio.

Después se usó una software preclínico para reconstrucción 3D de árboles vasculares y posterior cálculo de los territorios vasculares que suministran o de drenaje ^13. Además, este software determina automáticamente ciertos parámetros de crecimiento vascular, como la longitud total de todas las estructuras vasculares visibles también conocidos como la longitud del borde, total o volumen total del vaso.

El procedimiento de perfusión de silicona se realizó en ratones ingenuos y en ratones que se sometieron a 70% de la hepatectomía parcial (PH). Los hígados se recogieron a diferentes puntos de tiempo de observación después de la resección para el análisis vascular y parenquimatoso regeneración hepática mediante la técnica de la visualización y la cuantificación antes mencionada.

Los objetivos principales de esta película son los siguientes: (1) demostrar la delicada técnica de inyección requerida para lograr contraste óptimo y (2) muestran el potencial beneficio resultante from un análisis detallado de la muestra de resultantes utilizando μCT y de serie de secciones histológicas. Después de ver esta película, el lector debe tener una mejor comprensión de cómo inyectar compuesto de silicona en un sistema vascular específico y de la utilidad y aplicabilidad de la técnica.

Protocolo

Los procedimientos que implican sujetos animales han sido aprobados por la Selva de Landesamt für Verbraucherschutz Abteilung und Tiergesundheit Tierschutz, Alemania. Debido a que el sistema venoso portal se visualizó por separado del sistema venoso hepático, se necesitan animales separados para los diferentes árboles vasculares.

1. Reactivos Preparación

1. solución de heparina-solución salina
   1. Añadir 0,1 ml de heparina en 10 ml solución salina (5 UI / ml).
2. mezcla de compuesto de silicona
   1. Añadir 2 ml MV-120 en un tubo de 5 ml. Diluir MV-120 mediante la adición de 3 ml de diluyente MV resultante en una solución de 40%.

2. Portal venosa Sistema de Inyección de silicona

1. laparotomía
   1. Coloque el ratón en la cámara de inducción de la anestesia y anestesiar con isoflurano al 2% y 0,3 L / min de oxígeno.
   2. Fijar el ratón anestesiado en la mesa de operaciones usando la cinta con la inhalación continua de 2% esoflurane y 0,3 L / min de oxígeno. Controle la convergencia pizca de retirada refleja el ratón y empezar la operación si el reflejo está ausente.
   3. Hacer una incisión transversal en el abdomen con unas tijeras para la capa de piel y un coagulador eléctrico para la capa muscular. Mover los intestinos hasta el lado izquierdo utilizando puntas de algodón y cubrir los intestinos con solución salina gasa empapada.
2. La inserción del catéter
   1. Diseccionar la vena porta en el microscopio utilizando micro-pinzas. Coloque una sutura de seda 6-0 por debajo de la vena porta extrahepática, en aproximadamente 1 mm de distancia de su bifurcación y atar sin apretar para su uso posterior.
   2. Inyectar solución preparada heparina-solución salina a través del pene vena (macho) o vena cava inferior (hembra) para la heparinización sistémica para 5 min.
   3. Inserte el calibre 26 (26 G) del catéter con la aguja en la vena portal y fijarlo con una abrazadera
3. La heparina-solución salina y el compuesto de silicona de perfusión
   1. Cargar heparina-solución salina sollución en una jeringa de 5 ml y se encienda el dispositivo de perfusión. Llenar el catéter completamente con solución salina de heparina para evitar burbujas de aire.
   2. Conecte el tubo de extensión al catéter y fijarlos firmemente. Iniciar la perfusión de solución salina de heparina con una velocidad de perfusión de 0,4 ml / min.
   3. sutura pre-colocada Ligar seda 6-0 para la fijación de doble el catéter y bloqueando el flujo de sangre de la vena esplénica y vena mesentérica. Practicar la eutanasia en el ratón por desangrado a través de la perfusión bajo anestesia.
   4. Enjuague el hígado utilizando solución salina durante todo el proceso de perfusión con el fin de mantenerlo húmedo.
   5. Añadir 0,1 ml de agente de curado en el tubo MV-120. Cambiar jeringa de heparina-solución salina para jeringa de silicona.
   6. Iniciar la perfusión de silicona con una velocidad de perfusión de 0,2 ml / min durante aproximadamente 1 min a llenar previamente el sistema de catéter y para llenar el sistema de la vena porta. Detener la perfusión de silicona cuando los vasos en la superficie se vuelven azules.
4. Muestreo
   1. Mantener el hígado in situ until la silicona se polimeriza completamente después de aproximadamente 15 a 30 min. Diseccionar los ligamentos que conectan el hígado y los órganos adyacentes, con cuidado de mantener intacto el hígado. Explante el hígado y lo puso en formalina para su fijación.

3. venosa hepática Sistema de Inyección de silicona

1. Realizar una laparotomía como se realizó en el paso 2.1 y exponer campo operatorio totalmente.
2. La inserción del catéter
   1. Diseccionar la vena porta en el microscopio utilizando micro-pinzas. Coloque una sutura de seda 6-0 por debajo de la vena porta extrahepática, en aproximadamente 1 mm de distancia de su bifurcación y atar sin apretar para su uso posterior.
   2. Inyectar solución preparada heparina-solución salina a través del pene vena (macho) o vena cava inferior (hembra) para la heparinización sistémica para 5 min.
   3. Inserte un catéter de 26 G (sonda 1) con la aguja en la vena portal y fijarlo con una abrazadera. Insertar otro catéter de 26 G (sonda 2) con la aguja en la vena cava inferior y fijarlo con una abrazadera.
   4. Ligar las ramas de la vena cava inferior (incluyendo venas renales izquierda y derecha) y su extremo distal utilizando 6-0 sintético, monofilamento, sutura de polipropileno no absorbible.
3. La heparina-solución salina y el compuesto de silicona de perfusión
   1. Cargar la solución salina de heparina en una jeringa de 5 ml y se encienda el dispositivo de perfusión. Llenar completamente catéter 1 con solución salina de heparina para evitar burbujas de aire. Conecte el tubo de extensión de catéter 1 y fijarlo firmemente. Iniciar la perfusión de heparina-solución salina a una velocidad de 0,4 ml / min.
   2. sutura pre-colocada Ligar seda 6-0 para la fijación de doble el catéter y bloqueando el flujo de sangre de la vena esplénica y vena mesentérica. Practicar la eutanasia en el ratón por desangrado a través de la perfusión bajo anestesia.
   3. Enjuague el hígado utilizando solución salina durante todo el proceso de perfusión con el fin de mantenerlo húmedo. Añadir 0,1 ml de agente de curado en el tubo MV-120. Cambio de heparina-solución salina jeringa con la jeringa de silicona.
   4. Coloque una abrazadera en el suprahepatic vena cava inferior para obstruir el flujo de salida del hígado.
   5. Conectar el tubo de extensión al catéter 2 y comenzar la perfusión de silicona con una velocidad de perfusión de 0,2 ml / min durante aproximadamente 2 minutos para llegar a un volumen vascular hepática objetivo como se informó. Detener la perfusión de silicona cuando los vasos en la superficie se vuelven azules.
4. Muestreo
   1. Diseccionar ligamentos hepáticos evitando cualquier daño al hígado. Explante el hígado y lo puso en formalina para su fijación.

4. Micro-CT (μCT) Escaneo

Para analizar la muestra de hígado extirpado usando μCT, son necesarios los siguientes pasos.

1. Tomar la muestra de hígado de la solución de fijación. Coloque el hígado en la cama μCT. Poner la cama μCT con la muestra de hígado en el μCT.
2. Adquirir topograma antes de iniciar la exploración. Utilice uno subexploración para la muestra de hígado pequeño y dos subscans para muestras grandes.
3. Seleccione un81; protocolo de TC con una alta resolución (por ejemplo, HQD-6565-390-90). Este protocolo adquiere 720 proyecciones con 1.032 x 1.012 píxeles durante una rotación completa con el tiempo de exploración de 90 segundos por exploración secundaria. Iniciar el análisis μCT.

5. Las secciones histológicas seriadas

1. Incrustar la muestra de hígado en parafina en su conjunto después de μCT de exploración. Cortar toda muestra de parafina en secciones 4 micras, lo que resulta en una serie de 2.000 a 2.500 secciones.
2. secciones se tiñen con técnicas de tinción adecuada para visualizar los eventos moleculares de interés como Ki-67 como marcador de proliferación y HMGB1 como marcador de daño isquémico. Determinar la secuencia de la tinción con respecto a la pregunta científica.
3. Utilizar un escáner de diapositivas para digitalizar toda las secciones teñidas.
4. Realizar reconstrucción 3D del árbol (s) vascular (ya sea factible) y visualizar 3D-distribución de los eventos moleculares con respecto al árbol vascular (investigación en curso).

Resultados

Criterios de calidad

La calidad de la inyección de silicona puede ser juzgado a simple vista durante el procedimiento. Los pequeños vasos en la superficie del hígado llenan gradualmente con el compuesto azul. Si se observa la estructura vascular normal en la superficie del hígado, la calidad de la inyección de caucho de silicona era bueno. Si el volumen de perfusión fue insuficiente, los pequeños vasos ...

Discusión

Contrastando el árbol vascular mediante la inyección de silicona y de exploración μCT se ha introducido en modelos de tumores y modelos de enfermedades neurológicas con frecuencia para estudiar la progresión angiogénico ^5,7,8,10. Las mejoras en la metodología de la inyección de silicona se hicieron en el presente estudio para visualizar y cuantificar el crecimiento vascular después de la hepatectomía parcial en ratones.

Hay una serie de pasos críticos que requieren ate...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
PERFUSOR® VI	B.BRAUN	87 222/0
Pipetus®-akku	Hirschmann	9907200
Pipets	Greiner	606180
micro scissors	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 14058-09
micro serrefine	Fine Science Tools (F·S·L)	No.18055-05
Micro clamps applicator	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 18057-14
Straight micro forceps	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 00632-11
Curved micro forceps	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 00649-11
needle-holder	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 12061-01
1 ml syringe	B.Braun	9161406V
5 ml syringe	B.Braun	4606051V
extension and connection lines	B.Braun	4256000	30 cm, inner ø 1.2 mm
6-0 silk (Perma-Hand Seide)	Ethicon	639H
6-0 prolene	Ethicon	8711H
Microfil® MV diluent	FLOW TECH, INC
Microfil® MV - 120	FLOW TECH, INC	MV - 120 (blue)
MV curing agent	FLOW TECH, INC
Heparin 2500 I.E./5 ml	Rotexmedica	ETI3L318-15
Saline	Fresenius Kabi Deutschland GmbH	E15117/D DE
Imalytics Preclinical software	Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, Germany
HepaVision	Fraunhofer MEVIS, Bremen, Germany
NanoZoomer 2.0-HT Digital slide scanner	Hamamatsu Electronic Press, Japan	C9600
Tomoscope Duo CT	CT Imaging GmbH, Erlangen, Germany	TomoScope® Synergy