Visualizzazione dei Vascolare e parenchimale rigenerazione dopo il 70% epatectomia parziale in topi normali

Riepilogo

Tools used for visualizing vascular regeneration require methods for contrasting the vascular trees. This film demonstrated a delicate injection technique used to achieve optimal contrasting of the vascular trees and illustrate the potential benefits resulting from a detailed analysis of the resulting specimen using µCT and histological serial sections.

Abstract

Una procedura di iniezione silicone modificato è stato utilizzato per la visualizzazione dell'albero vascolare epatica. Questa procedura consisteva di iniezione in vivo del composto siliconico, tramite un catetere di G 26, nel portale o vena epatica. Dopo l'iniezione di silicone, organi sono stati espiantati e preparate per la scansione ex-vivo micro-CT (μCT). La procedura di iniezione di silicone è tecnicamente impegnativo. Il raggiungimento di un risultato di successo richiede una vasta esperienza microchirurgico dal chirurgo. Una delle sfide di questa procedura consiste nel determinare il tasso di perfusione adeguata per il composto di silicone. Il tasso di perfusione per il composto di silicone deve essere definito in base al emodinamica del sistema vascolare di interesse. tasso di perfusione inappropriato può portare ad una perfusione incompleta, la dilatazione artificiale e rottura di alberi vascolari.

La ricostruzione 3D del sistema vascolare era basato su TAC e stata ottenuta utilizzandosoftware preclinica quali HepaVision. La qualità dell'albero vascolare ricostruito era direttamente correlato alla qualità di perfusione silicone. parametri vascolari Successivamente calcolati indicativi di crescita vascolare, come il volume vascolare totale, sono stati calcolati sulla base delle ricostruzioni vascolari. Contrasto dell'albero vascolare con silicone consentito per il successivo work-up istologico del campione dopo la scansione μCT. Il campione possono essere sottoposti a sezioni seriate, analisi istologica e scansione scivolo intero, e successivamente alla ricostruzione 3D degli alberi vascolari basati su immagini istologiche. Questo è il presupposto per la rilevazione di eventi molecolari e la loro distribuzione rispetto alla dell'albero vascolare. Questa procedura di iniezione silicone modificato può anche essere utilizzato per visualizzare e ricostruire i sistemi vascolari di altri organi. Questa tecnica ha il potenziale per essere applica estesamente agli studi riguardanti l'anatomia vascolare e la crescita in vari un animalemodelli di malattia ND.

Introduzione

Rigenerazione epatica è spesso determinato misurando l'aumento del peso del fegato e del volume e valutando il tasso di proliferazione epatociti ^16. Tuttavia, la rigenerazione del fegato è non solo induce la rigenerazione parenchimale ma anche la rigenerazione vascolare ^6. Pertanto, crescita vascolare debbano esaminare ulteriormente rispetto al suo ruolo nella progressione della rigenerazione epatica. La visualizzazione del sistema vascolare epatico è fondamentale per far progredire la nostra comprensione della rigenerazione vascolare. Numerosi metodi indiretti sono stati sviluppati per studiare i meccanismi molecolari alla base della rigenerazione vascolare epatico. Tradizionalmente, l'individuazione di citochine (fattore di crescita vascolare endoteliale, VEGF) ^14, chemochine ei loro recettori (CXCR4 / CXCR7 / CXCL12) ⁴ sono stati il pilastro per studiare la rigenerazione vascolare. Tuttavia, un modello 3D insieme con l'analisi quantitativa del sistema vascolare aggiungerebbe anatomica criticainformazioni per ottenere una migliore comprensione del rapporto importante tra la parenchima epatico e la rigenerazione vascolare.

Per visualizzare il sistema vascolare epatica, che richiede contrasto alberi vascolari, i topi sono stati iniettati con un agente di contrasto radiopaco gomma siliconica direttamente nel portale o dell'albero vascolare venosa epatica. Dopo la polimerizzazione del silicone e espianto dell'organo, i campioni di fegato sono stati sottoposti a scansione μCT utilizzando uno scanner CT. Le scansioni hanno portato nelle rappresentazioni di immagini voxel del silicone-iniezione esemplari ^9.

Per controllo di qualità, il sistema vascolare è stato visualizzato in 3D utilizzando il software preclinico. Segmentazione stata eseguita impostando una soglia tra l'intensità tessuto molle e l'intensità nave. La maschera nave risultante è stato visualizzato usando il rendering di superficie. Il software ha permesso anche di determinare manualmente la due parametri di vasculla crescita ar: lunghezza dell'imbarcazione massima e raggio.

Un software preclinico è stato poi utilizzato per la ricostruzione 3D di alberi vascolari e successivo calcolo dei forniscono o drenanti territori vascolari ^13. Inoltre, questo software determinato automaticamente alcuni parametri di crescita vascolare, come la lunghezza totale di tutte le strutture vascolari visibili noto anche come la lunghezza bordo o il volume totale del serbatoio.

La procedura di perfusione silicone è stata eseguita in topi naive e nei topi che hanno subito il 70% epatectomia parziale (PH). I fegati sono stati raccolti in diversi momenti di osservazione dopo resezione per analizzare la rigenerazione del fegato e vascolare parenchimale utilizzando la suddetta tecnica di visualizzazione e la quantificazione.

Gli obiettivi principali di questo film sono: (1) dimostrare la delicata iniezione-tecnica necessaria per raggiungere contrasto ottimale e (2) dimostrare il potenziale beneficio derivante from una dettagliata analisi del campione derivanti utilizzando μCT e sezioni seriali istologiche. Dopo aver visto questo film, il lettore dovrebbe avere una migliore comprensione di come iniettare composto di silicone in un sistema vascolare specifico e l'utilità e applicabilità della tecnica.

Protocollo

Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dalla Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz Abteilung Tiergesundheit und Tierschutz, Germania. Poiché il sistema venoso portale è stato visualizzato separatamente dal sistema venoso epatica, erano necessari animali separate per i diversi alberi vascolari.

1. Reagenti Preparazione

1. soluzione di eparina-salina
   1. Aggiungere 0,1 ml di eparina in 10 ml di soluzione salina (5 IU / ml).
2. miscela composta silicone
   1. Aggiungere 2 ml di MV-120 in una provetta da 5 ml. Diluire MV-120 con l'aggiunta di 3 ml MV diluente per ottenere una soluzione al 40%.

Iniezione 2. Portal venosa silicone sistema

1. La laparotomia
   1. Posizionare il mouse nella camera di induzione dell'anestesia e anestetizzare con 2% isoflurano e 0.3 L / min di ossigeno.
   2. Fissare il mouse anestetizzato sul tavolo operatorio con del nastro con l'inalazione continua del 2% èoflurane e 0.3 L / min di ossigeno. Controllare il toe-pinch ritiro riflesso del mouse e avviare il funzionamento se il riflesso è assente.
   3. Effettuare una incisione trasversale sull'addome con le forbici per lo strato di pelle e un coagulatore elettrica per lo strato muscolare. Spostare gli intestini verso il lato sinistro con punte di cotone e coprire l'intestino con soluzione salina garza imbevuta.
2. inserimento del catetere
   1. Sezionare vena porta al microscopio utilizzando micro-pinza. Posizionare un 6-0 sutura seta sotto la vena porta extraepatica, in circa 1 mm a distanza la sua biforcazione e legarlo liberamente per un uso successivo.
   2. Iniettare soluzione preparata eparina-salina attraverso pene vena (maschio) o vena cava inferiore (femmina) per eparinizzazione sistemica per 5 min.
   3. Inserire il 26-gauge (26 G) catetere con ago nella vena porta e fissarlo con una fascetta
3. Eparina-soluzione salina e composti di silicone perfusione
   1. Carico eparina-salino solution in siringa da 5 ml e accendere dispositivo di perfusione. Riempire il catetere completamente con la soluzione salina eparina per evitare bolle d'aria.
   2. Collegare tubo di prolunga al catetere e fissarli saldamente. Inizia perfusione eparina-salina con un tasso di perfusione di 0,4 ml / min.
   3. Legare sutura 6-0 seta pre-posizionato per doppia fissa il catetere e bloccando il flusso di sangue dalla vena splenica e vena mesenterica. L'eutanasia il mouse per dissanguamento mediante perfusione sotto anestesia.
   4. Risciacquare fegato utilizzando salina durante l'intera procedura di perfusione per mantenerlo umido.
   5. Aggiungere 0,1 ml Catalizzatore nel tubo MV-120. Cambiare siringa eparina-salina per la siringa in silicone.
   6. Inizia perfusione silicone con un tasso di perfusione di 0,2 ml / min per circa 1 min per precompilare il sistema catetere e per riempire il sistema della vena porta. Smettere di perfusione silicone quando i vasi sulla superficie diventano blu.
4. campionatura
   1. Mantenere il fegato in situ untIl silicone è completamente polimerizzato dopo circa 15 a 30 min. Sezionare i legamenti che collegano il fegato e gli organi adiacenti con cura per mantenere intatto il fegato. Espiantare il fegato e metterlo in formalina per il fissaggio.

Iniezione 3. epatica venosa silicone sistema

1. Eseguire laparotomia come eseguito nella fase 2.1 e completamente esposti campo operatorio.
2. inserimento del catetere
   1. Sezionare vena porta al microscopio utilizzando micro-pinza. Posizionare un 6-0 sutura seta sotto la vena porta extraepatica, in circa 1 mm a distanza la sua biforcazione e legarlo liberamente per un uso successivo.
   2. Iniettare soluzione preparata eparina-salina attraverso pene vena (maschio) o vena cava inferiore (femmina) per eparinizzazione sistemica per 5 min.
   3. Inserire un catetere 26 G (catetere 1) con ago nella vena porta e fissarlo con una fascetta. Inserire un altro 26 G catetere (catetere 2) con l'ago in vena cava inferiore e fissarlo con una fascetta.
   4. Legare i rami di vena cava inferiore (tra cui vene renali sinistro e destro) e la sua estremità distale utilizzando 6-0 sintetici, monofilamento, non assorbibile sutura in polipropilene.
3. Eparina-soluzione salina e composti di silicone perfusione
   1. Caricare soluzione di eparina-salina in siringa da 5 ml e accendere dispositivo di perfusione. Riempire il catetere 1 completamente con la soluzione salina eparina per evitare bolle d'aria. Collegare tubo di prolunga al catetere 1 e fissarlo saldamente. Inizia perfusione eparina-salina ad una velocità di 0,4 ml / min.
   2. Legare sutura 6-0 seta pre-posizionato per doppia fissa il catetere e bloccando il flusso di sangue dalla vena splenica e vena mesenterica. L'eutanasia il mouse per dissanguamento mediante perfusione sotto anestesia.
   3. Risciacquare fegato utilizzando salina durante l'intera procedura di perfusione per mantenerlo umido. Aggiungere 0,1 ml Catalizzatore nel tubo MV-120. Scambio eparina-salino siringa con la siringa in silicone.
   4. Posizionare un morsetto sul suprahepatic vena cava inferiore per ostacolare il deflusso del fegato.
   5. Collegare il tubo di estensione per catetere 2 e iniziare perfusione silicone con un tasso di perfusione di 0,2 ml / min per circa 2 minuti per raggiungere un volume vascolare epatica obiettivo come riportato. Smettere di perfusione silicone quando i vasi sulla superficie diventano blu.
4. campionatura
   1. Sezionare i legamenti epatici evitando qualsiasi danno al fegato. Espiantare il fegato e metterlo in formalina per il fissaggio.

4. Micro-CT (μCT) Scansione

Per eseguire la scansione del campione di fegato espiantato utilizzando μCT, sono necessari i seguenti passaggi.

1. Prelevare il campione fegato dalla soluzione di fissaggio. Posizionare il fegato sul letto μCT. Mettere il letto μCT con il campione di fegato nel μCT.
2. Acquisire topogram prima di avviare la scansione. Utilizzare uno subscan per il campione di fegato piccolo e due subscans per grandi campioni.
3. Seleziona un81; protocollo CT ad alta risoluzione (ad esempio, HQD-6565-390-90). Questo protocollo acquisisce 720 proiezioni con 1.032 x 1.012 pixel durante una rotazione completa con il tempo di scansione di 90 secondi per ogni sub-scan. Avviare la scansione μCT.

5. istologiche sezioni seriali

1. Incorporare il campione del fegato in paraffina nel suo complesso dopo la scansione μCT. Tagliare intero campione paraffina in sezioni 4μm, risultante in una serie di 2.000 a 2.500 sezioni.
2. sezioni macchia con tecnica di colorazione appropriata per visualizzare eventi molecolari di interesse come Ki-67 come marker di proliferazione e HMGB1 come marker di danno ischemico. Determinare sequenza di colorazione rispetto alla questione scientifica.
3. Utilizzare uno scanner intera diapositiva per digitalizzare le sezioni colorate.
4. Eseguire 3D-ricostruzione dell'albero vascolare (s) (già possibile) e visualizzare 3D-distribuzione di eventi molecolari rispetto nell'albero vascolare (ricerca in corso).

Risultati

Criteri di qualità

La qualità di iniezione di silicone può essere giudicato ad occhio nudo durante la procedura. I piccoli vasi sulla superficie del fegato riempiono gradualmente con il composto blu. Se la struttura vascolare normale è stato osservato sulla superficie epatica, la qualità iniezione gomma siliconica era buono. Se il volume di perfusione era insufficiente, i piccoli vasi sulla superficie epa...

Discussione

Contrasto dell'albero vascolare mediante iniezione di silicone e scansione μCT è stata introdotta in modelli tumorali e modelli di malattie neurologiche frequentemente per studiare la progressione angiogenico ^5,7,8,10. Miglioramenti nella metodologia di iniezione di silicone sono state fatte in questo studio per la visualizzazione e la quantificazione di crescita vascolare dopo epatectomia parziale in topi.

Ci sono un certo numero di passaggi critici che richiedono attenzion...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
PERFUSOR® VI	B.BRAUN	87 222/0
Pipetus®-akku	Hirschmann	9907200
Pipets	Greiner	606180
micro scissors	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 14058-09
micro serrefine	Fine Science Tools (F·S·L)	No.18055-05
Micro clamps applicator	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 18057-14
Straight micro forceps	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 00632-11
Curved micro forceps	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 00649-11
needle-holder	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 12061-01
1 ml syringe	B.Braun	9161406V
5 ml syringe	B.Braun	4606051V
extension and connection lines	B.Braun	4256000	30 cm, inner ø 1.2 mm
6-0 silk (Perma-Hand Seide)	Ethicon	639H
6-0 prolene	Ethicon	8711H
Microfil® MV diluent	FLOW TECH, INC
Microfil® MV - 120	FLOW TECH, INC	MV - 120 (blue)
MV curing agent	FLOW TECH, INC
Heparin 2500 I.E./5 ml	Rotexmedica	ETI3L318-15
Saline	Fresenius Kabi Deutschland GmbH	E15117/D DE
Imalytics Preclinical software	Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, Germany
HepaVision	Fraunhofer MEVIS, Bremen, Germany
NanoZoomer 2.0-HT Digital slide scanner	Hamamatsu Electronic Press, Japan	C9600
Tomoscope Duo CT	CT Imaging GmbH, Erlangen, Germany	TomoScope® Synergy