Visualisation des vasculaire et parenchymateuse Régénération après 70% hépatectomie partielle chez des souris normales

Résumé

Tools used for visualizing vascular regeneration require methods for contrasting the vascular trees. This film demonstrated a delicate injection technique used to achieve optimal contrasting of the vascular trees and illustrate the potential benefits resulting from a detailed analysis of the resulting specimen using µCT and histological serial sections.

Résumé

Un procédé d'injection de silicone modifié a été utilisé pour la visualisation de l'arbre vasculaire hépatique. Cette procédure est composée d' une injection in vivo du composé de silicone, par l' intermédiaire d' un cathéter 26 G, dans le portail ou la veine hépatique. Après l' injection de silicone, les organes ont été explantées et préparés pour les micro-CT (μCT) à balayage ex vivo. La procédure d'injection de silicone est techniquement difficile. La réalisation d'un résultat positif nécessite une vaste expérience de microchirurgie du chirurgien. L'un des défis de cette procédure consiste à déterminer le taux de perfusion adéquate pour le composé de silicone. Le taux de perfusion du composé de type silicone doit être définie sur la base de l'hémodynamique du système vasculaire d'intérêt. débit de perfusion inappropriée peut conduire à une perfusion incomplète, la dilatation artificielle et rupture des arbres vasculaires.

La reconstruction en 3D du système vasculaire a été basée sur des tomodensitogrammes et a été réalisée en utilisantun logiciel pré-clinique tel que HepaVision. La qualité de l'arbre vasculaire reconstruit était directement liée à la qualité de silicone perfusion. paramètres vasculaires suite calculés indiquant la croissance vasculaire, tels que le volume vasculaire total ont été calculées sur la base des reconstructions vasculaires. Contrastant l'arbre vasculaire avec du silicone permis ultérieure histologique travail-up de l'échantillon après la numérisation μCT. L'échantillon peut être soumis à des coupes sériées, l'analyse histologique et de numérisation de diapositives ensemble, et par la suite à la reconstruction en 3D des arbres vasculaires à partir d'images histologiques. Ceci est la condition sine qua non pour la détection d'événements moléculaires et de leur distribution par rapport à l'arbre vasculaire. Ce procédé d'injection de silicone modifiée peut également être utilisée pour visualiser et reconstruire les systèmes vasculaires des autres organes. Cette technique a le potentiel d'être largement appliquée à des études concernant l'anatomie vasculaire et la croissance dans différents animaux undes modèles de maladies nd.

Introduction

La régénération du foie est souvent déterminée en mesurant l'augmentation du poids du foie et de volume et en évaluant le taux de prolifération des hépatocytes ^16. Cependant, la régénération du foie est non seulement induit la régénération parenchymateuse mais aussi la régénération vasculaire ^6. Par conséquent, la croissance vasculaire doit être étudiée plus avant en ce qui concerne son rôle dans la progression de la régénération du foie. Visualisation du système vasculaire hépatique est essentielle pour faire progresser notre compréhension de la régénération vasculaire. De nombreuses méthodes indirectes ont été développées pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents de la régénération vasculaire hépatique. Traditionnellement, la détection des cytokines (facteur de croissance vasculaire endothéliale, VEGF) ^14, les chimiokines et leurs récepteurs (CXCR4 / CXCR7 / CXCL12) ⁴ ont été le pilier pour étudier la régénération vasculaire. Cependant, un modèle 3D conjointement avec l'analyse quantitative de la vasculature ajouterait anatomique critiqueinformations pour acquérir une meilleure compréhension de la relation importante entre parenchyme hépatique et la régénération vasculaire.

Pour visualiser le système vasculaire du foie, ce qui nécessite contrastante les arbres vasculaires, les souris ont reçu une injection d'un agent de contraste radio-opaque caoutchouc de silicone directement dans le portail ou un arbre vasculaire veineux hépatique. Après polymérisation de la silicone et de l'explantation de l'organe, les échantillons de foie ont été soumis à un balayage μCT en utilisant un scanner CT. Les analyses ont donné lieu à voxel images représentations de la silicone d'injection ⁹ spécimens.

Pour le contrôle qualité, le système vasculaire a été visualisé en premier en 3D en utilisant le logiciel pré-clinique. La segmentation a été effectuée en fixant un seuil entre l'intensité des tissus mous et l'intensité de la cuve. Le masque de cuve résultant a été visualisé en utilisant le rendu de surface. Le logiciel a également permis la détermination manuelle de deux paramètres de vasculcroissance ar: longueur maximale du navire et le rayon.

Un logiciel préclinique a été ensuite utilisé pour la reconstruction 3D des arbres vasculaires et le calcul ultérieur des territoires vasculaires alimentant ou drainant ^13. De plus, ce logiciel détermine automatiquement certains paramètres de la croissance vasculaire, tels que la longueur totale de toutes les structures vasculaires visibles également connu sous le nom de longueur d'arête ou le volume total de la cuve totale.

La procédure de silicone de perfusion a été réalisée chez des souris naïves et chez les souris ayant subi une hépatectomie partielle de 70% (PH). Les foies ont été prélevés à différents temps d'observation après résection pour l'analyse vasculaire et parenchymateuse régénération du foie en utilisant la technique de visualisation et de quantification précitée.

Les objectifs principaux de ce film sont les suivants: (1) démontrer l'injection technique délicate nécessaire pour atteindre contraste optimal et (2) montrent le potentiel fr profit qui en résulteom une analyse détaillée de l'échantillon résultant en utilisant μCT et coupes en série histologiques. Après avoir vu ce film, le lecteur devrait avoir une meilleure compréhension de la façon d'injecter composé de silicone dans un système vasculaire spécifique et de l'utilité et l'applicabilité de la technique.

Protocole

Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz Abteilung Tiergesundheit und Tierschutz, Allemagne. Étant donné que le système veineux porte a été visualisée séparément du système veineux hépatique, des animaux séparés ont été nécessaires pour les différents arbres vasculaires.

1. Réactifs Préparation

1. solution saline Héparine
   1. Ajouter 0,1 ml d'héparine dans 10 ml de sérum physiologique (5 UI / ml).
2. mélange de composés de silicone
   1. Ajouter 2 ml MV-120 dans un tube de 5 ml. Diluer MV-120 en ajoutant 3 ml de diluant MV résultant en une solution à 40%.

Injection 2. Portal Venous système silicone

1. laparotomie
   1. Placer la souris dans la chambre d'induction de l'anesthésie et anesthésier avec 2% d'isoflurane et de 0,3 L / min d'oxygène.
   2. Fixer la souris anesthésiée sur la table d'opération en utilisant du ruban à l'inhalation continue de 2% estoflurane et 0,3 L / min d'oxygène. Vérifiez l'orteil-pincement réflexe de retrait de la souris et lancez l'opération si le réflexe est absent.
   3. Faire une incision transversale sur l'abdomen à l'aide de ciseaux pour la couche de peau et un coagulateur électrique pour la couche musculaire. Déplacer les intestins sur le côté gauche à l'aide des conseils de coton et de couvrir les intestins avec une solution saline gaze imbibée.
2. l'insertion du cathéter
   1. Disséquer la veine porte sous le microscope en utilisant des micro-pinces. Placer une suture de soie 6-0 sous la veine extrahépatique, dans environ 1 mm de distance de sa bifurcation et l'attacher lâchement pour une utilisation ultérieure.
   2. Injecter solution préparée à l'héparine-solution saline via pénienne veine (mâle) ou veine cave inférieure (femelle) pour héparinisation systémique pendant 5 min.
   3. Insérez la jauge 26 (26 G) cathéter avec aiguille dans la veine porte et le fixer avec une pince
3. Heparin-solution saline et composé de silicone perfusion
   1. Charge héparine-solution saline solution dans 5 ml seringue et tourner sur le dispositif de perfusion. Remplir complètement le cathéter avec une solution saline à l'héparine pour éviter les bulles d'air.
   2. Raccorder le tube d'extension au cathéter et les fixer fermement. Démarrer la perfusion saline à l'héparine avec un débit de 0,4 ml / min de perfusion.
   3. Ligaturer suture 6-0 soie pré-placée pour fixer le double du cathéter et bloquant le flux sanguin de la veine splénique et de la veine mésentérique. Euthanatize la souris par exsanguination par perfusion sous anesthésie.
   4. Rincez le foie en utilisant une solution saline pendant toute la procédure de perfusion afin de le garder humide.
   5. Ajouter 0,1 ml durcisseur dans le tube MV-120. Changer la seringue d'héparine-solution saline à la seringue de silicone.
   6. Lancer silicone perfusion avec un débit de perfusion de 0,2 ml / min pendant environ 1 min à préremplir le système de cathéter et pour remplir le système de la veine porte. Arrêtez silicone perfusion lorsque les vaisseaux à la surface deviennent bleus.
4. Échantillonnage
   1. Gardez le foie in situ until le silicone est polymérisée complètement au bout d'environ 15 à 30 min. Disséquer ligaments reliant le foie et les organes adjacents avec soin de garder le foie intact. Explanter le foie et le mettre dans le formol pour la fixation.

Injection 3. hépatique système veineux silicone

1. Effectuer laparotomie comme effectué à l'étape 2.1 et exposer champ opératoire entièrement.
2. l'insertion du cathéter
   1. Disséquer la veine porte sous le microscope en utilisant des micro-pinces. Placer une suture de soie 6-0 sous la veine extrahépatique, dans environ 1 mm de distance de sa bifurcation et l'attacher lâchement pour une utilisation ultérieure.
   2. Injecter solution préparée à l'héparine-solution saline via pénienne veine (mâle) ou veine cave inférieure (femelle) pour héparinisation systémique pendant 5 min.
   3. Insérez un 26 G cathéter (cathéter 1) avec l'aiguille dans la veine porte et le fixer avec une pince. Insérez un autre 26 G cathéter (cathéter 2) avec l'aiguille dans la veine cave inférieure et le fixer avec une pince.
   4. Ligaturer les branches de la veine cave inférieure (y compris les veines rénales gauche et droite) et son extrémité distale à l'aide 6-0 synthétique monofilament, polypropylène non absorbable suture.
3. Heparin-solution saline et composé de silicone perfusion
   1. Chargez une solution d'héparine-solution saline dans 5 ml seringue et tourner sur le dispositif de perfusion. Remplir complètement le cathéter 1 avec une solution saline à l'héparine pour éviter les bulles d'air. Raccorder le tube d'extension pour cathéter 1 et le fixer solidement. Lancer héparine-solution saline perfusion à un débit de 0,4 ml / min.
   2. Ligaturer suture 6-0 soie pré-placée pour fixer le double du cathéter et bloquant le flux sanguin de la veine splénique et de la veine mésentérique. Euthanatize la souris par exsanguination par perfusion sous anesthésie.
   3. Rincez le foie en utilisant une solution saline pendant toute la procédure de perfusion afin de le garder humide. Ajouter 0,1 ml durcisseur dans le tube MV-120. Échange héparine-solution saline seringue avec une seringue de silicone.
   4. Placez une pince sur le suprahepatic veine cave inférieure pour obstruer l'écoulement du foie.
   5. Connecter le tube d'extension au cathéter 2 et commencer silicone perfusion avec un débit de perfusion de 0,2 ml / min pendant environ 2 min pour atteindre un volume vasculaire hépatique objectif tel que rapporté. Arrêtez silicone perfusion lorsque les vaisseaux à la surface deviennent bleus.
4. Échantillonnage
   1. Disséquer ligaments hépatiques évitant toute blessure au foie. Explanter le foie et le mettre dans le formol pour la fixation.

4. Micro-CT (μCT) Numérisation

Pour analyser l'échantillon de foie explanté utilisant μCT, les étapes suivantes sont nécessaires.

1. Prélever l'échantillon de foie de la solution de fixation. Placez le foie sur le lit μCT. Mettez le lit μCT avec l'échantillon de foie dans le μCT.
2. Acquérir topogramme avant de commencer l'analyse. Utilisez un sous-balayage pour le petit échantillon de foie et deux sous-balayages pour les grands échantillons.
3. Sélectionner un81; le protocole CT avec une résolution élevée (par exemple, HQD-6565-390-90). Ce protocole acquiert 720 projections avec 1032 x 1012 pixels au cours d'une rotation complète avec le temps de 90 s par sous-balayage balayage. Démarrez le scan μCT.

5. Les articles série histologiques

1. Incluez l'échantillon de foie dans la paraffine dans son ensemble après la numérisation μCT. Découper l'échantillon de paraffine dans l'ensemble des sections de 4 pm, conduisant à une série de 2 000 à 2 500 parties.
2. sections de tache avec la technique de coloration appropriée pour visualiser les événements moléculaires d'intérêt tels que Ki-67 comme marqueur de prolifération et HMGB1 comme marqueur des lésions ischémiques. Déterminer la séquence de la coloration à l'égard à la question scientifique.
3. Utilisez tout un scanner de diapositives à digitaliser les coupes colorées.
4. Effectuer 3D-reconstruction de l'arbre (s) vasculaire (déjà possible) et de visualiser en 3D la distribution d'événements moléculaires en ce qui concerne l'arbre vasculaire (recherche en cours).

Résultats

Critères de qualité

La qualité de l'injection de silicone peut être évaluée à l'oeil nu pendant la procédure. Les petits vaisseaux à la surface du foie se remplissent progressivement avec le composé bleu. Si la structure vasculaire normale a été observée sur la surface du foie, la qualité de l'injection de caoutchouc de silicone était bonne. Si le volume de perfusion était insuffisa...

Discussion

Contrastante l'arbre vasculaire par injection de silicone et de balayage μCT a été introduit dans des modèles de tumeurs et des modèles de maladies neurologiques fréquemment pour étudier la progression angiogénique ^5,7,8,10. Améliorations à la méthode de l'injection de silicone ont été faites dans la présente étude pour la visualisation et la quantification de la croissance vasculaire après hépatectomie partielle chez la souris.

Il y a un certain nombre d&...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
PERFUSOR® VI	B.BRAUN	87 222/0
Pipetus®-akku	Hirschmann	9907200
Pipets	Greiner	606180
micro scissors	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 14058-09
micro serrefine	Fine Science Tools (F·S·L)	No.18055-05
Micro clamps applicator	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 18057-14
Straight micro forceps	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 00632-11
Curved micro forceps	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 00649-11
needle-holder	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 12061-01
1 ml syringe	B.Braun	9161406V
5 ml syringe	B.Braun	4606051V
extension and connection lines	B.Braun	4256000	30 cm, inner ø 1.2 mm
6-0 silk (Perma-Hand Seide)	Ethicon	639H
6-0 prolene	Ethicon	8711H
Microfil® MV diluent	FLOW TECH, INC
Microfil® MV - 120	FLOW TECH, INC	MV - 120 (blue)
MV curing agent	FLOW TECH, INC
Heparin 2500 I.E./5 ml	Rotexmedica	ETI3L318-15
Saline	Fresenius Kabi Deutschland GmbH	E15117/D DE
Imalytics Preclinical software	Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, Germany
HepaVision	Fraunhofer MEVIS, Bremen, Germany
NanoZoomer 2.0-HT Digital slide scanner	Hamamatsu Electronic Press, Japan	C9600
Tomoscope Duo CT	CT Imaging GmbH, Erlangen, Germany	TomoScope® Synergy