Visualização dos Vascular e parênquima regeneração após 70% hepatectomia parcial em ratos normais

Resumo

Tools used for visualizing vascular regeneration require methods for contrasting the vascular trees. This film demonstrated a delicate injection technique used to achieve optimal contrasting of the vascular trees and illustrate the potential benefits resulting from a detailed analysis of the resulting specimen using µCT and histological serial sections.

Resumo

Um procedimento de injecção de silicone modificado foi usado para a visualização da árvore vascular hepática. Este procedimento consistiu na injecção in vivo do composto de silicone, através de um cateter de 26 G, para o portal ou na veia hepática. Após a injeção de silicone, órgãos foram explantados e preparado para micro-CT (μCT) digitalização ex-vivo. O procedimento de injeção de silicone é tecnicamente desafiador. Alcançar um resultado bem-sucedido requer uma vasta experiência microcirúrgica do cirurgião. Um dos desafios deste procedimento envolve a determinação da taxa de perfusão adequada para o composto de silicone. A taxa de perfusão para o composto de silicone tem de ser definido com base na hemodinâmica do sistema vascular de interesse. taxa de perfusão inadequada pode levar a uma perfusão incompleta, dilatação artificial e ruptura de árvores vasculares.

A reconstrução 3D do sistema vascular foi baseado em tomografias e foi realizada comsoftware pré-clínico, tais como HepaVision. A qualidade da árvore vascular reconstruído foi directamente relacionada com a qualidade da perfusão de silicone. Subsequentemente vasculares parâmetros computados indicativos de crescimento vascular, tais como o volume vascular total, foram calculadas com base nas reconstruções vasculares. Contrastando a árvore vascular com silicone permitido para processamento subsequente histológica do espécime após a digitalização μCT. A amostra pode ser submetida a cortes seriados, análise histológica e diapositivos de todo, e, posteriormente, para a reconstrução 3D das árvores vasculares com base em imagens histológicas. Este é o pré-requisito para a detecção de eventos moleculares e sua distribuição em relação à árvore vascular. Este procedimento de injecção de silicone modificado também pode ser usado para visualizar e reconstruir os sistemas vasculares de outros órgãos. Esta técnica tem o potencial de ser aplicados extensivamente para estudos relativos à anatomia vascular e crescimento em vários animais umamodelos de doenças nd.

Introdução

A regeneração hepática é muitas vezes determinada pela medição do aumento de peso do fígado e do volume e através da avaliação da taxa de proliferação dos hepatócitos ^16. No entanto, a regeneração hepática não só é induzir a regeneração do parênquima, mas também a regeneração vascular ^6. Portanto, o crescimento vascular devem ser investigados no que diz respeito ao seu papel na progressão da regeneração hepática. A visualização do sistema vascular hepática é crítica para avançar a nossa compreensão da regeneração vascular. Numerosos métodos indirectos foram desenvolvidas para estudar os mecanismos moleculares subjacentes à regeneração vascular hepática. Tradicionalmente, a detecção de citocinas (factor de crescimento endotelial vascular, VEGF) ^14, quimiocinas e seus receptores (CXCR4 / CXCR7 / CXCL12) ⁴ ter sido o esteio para estudar a regeneração vascular. No entanto, um modelo 3D em conjunto com a análise quantitativa da vasculatura acrescentaria anatómica críticainformações para obter uma melhor compreensão da relação importante entre o parênquima hepático e regeneração vascular.

Para visualizar o sistema vascular hepática, o que requer contrastando as árvores vasculares, os ratinhos foram injectados com um agente de contraste radiopaco borracha de silicone directamente para o portal ou árvore vascular venoso hepático. Após a polimerização do silicone e explante do órgão, as amostras de fígado foram submetidos a varrimento μCT usando um aparelho de tomografia computadorizada. Os exames resultaram em representações imagem voxel do silicone de injecção ⁹ espécimes.

Para o controlo de qualidade, o sistema vascular foi visualizado pela primeira vez em 3D utilizando o software pré-clínico. Segmentação foi realizada através da criação de um limite entre a intensidade de tecidos moles e a intensidade navio. A máscara navio resultante foi visualizada usando renderização superfície. O software também permitiu a determinação manual dos dois parâmetros de Vasculcrescimento ar: comprimento do navio máxima e raio.

Um software pré-clínico foi então usado para a reconstrução 3D de árvores vasculares e subsequente cálculo dos territórios vasculares fornecimento ou drenagem ^13. Além disso, este software determinado automaticamente certos parâmetros de crescimento vascular, tais como o comprimento total de todas as estruturas vasculares visíveis também conhecido como o comprimento da aresta ou volume total total do vaso.

O procedimento de silicone perfusão foi realizada em camundongos normais e em ratos que foram submetidos a 70% hepatectomia parcial (HP). Os fígados foram recolhidos a diferentes pontos de tempo de observação após a ressecção para analisar vascular e do parênquima regeneração do fígado utilizando a técnica de visualização e quantificação acima mencionado.

Os objetivos principais deste filme são: (1) demonstrar a injeção delicada técnica necessária para atingir contraste ideal e (2) mostram o potencial fr benefício resultanteom uma análise detalhada da amostra resultantes usando μCT e cortes seriados histológicas. Depois de assistir a este filme, o leitor deve ter uma melhor compreensão de como injetar composto de silicone em um sistema vascular específico e da utilidade e aplicabilidade da técnica.

Protocolo

Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz Abteilung Tiergesundheit und Tierschutz, Alemanha. Porque o sistema venoso portal foi visualizado separadamente a partir do sistema venoso hepático, foram necessários animais separados para as diferentes plantas vasculares.

1. Reagentes Preparação

1. A heparina-solução salina
   1. Adicionar 0,1 ml de heparina em 10 ml de solução salina (5 UI / ml).
2. mistura de composto de silicone
   1. Adicionar 2 ml de MV-120 em um tubo de 5 ml. Diluir MV-120 por adição de 3 ml de diluente MV resultante em uma solução a 40%.

Injeção 2. Portal venoso Sistema de Silicone

1. Laparotomia
   1. Posicione o mouse na câmara de indução da anestesia e anestesiar-lo com isoflurano a 2% e 0,3 L / min de oxigênio.
   2. Corrigir o rato anestesiado na mesa de operação usando a fita com a inalação contínua de 2% éoflurane e 0,3 L / min de oxigénio. Verifique a retirada reflexa toe-pitada do mouse e começar a operação, se o reflexo está ausente.
   3. Faça uma incisão transversal no abdome com uma tesoura para a camada de pele e um coagulador elétrica para a camada muscular. Mover os intestinos para o lado esquerdo, utilizando pontas de algodão e cobrir os intestinos com solução salina gaze embebida.
2. A inserção de cateter
   1. Dissecar veia porta ao microscópio utilizando micro-fórceps. Coloque um 6-0 sutura de seda por baixo da veia porta extra-hepática, em aproximadamente à distância de 1 mm a sua bifurcação e amarrá-lo livremente para uso posterior.
   2. Injectar solução preparada heparina-soro na veia peniana (masculino) ou veia cava inferior (feminino) para heparinização sistêmica por 5 min.
   3. Insira o de calibre 26 (26 g) de cateter com agulha na veia porta e corrigi-lo com uma pinça
3. solução salina-heparina e composto de silicone perfusão
   1. Carga Sol heparina-solução salinaution em 5 ml seringa e ligar dispositivo de perfusão. Encher o cateter totalmente com solução de heparina-solução salina para evitar bolhas de ar.
   2. Ligue o tubo de extensão ao cateter e corrigi-los com firmeza. Iniciar a perfusão com solução salina de heparina, com uma taxa de perfusão de 0,4 ml / min.
   3. sutura pré-colocado ligadura de seda 6-0 para fixar o dobro do cateter e bloqueando o fluxo de sangue da veia esplênica e veia mesentérica. Euthanatize o mouse por sangria através de perfusão sob anestesia.
   4. Lavar o fígado utilizando solução salina durante todo o procedimento de perfusão, a fim de mantê-lo úmido.
   5. Adicionar 0,1 ml de agente de cura para o tubo de MV-120. Mudar seringa heparina-solução salina para uma seringa de silicone.
   6. Iniciar a perfusão de silicone com uma taxa de perfusão de 0,2 ml / min, durante cerca de 1 min para prefill o sistema de cateter e para encher o sistema da veia porta. Pare de perfusão silicone quando os vasos na superfície ficar azul.
4. Amostragem
   1. Manter o fígado in-situ untIL o silicone está totalmente polimerizada depois de aproximadamente 15 a 30 minutos. Dissecar ligamentos que ligam o fígado e órgãos adjacentes, com o cuidado de manter o fígado intacto. Explante o fígado e colocá-lo em formol para fixação.

Injeção 3. hepática venosa Sistema de Silicone

1. Execute laparotomia como foi executado no passo 2.1 e expor campo operatório totalmente.
2. A inserção de cateter
   1. Dissecar veia porta ao microscópio utilizando micro-fórceps. Coloque um 6-0 sutura de seda por baixo da veia porta extra-hepática, em aproximadamente à distância de 1 mm a sua bifurcação e amarrá-lo livremente para uso posterior.
   2. Injectar solução preparada heparina-soro na veia peniana (masculino) ou veia cava inferior (feminino) para heparinização sistêmica por 5 min.
   3. Insira um cateter 26 G (cateter 1) com agulha na veia porta e corrigi-lo com uma pinça. Insira outro 26 G cateter (sonda 2) com agulha na veia cava inferior e corrigi-lo com uma pinça.
   4. Ligadura dos ramos da veia cava inferior (incluindo veias renais direita e esquerda) e sua extremidade distal usando 6-0 sintética, monofilamento, fio de polipropileno não absorvível.
3. solução salina-heparina e composto de silicone perfusão
   1. Carregar solução de heparina salina em 5 ml seringa e ligar dispositivo de perfusão. Encher um cateter completamente com solução de heparina-solução salina para evitar bolhas de ar. Ligue o tubo de extensão de cateter 1 e corrigi-lo com força. Iniciar a perfusão com solução salina de heparina, a uma taxa de 0,4 ml / min.
   2. sutura pré-colocado ligadura de seda 6-0 para fixar o dobro do cateter e bloqueando o fluxo de sangue da veia esplênica e veia mesentérica. Euthanatize o mouse por sangria através de perfusão sob anestesia.
   3. Lavar o fígado utilizando solução salina durante todo o procedimento de perfusão, a fim de mantê-lo úmido. Adicionar 0,1 ml de agente de cura para o tubo de MV-120. Troca heparina-solução salina com uma seringa seringa de silicone.
   4. Colocar um grampo na suprahepatic veia cava inferior para obstruir a saída do fígado.
   5. Ligue o tubo de extensão de catéter 2 e começar a perfusão de silicone com uma taxa de perfusão de 0,2 ml / min durante aproximadamente 2 minutos para alcançar um volume vascular hepática objectivo como relatado. Pare de perfusão silicone quando os vasos na superfície ficar azul.
4. Amostragem
   1. Dissecar ligamentos hepáticas, evitando qualquer dano ao fígado. Explante o fígado e colocá-lo em formol para fixação.

4. Micro-CT (μCT) Scanning

Para digitalizar a amostra do fígado explantado usando μCT, são necessários os seguintes passos.

1. Leve a amostra do fígado para fora da solução de fixação. Coloque o fígado para a cama μCT. Coloque a cama μCT com a amostra de fígado para o μCT.
2. Adquirir topograma antes de iniciar a digitalização. Use um subscan para a amostra de fígado pequeno e duas subscans para grandes amostras.
3. Selecione uma81; protocolo CT com uma alta resolução (por exemplo, HQD-6565-390-90). Este protocolo adquire 720 projeções com 1.032 x 1.012 pixels, durante uma rotação completa com o tempo de varredura de 90 segundos por sub-scan. Inicie a digitalização μCT.

5. histológicos cortes seriados

1. Incorporar o modelo de fígado em parafina como um todo após a digitalização μCT. Amostra cortada em secções de parafina todo 4μm, resultando numa série de secções de 2.000 a 2.500.
2. seções mancha com técnica de coloração adequada para visualizar eventos moleculares de interesse, como Ki-67 como marcador de proliferação e HMGB1 como um marcador de dano isquêmico. Determinar seqüência de coloração em relação à questão científica.
3. Use um scanner de slides inteira para digitalizar as secções coradas.
4. Execute 3D-reconstrução da árvore vascular (s) (já possível) e visualizar 3D-distribuição dos eventos moleculares em relação à árvore vascular (pesquisa em andamento).

Resultados

Critérios de qualidade

A qualidade da injecção de silicone pode ser julgada a olho nu durante o procedimento. As pequenas embarcações na superfície do fígado preencher gradualmente com o composto azul. Se a estrutura vascular normal foi observada sobre a superfície do fígado, a qualidade da injecção de borracha de silicone foi boa. Se o volume de perfusão foi insuficiente, os pequenos vasos na supe...

Discussão

Contrastando a árvore vascular por injecção de silicone e digitalização μCT foi introduzido em modelos de tumor e modelos de doenças neurológicas frequentemente para estudar a progressão ^5,7,8,10 angiogénico. Melhorias na metodologia de injecção de silicone foram feitas no presente estudo para visualizar e quantificar o crescimento vascular após hepatectomia parcial em ratos.

Há uma série de passos críticos que necessitam de atenção para conseguir uma boa qualida...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
PERFUSOR® VI	B.BRAUN	87 222/0
Pipetus®-akku	Hirschmann	9907200
Pipets	Greiner	606180
micro scissors	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 14058-09
micro serrefine	Fine Science Tools (F·S·L)	No.18055-05
Micro clamps applicator	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 18057-14
Straight micro forceps	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 00632-11
Curved micro forceps	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 00649-11
needle-holder	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 12061-01
1 ml syringe	B.Braun	9161406V
5 ml syringe	B.Braun	4606051V
extension and connection lines	B.Braun	4256000	30 cm, inner ø 1.2 mm
6-0 silk (Perma-Hand Seide)	Ethicon	639H
6-0 prolene	Ethicon	8711H
Microfil® MV diluent	FLOW TECH, INC
Microfil® MV - 120	FLOW TECH, INC	MV - 120 (blue)
MV curing agent	FLOW TECH, INC
Heparin 2500 I.E./5 ml	Rotexmedica	ETI3L318-15
Saline	Fresenius Kabi Deutschland GmbH	E15117/D DE
Imalytics Preclinical software	Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, Germany
HepaVision	Fraunhofer MEVIS, Bremen, Germany
NanoZoomer 2.0-HT Digital slide scanner	Hamamatsu Electronic Press, Japan	C9600
Tomoscope Duo CT	CT Imaging GmbH, Erlangen, Germany	TomoScope® Synergy