正常マウスで70％肝切除後の血管と実質再生の可視化

要約

Tools used for visualizing vascular regeneration require methods for contrasting the vascular trees. This film demonstrated a delicate injection technique used to achieve optimal contrasting of the vascular trees and illustrate the potential benefits resulting from a detailed analysis of the resulting specimen using µCT and histological serial sections.

要約

変性シリコーンの注入手順は、肝臓の血管樹の視覚化のために使用しました。この手順は、ポータルまたは肝静脈に、26 Gカテーテルを介して、シリコーン化合物の生体内注射からなりました。シリコーン注入後、臓器を外植し、ex vivoでのマイクロCT（μCT）スキャンのために準備します。シリコーン注入手順は、技術的に困難です。成功した結果を達成することは、外科医からの豊富な顕微経験が必要です。この手順の課題の一つは、シリコーン化合物のための適切な灌流速度を決定することを含みます。シリコーン化合物のための灌流速度は、対象の血管系の血行動態に基づいて定義される必要があります。不適切な灌流速度は、血管木の不完全灌流、人工拡張および破裂につながることができます。

血管系の3D再構成は、CTスキャンに基づいていたと使用して達成されましたこのようなHepaVisionとして前臨床ソフトウェア。再構築された血管樹の品質が直接シリコーン灌流の品質に関連していました。このような総血管容積のような血管の成長の指標と続い計算血管パラメータは、血管の再構成に基づいて計算しました。 μCTスキャン後の試験片のその後の組織学的後処理のために許可されたシリコーンと血管樹を対比。試料を連続切片、組織学的分析及び全スライドスキャンを、その後、組織の画像に基づいて血管樹の3D再構成を行うことができます。これは、分子事象および血管樹に関するそれらの分布を検出するための前提条件です。この変性シリコーン注入手順は、他の器官の血管系を可視化し、再構成するために使用することができます。この技術は、広く様々な動物aで血管の解剖学的構造と成長についての研究に適用する可能性を有しています目の疾患モデル。

概要

肝再生は、多くの場合、肝臓重量および体積の増加を測定することによって、および肝細胞増殖速度^16を評価^することによって決定されます。しかし、肝臓の再生だけでなく、実質の再生だけでなく、血管再生^6を誘導されます。したがって、血管の成長はさらに、肝臓再生の進行におけるその役割に関して調査する必要があります。肝臓の血管系の可視化は、血管再生の我々の理解を進めるために重要です。多数の間接的な方法は、肝臓の血管再生の根底にある分子メカニズムを研究するために開発されてきました。伝統的に、サイトカインの検出（血管内皮増殖因子^{、VEGF）14は} 、ケモカインおよびその受容体（CXCR4 / CXCR7 / ^{CXCL12）4は、}血管再生を研究するための主力でした。しかし、血管系の定量分析と一緒に3Dモデルが重要な解剖学的を追加します肝実質と血管の再生の間の重要な関係のより良い理解を得るための情報。

血管ツリーを対比必要肝臓の血管系を可視化するために、マウスを直接門脈又は肝静脈血管樹に放射線不透過性のシリコーンゴムの造影剤を注入しました。シリコーン及び器官の外植の重合後に、肝臓試料を、CTスキャナーを使用してμCTスキャンを行いました。スキャンは、ボクセルの画像表現をもたらし シリコーン注入標本^9。

品質管理のために、血管系は、最初の臨床前のソフトウェアを使用して3Dで可視化しました。セグメント化は、軟組織の強度と血管強度の閾値を設定することによって行いました。得られた容器マスクは表面レンダリングを用いて可視化しました。ソフトウェアはまた、vasculの二つのパラメータを手動で決意に許可しますarの成長：最大血管長と半径。

前臨床ソフトウェアは、次いで、血管樹および供給または排出する血管領域¹³のその後の計算の3次元再構成のために使用しました。また、このソフトウェアは自動的にそのようなも総エッジ長や総容器容積として知られている全ての可視血管構造の全体の長さなどの血管の成長の特定のパラメータを、決定しました。

シリコーン灌流手順はナイーブマウスにおいて、70％部分肝切除（PH）を受けたマウスで行いました。肝臓は、前述の可視化および定量化技術を使用して、血管と実質肝再生を分析するための切除後の異なる観測時点で採取しました。

この映画の主な目的は、次のとおりです。（1）最適な対照的なを達成するために必要な繊細な注入技術を実証し、（2）FRを結果として潜在的な利益を示しますμCTおよび組織学的連続切片を用いて得られた試​​料のオム詳細な分析。この映画を見た後、読者が特定の血管系にシリコーン化合物を注入する方法のと技術の有用性と適用性をよりよく理解している必要があります。

プロトコル

動物を対象とする手順は、テューリンゲンのLandesamtエリーゼVerbraucherschutz Abteilung TiergesundheitウントTierschutz、ドイツによって承認されています。門脈系が肝静脈系とは別に可視化したので、別々の動物は異なる血管木のために必要でした。

1.試薬の調製

1. ヘパリン - 生理食塩水
   1. 10ミリリットルの生理食塩水（5 IU / mL）に0.1ミリリットルのヘパリンを追加します。
2. シリコーン化合物の混合物
   1. 1 5ミリリットルチューブに2ミリリットルMV-120を追加します。 40％溶液をあるために3 mlのMVの希釈剤を添加することによって、MV-120を希釈します。

2.ポータル静脈系シリコーンインジェクション

1. 開腹
   1. 麻酔導入チャンバー内にマウスを置き、2％イソフルランおよび0.3リットル/分の酸素とそれをanaesthetize。
   2. 2％の連続吸入でテープを使用して、オペレーティングテーブルの上に麻酔したマウスをされている修正プログラムofluraneおよび0.3リットル/分の酸素。マウスの足指ピンチ引っ込め反射をチェックして、反射が存在しない場合は、操作を開始します。
   3. スキン層と筋肉層のための電気凝固のためのはさみを使用して腹部に横切開を行います。綿のヒントを使用して、左側に腸を移動し、生理食塩水に浸したガーゼで腸にカバーしています。
2. カテーテルの挿入
   1. マイクロピンセットを用いて、顕微鏡下で門脈を解剖。その分岐部に1mm程度の距離で、肝外門脈の下に1 6-0絹縫合糸を置き、後で使用するために緩くそれを結びます。
   2. 5分間の全身ヘパリン化のための陰茎静脈（オス）または下大静脈（メス）を介して調製ヘパリン生理食塩水を注入します。
   3. 門脈に26ゲージ針を用いて（26 G）カテーテルを挿入し、クランプで固定します
3. ヘパリン生理食塩液とシリコーン化合物灌流
   1. 負荷ヘパリン生理食塩水ゾル5ミリリットルの注射器でutionと灌流装置の電源をオンにします。気泡を避けるために、ヘパリン生理食塩水で十分にカテーテルを埋めます。
   2. カテーテルに延長チューブを接続し、しっかりとそれらを修正。 0.4ミリリットル/分の灌流速度でヘパリン生理食塩水灌流を開始します。
   3. 事前配置された二重カテーテルを固定し、脾静脈および腸間膜静脈からの血流を遮断するための6-0絹縫合糸を結紮。麻酔下での灌流を介して放血によりマウスをEuthanatize。
   4. しっとりそれを維持するために、全体の灌流処置中に生理食塩水を使用して肝臓をすすぎます。
   5. MV-120チューブに硬化剤を0.1ミリリットルを追加します。シリコーン注射器にヘパリン生理食塩水の注射器を変更します。
   6. カテーテルシステムを事前入力し、門脈系を充填するために、約1分間0.2 ml /分の灌流速度でシリコーン灌流を開始します。表面の血管が青色の電源を入れたときにシリコーン灌流を停止します。
4. サンプリング
   1. UNT in-situで肝臓を保ちますILは、シリコーンは、完全に、約15〜30分後に重合されます。無傷の肝臓を維持するために注意して肝臓や隣接臓器を結ぶ靭帯を解剖。肝臓を外植し、固定のためにホルマリンに入れて。

3.肝静脈系シリコーンインジェクション

1. ステップ2.1で実行されるように開腹術を行い、完全に術野を公開します。
2. カテーテルの挿入
   1. マイクロピンセットを用いて、顕微鏡下で門脈を解剖。その分岐部に1mm程度の距離で、肝外門脈の下に1 6-0絹縫合糸を置き、後で使用するために緩くそれを結びます。
   2. 5分間の全身ヘパリン化のための陰茎静脈（オス）または下大静脈（メス）を介して調製ヘパリン生理食塩水を注入します。
   3. 門脈に針で1 26 Gカテーテル（カテーテル1）を挿入し、クランプで固定します。下大静脈に針を持つ別の26のGカテーテル（カテーテル2）を挿入し、クランプで固定します。
   4. 6-0の合成、モノフィラメント、非吸収性ポリプロピレン縫合糸を用いて、（左と右腎静脈を含む）下大静脈とその先端の枝を結紮。
3. ヘパリン生理食塩液とシリコーン化合物灌流
   1. 5ミリリットルの注射器にヘパリン生理食塩水ソリューションをロードし、灌流装置の電源をオンにします。気泡を避けるために、ヘパリン - 生理食塩液で完全にカテーテル1を入力します。カテーテル1に延長チューブを接続し、しっかりと固定します。 0.4ミリリットル/分の速度でヘパリン生理食塩水灌流を開始します。
   2. 事前配置された二重カテーテルを固定し、脾静脈および腸間膜静脈からの血流を遮断するための6-0絹縫合糸を結紮。麻酔下での灌流を介して放血によりマウスをEuthanatize。
   3. しっとりそれを維持するために、全体の灌流処置中に生理食塩水を使用して肝臓をすすぎます。 MV-120チューブに硬化剤を0.1ミリリットルを追加します。シリコーン注射器を使用してExchangeヘパリン生理食塩水の注射器。
   4. suprahepatにクランプを置きIC下大静脈は、肝臓の流出を妨害します。
   5. カテーテル2に延長チューブを接続し、報告されているように客観的肝血管容積に到達するまでの約2分間0.2ミリリットル/分の灌流速度でシリコーン灌流を開始します。表面の血管が青色の電源を入れたときにシリコーン灌流を停止します。
4. サンプリング
   1. 肝臓への損傷を避ける肝靭帯を解剖。肝臓を外植し、固定のためにホルマリンに入れて。

4.マイクロCT（μCT）スキャン

μCTを用いた外植肝臓試料をスキャンするには、以下のステップが必要とされています。

1. 固定液のうち、肝臓試料を取ります。 μCT床上に肝臓を置きます。 μCTに肝臓サンプルとμCTのベッドを置きます。
2. スキャンを開始する前に、トポグラムを取得します。小さな肝臓試料のための1つの副走査と大きなサンプル用の2つのsubscansを使用してください。
3. 選択します81;高解像度のCTプロトコル（ 例えば 、HQD-6565-390-90）。このプロトコルは、副走査あたり90秒のスキャン時間で1全回転の間に1032のx 1012ピクセルと720の突起を取得します。 μCTスキャンを開始します。

5.組織学的連続切片

1. μCTスキャン後に全体としてパラフィン中の肝臓片を埋め込みます。 2,000〜2,500一連のセクションで、その結果、4μmのセクションに全体のパラフィンサンプルをカットします。
2. 虚血性損傷のマーカーとして増殖マーカーおよびHMGB1などのKi-67などの対象の分子事象を可視化するための適切な染色技術で染色切片。科学的疑問に対するで染色の配列を決定します。
3. 染色した切片をデジタル化全体スライドスキャナを使用してください。
4. 血管樹（複数可）（既に実行可能）の3次元再構成を行い、血管樹（進行中の研究）に対するにおける分子事象の3次元分布を可視化します。

結果

品質基準

シリコーン注射の質は、処置中の肉眼で判断することができます。肝臓の表面上の小血管が青色化合物と徐々に埋めます。正常な血管構造が肝臓表面上に観察された場合には、シリコーンゴムの射出品質が良好でした。灌流量が不十分であった場合、肝臓表面の微小血管が完全には満たされません?...

ディスカッション

シリコーン注入とμCTスキャンすることにより、血管ツリーを対比すると、血管新生の進行^5,7,8,10を研究するために頻繁に腫瘍モデルおよび神経学的疾患モデルで導入されました。シリコーン注入の方法論の改善は、マウスにおける部分肝切除後の血管の成長を可視化し、定量化するために本研究で作製しました。

良好な潅流品質を達成するために注意が必要重要...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
PERFUSOR® VI	B.BRAUN	87 222/0
Pipetus®-akku	Hirschmann	9907200
Pipets	Greiner	606180
micro scissors	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 14058-09
micro serrefine	Fine Science Tools (F·S·L)	No.18055-05
Micro clamps applicator	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 18057-14
Straight micro forceps	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 00632-11
Curved micro forceps	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 00649-11
needle-holder	Fine Science Tools (F·S·L)	No. 12061-01
1 ml syringe	B.Braun	9161406V
5 ml syringe	B.Braun	4606051V
extension and connection lines	B.Braun	4256000	30 cm, inner ø 1.2 mm
6-0 silk (Perma-Hand Seide)	Ethicon	639H
6-0 prolene	Ethicon	8711H
Microfil® MV diluent	FLOW TECH, INC
Microfil® MV - 120	FLOW TECH, INC	MV - 120 (blue)
MV curing agent	FLOW TECH, INC
Heparin 2500 I.E./5 ml	Rotexmedica	ETI3L318-15
Saline	Fresenius Kabi Deutschland GmbH	E15117/D DE
Imalytics Preclinical software	Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, Germany
HepaVision	Fraunhofer MEVIS, Bremen, Germany
NanoZoomer 2.0-HT Digital slide scanner	Hamamatsu Electronic Press, Japan	C9600
Tomoscope Duo CT	CT Imaging GmbH, Erlangen, Germany	TomoScope® Synergy