Un nuevo enfoque para evaluar el resultado de motor de Estimulación Cerebral Profunda Efectos en la rata hemiparkinsonianas: Escalera y cilindro de prueba

Resumen

Deep brain stimulation (DBS) is an effective treatment option for Parkinson's disease. We established a study design to screen novel stimulation paradigms in rats. The protocol describes the use of the staircase test and cylinder test for motor outcome assessment in DBS treated hemiparkinsonian rats.

Resumen

La estimulación cerebral profunda del núcleo subtalámico es una opción de tratamiento eficaz para la enfermedad de Parkinson. En nuestro laboratorio hemos establecido un protocolo para detectar distintos patrones de neuroestimulación en hemiparkinsonianas (unilateral) ratas lesionadas. Consiste en crear la lesión de un Parkinson unilateral mediante la inyección de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) en la derecha haz medial del cerebro anterior, la implantación de electrodos de estimulación crónicas en el núcleo subtalámico y la evaluación de los resultados motores al final de 24 periodos hr de neuroestimulación externa cable unido . La estimulación se llevó a cabo con la estimulación de corriente constante. La amplitud se estableció un 20% por debajo del umbral individual para los efectos secundarios. La evaluación de los resultados del motor se realiza mediante la evaluación de la utilización de la pata espontánea en el ensayo de cilindro de acuerdo con Shallert y por la evaluación de alcanzar el experto en la escalera de prueba de acuerdo a Montoya. Este protocolo se describe en detalle la formación en la caja de escalera, el cprueba ylinder, así como el uso tanto en ratas hemiparkinsonianas. El uso de ambas pruebas es necesario, porque el ensayo de la escalera parece ser más sensible para afectar destrezas motoras finas y presenta una mayor sensibilidad a los cambios durante la neuroestimulación. La combinación del modelo unilateral Parkinson y las dos pruebas de comportamiento permite la evaluación de los diferentes parámetros de estimulación de una manera estandarizada.

Introducción

La estimulación cerebral profunda del núcleo subtalámico (STN) es una opción de tratamiento eficaz para los trastornos de la enfermedad ¹ y otro movimiento de Parkinson. Los mecanismos subyacentes son aún poco conocidos y multifactorial, pero una característica clave es la modulación de la actividad de la red neuronal por despolarización repetitiva de los axones en la proximidad del electrodo estimulante ^2-4. Se requiere de alta frecuencia (> 100 Hz) la estimulación de un efecto beneficioso en la mayoría de los objetivos del cerebro y para la mayoría de las indicaciones de DBS. efectos secundarios de la estimulación cerebral profunda de co-activación involuntaria de otras fibras, que están cubiertos por el volumen de estimulación y que están al servicio diferentes funciones, tales como el tracto piramidal. Por lo tanto, sería deseable desarrollar parámetros de estimulación, que activan preferentemente elementos neurales beneficiosos, evitando al mismo tiempo la coactivación de elementos de efectos secundarios ^5,6. Aunque la neurofisiología puede ofrecer tales tuni finaOpciones ng de DBS, el progreso científico ha sido mínima durante las últimas dos décadas, debido a las estrategias de programación principalmente han sido evaluados por "ensayo y error" en los pacientes y restringida por las opciones de programación limitadas de dispositivos de DBS disponibles en el mercado, en lugar de utilizar una visión neurofisiológica y define parámetros experimentales para explorar sistemáticamente el espacio de parámetros completa.

Para superar el obstáculo de la traducción en la investigación DBS que proponemos un protocolo para detectar parámetros de estimulación alternativas en modelos de roedores de Parkinson antes de la exploración clínica. Enfermedad unilateral de Parkinson en ratas se modela utilizando inyecciones de 6-hidroxidopamina en el derecho medial del cerebro anterior paquete de ^7,8. La lesión resultante, como se describe con más detalle hemiparkinsonianas, se evalúa en el ensayo de apomorfina por la evaluación de la puntuación de la rotación después de la inyección de apomorfina a dosis bajas y confirmada post mortem por tirosina hidroxilasa immunohistochemistry. El método es fácil de aplicar y altamente reproducible, teniendo una baja mortalidad y morbilidad. Los déficits motores resultantes son muy discretas ^7,8; los animales presentan un ligero deterioro de la pata contralateral izquierdo durante tanto la exploración espontánea y agarre comportamiento complejo ^9,10.

Para evaluar la eficacia de los protocolos de estimulación cerebral profunda se requieren pruebas que permiten medir un cambio rápido y confiable en el rendimiento del motor y se pueden repetir en el tiempo con diferentes ajustes de neuroestimulación. Varios grupos han propuesto diferentes enfoques de estimulación y diferentes pruebas para evaluar las funciones motoras en ratas ¹¹ con resultados muy variables e inconsistentes ^11-14. Esto nos obligó a elegir un conjunto de pruebas con alta predecir la validez y la complementariedad. Además, para la evaluación del resultado motor en condiciones de estimulación cerebral profunda, fueron favorecidos pruebas de que podría ser realizado por aniani- conectado mediante un cable al generador de estímulo. A estos efectos establecimos nuestra batería de pruebas que consiste en una prueba para el uso de la pata asimetría y una prueba para alcanzar experto. El diseño del estudio se ilustra en la Figura 1.

Para el uso de la pata espontánea se realizó la prueba del cilindro descrito por Shallert ^15, que es una prueba ampliamente utilizado para el uso de la pata durante la exploración vertical. No se requiere ninguna preparación de cada animal. Para la evaluación del comportamiento de agarre más complejo establecimos el ensayo de la escalera de acuerdo con Montoya ^16. Nuestro protocolo se modifica de acuerdo a Kloth ^17. Las ratas son entrenados por un período de doce días para llegar a gránulos de la caja de la prueba. Después del período de formación de la prueba se puede aplicar para medir el comportamiento de agarre complejo contando la tasa de éxito se describe como el número de gránulos comidos. El artículo presenta el entrenamiento detallado en el cuadro de escalera, así como el rendimiento de ambos Behpruebas avioral bajo ingenuo, hemiparkinsonianas y condiciones de estimulación cerebral profunda.

Protocolo

Los experimentos con animales fueron aprobados por la Universidad de Würzburg y las autoridades estatales legales de Baja Franconia, en conformidad con las directrices de protección de los animales y las directrices del Consejo de Comunidades Europeas (número de autorización: 55,2-2531,01 76/11). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el dolor o el malestar de los animales utilizados.

Nota: la implantación de electrodos se realizó como se describe en otro lugar ^18.

1. prueba del cilindro (Figura 2)

1. Preparar un cilindro de vidrio de plástico transparente (altura: 40 cm, diámetro: 19 cm) con la limpieza del cilindro con una solución de ácido acético 0,1%.
2. Preparar las cartas con fecha del experimento y el número de identificación de cada rata.
3. Colocar dos espejos en ángulo de 90 ° detrás del cilindro.
4. Coloque la cámara en frente del cilindro de manera que la distancia entre la cámara y el cilindro permite una buena vista de las patas.
5. Coloque la rata en la caja de transporte.
   Nota: Los animales deben ser manejados por el experimentador antes de la prueba para evitar el estrés.
6. El transporte de la rata de la jaula al cilindro usando la caja de transporte.
7. Coloque la rata en el cilindro (Figura 3).
   1. Siempre realizar todas las pruebas de comportamiento a la misma hora del día para evitar diferencias en la actividad circadianos. Si el animal está conectado al generador de estímulos por cable de asegurarse de que el cable no se enrolle durante el experimento.
8. Presione el botón "Grabar" en la cámara. Mostrar la tarjeta con la fecha real de la experimentación y el número de identificación de la rata a la cámara. Empezar a grabar.
9. Después de cinco minutos, retirar al animal del cilindro y ponerlo de nuevo en la jaula hogar utilizando la caja de transporte.
10. Limpiar el cilindro con una solución de ácido acético 0,1%.
11. Evaluar el uso de la pata del vídeo grabado contando los contactos izquierdo y derecho de la pared de la pata (pata en uso por ciento), así como raretes (de pie sobre las patas traseras, con o sin apoyo en la pared del cilindro). La prueba de cilindro puede ser también evaluada automáticamente por un software adecuado.
    Nota: Una rata sana utiliza las dos patas por igual. La rata hemiparkinsonianas utiliza la pata afectada por lesión en menor medida.

2. Prueba de la escalera (Figura 4)

1. fase de adquisición
   1. Un día antes de la formación familiarizar a los animales con los gránulos utilizados en el ensayo de la escalera.
      1. Opcional: para aumentar la motivación del animal utilizar una restricción en la dieta (10-15 g de pienso estándar de laboratorio para mantener el peso corporal en un 90% del nivel de alimentación libre ^16). Sin embargo, esto no es obligatorio para lograr un efecto de entrenamiento positivo. Este estudio se llevó a cabo sin la restricción de alimentos.
   2. Preparar una caja de escalera de cristal de plástico transparente (altura: 34,5 cm, longitud: 35,5 cm, ancho: 12 cm y estrecho compartimento 6 cm) por la limpieza de la caja con un ac 0,1%solución de ácido etic. Nota: El cuadro de la escalera es una de dos compartimentos de la caja con una plataforma elevada y dos escaleras en el compartimento estrecho. Los pasos a la izquierda en las escaleras en el compartimento estrecho sólo se puede llegar con la pata izquierda, los pasos correctos solamente con la pata derecha.
      Nota: Las cajas de escalera estándar constan de dos compartimentos con una tapa, si se va a utilizar para los experimentos con ratas estimuladas a través de cable, utilizar una caja alta sin tapa.
   3. Retirar la escalera y llenar los pozos en cada paso con ocho pastillas de 45 mg.
   4. Inserte la escalera y poner ocho bolitas adicionales en la plataforma elevada.
   5. Coloque la rata en la caja de transporte.
   6. El transporte de la rata de la jaula hogar de la caja de escalera usando la caja de transporte.
   7. Coloque la rata en la caja de escalera (Figura 5).
   8. Después de cinco minutos, retirar al animal de la caja de escalera y poner de nuevo en la jaula hogar utilizando la caja de transporte.
   9. Tenga en cuenta cuántospellets se puede comer desde su plataforma y (finalmente) desde la escalera derecha e izquierda.
   10. Vuelva a llenar la escalera rellenando los pozos en cada paso con ocho pastillas de 45 mg.
   11. Limpiar la caja escalera con una solución de ácido acético al 0,1% y colocar los gránulos adicionales en la plataforma.
   12. Repita este procedimiento (fase de adquisición) tres días seguidos.
       Nota: Todos los experimentos descritos se realizaron en ratas Sprague Dawley macho. La duración de los diferentes módulos de formación puede variar en ratas de cepa diferente, el sexo y el vendedor.
2. Prueba de Libre Elección
   1. Limpiar la caja escalera con una solución de ácido acético al 0,1%.
   2. Retirar la escalera y llenar los pozos en cada paso con ocho pastillas de 45 mg.
   3. Coloque la rata en la caja de transporte.
   4. El transporte de la rata de la jaula hogar de la caja de escalera usando la caja de transporte.
   5. Coloque la rata en la caja de escalera.
   6. Después de cinco minutos, retirar al animal de la escaleraCaja de la caja y ponerlo de nuevo en la jaula usando la caja de transporte.
      Tenga en cuenta el número de gránulos se come desde la escalera derecha e izquierda.
   7. Nota: Si los animales todavía tienen problemas con el agarre de pellets, añadir un poco más en la plataforma en la que se puede llegar fácilmente.
   8. Vuelva a llenar la escalera rellenando los pozos en cada paso con ocho pastillas de 45 mg.
   9. Limpiar la caja escalera con una solución de ácido acético al 0,1% para el siguiente animal.
   10. Repita este procedimiento (fase de libre elección) tres días seguidos.
       Nota: Los resultados presentados se obtuvieron mediante la formación llevadas a cabo sin un período de descanso entre los módulos. Algunos grupos prefieren un día de descanso para la consolidación, para apoyar el proceso de formación.
3. Forzado prueba de opción
   1. Limpiar la caja escalera con una solución de ácido acético al 0,1%.
   2. Retirar la escalera y llenar los pozos en cada paso en la escalera izquierda con ocho (los primeros tres días del módulo) o cuatro (thr consecutivaee días de los pellets módulo) 45 mg.
      1. Realice la prueba de elección forzada en el lado, donde se producirá el deterioro.
         Nota: Llevamos a cabo la lesión Parkinson en el hemisferio derecho y por lo tanto entrenar selectivamente la pata izquierda.
   3. Coloque la rata en la caja de transporte.
   4. El transporte de la rata de la jaula hogar de la caja de escalera usando la caja de transporte.
   5. Coloque la rata en la caja de escalera.
   6. Después de cinco minutos, retirar al animal de la caja de escalera y poner de nuevo en la jaula hogar utilizando la caja de transporte.
   7. Tenga en cuenta el número de gránulos se come desde la escalera izquierda.
   8. Vuelva a llenar la escalera rellenando los pozos en cada paso con ocho o cuatro pastillas de 45 mg (número de perdigones que depende de día de entrenamiento).
   9. Limpiar la caja escalera con una solución de ácido acético al 0,1% para el siguiente animal.
   10. Repita este procedimiento (fase de elección forzada) seis días seguidos.
4. Adquisición de datos
   1. Realizar el experimento como se ha descrito para el módulo de elección forzada (cuatro bolitas en cada pozo de la escalera de la izquierda) en dos días consecutivos. Calcular la tasa de éxito (número de gránulos comidos) como la media de los dos días.

Resultados

Todos los animales fueron sometidos a una autopsia verificación histológica de la lesión dopaminérgica tanto y la ubicación de los electrodos. Sólo los animales con la colocación correcta del electrodo dentro de la STN (Figura 6) y la lesión dopaminérgica completa (> 90% de pérdida de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra) se incluyeron en la sección de resultados (Figura 7).

Discusión

En este artículo se describe un protocolo detallado de formación sobre la prueba del cilindro y la escalera. Este último está diseñado para evaluar el comportamiento de agarre compleja y el movimiento de la motricidad fina debido a la experta en ratas alcanzar ^16,17. La medición del resultado se expresa como el número de gránulos comidos durante la prueba, que es una medición objetiva. El protocolo puede ser utilizado en los modelos de rata para la enfermedad de Parkinson y otros modelos de enfermeda...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Staircase box without lid	Glas Keil, Germany		custom made
Cylinder box	Glas Keil, Germany		custom made
Dustless precision pellets, 45 mg	Bio Serv	F0021