계단 및 실린더 테스트 : 소설 접근은 Hemiparkinsonian 쥐에 깊은 뇌 자극 효과의 모터 결과를 평가하는

요약

Deep brain stimulation (DBS) is an effective treatment option for Parkinson's disease. We established a study design to screen novel stimulation paradigms in rats. The protocol describes the use of the staircase test and cylinder test for motor outcome assessment in DBS treated hemiparkinsonian rats.

초록

시상 핵의 깊은 뇌 자극은 파킨슨 병에 대한 효과적인 치료 옵션입니다. 우리의 실험실에서 우리는 hemiparkinsonian (일방적 인 병변) 쥐에서 다른 신경 자극 패턴을 선별 할 수있는 프로토콜을 설립했다. 이는 케이블 바인딩 외부 신경 자극의 24 시간주기의 끝에서 모터 결과를 우측 중간 전뇌 다발로 -6- hydroxydopamine (6-OHDA)을 주입 시상 핵으로 만성 자극 전극을 주입하고 평가함으로써 일방적 파킨슨 병변을 생성 이루어져 . 자극은 자극의 정전류로 행 하였다. 진폭은 부작용에 ​​대한 개별적인 임계 값 20 % 이하로 설정 하였다. 모터 결과 평가 Shallert하고 몬토야에 따른 계단 시험에서 도달 당업자의 평가에 의해 따른 실린더 테스트 자발적 발을 사용하여 평가를 수행 하였다. 이 프로토콜은 자세히 계단 상자의 훈련에 대해 설명을 cylinder 테스트뿐만 아니라 hemiparkinsonian 쥐에서 모두 사용. 계단 테스트가 미세 운동 기술 장애에 더 민감한 것으로 보인다 신경 자극하는 동안 변경 민감도를 나타 내기 때문에 두 테스트의 사용은 필요하다. 일방적 파킨슨 모델 두 행동 검사의 조합은 표준화 된 방식으로 서로 다른 자극 파라미터의 평가를 허용한다.

서문

시상 핵 (STN)의 깊은 뇌 자극은 파킨슨 병 ⁽¹⁾ 및 기타 운동 장애에 대한 효과적인 치료 옵션입니다. 기전은 아직 잘 이해되지 및 인성하지만, 주요 기능은 자극 전극 ^2-4 부근 축삭 반복 탈분극 의한 신경 네트워크 활동의 조절이다된다. 높은 주파수 (> 100 Hz에서) 자극은 대부분 뇌의 목표와 DBS 대부분의 지시 사항에 대해 유익한 효과가 필요합니다. 자극 부피 덮고 다른 섬유 부주의 coactivati​​on에서 뇌 심부 자극 결과 부작용은 피라미드 기관 등 다양한 기능을 보조하다. 그러므로, 부작용 소자의 ^5,6- coactivation 피해서 우선적 유익한 신경 요소를 활성화 자극 파라미터를 개발하는 것이 바람직 할 것이다. 신경 생리학은 잘 tuni을 제공 할 수 있지만프로그래밍 전략은 주로 오히려 신경 생리 학적 통찰력을 사용하는 것보다, 상업적으로 이용 가능한 DBS 장치의 제한된 프로그래밍 옵션에 의해 환자의 '시행 착오'에 의해 평가 및 제한 되었기 때문에 DBS의 NG 옵션은 과학적 진보는, 지난 20 년 동안 최소있다 체계적으로 전체 매개 변수 공간을 탐구하는 실험 설정을 정의했다.

우리가 이전에 임상 탐사 파킨슨의 설치류 모델에서 다른 자극 매개 변수를 선별 할 수있는 프로토콜을 제안하는 DBS 조사에서 번역 장애물을 극복합니다. 쥐에서 일방적 인 파킨슨 병은 오른쪽 내측 전뇌 다발 ^7,8로 6-hydroxydopamine 주사를 사용하여 모델링된다. 그 결과 병변, hemiparkinsonian로 더 설명, 티로신 수산화의 immunohist으로 저용량 아포 모르핀 주입 후 회전 점수의 평가에 의해 아포 모르핀 시험에서 평가 및 확인 사후ochemistry. 낮은 사망률과 이환율 베어링 동안이 방법은 적용하기 쉽고 높은 재현성이다. 그 결과 모터 적자는 ^{7,8 매우} 이산이다; 동물 자발적인 탐구 복잡한 파지 모두 동작 중에 ^9,10 반대측 왼쪽 발에 약간의 손상을 나타낸다.

모터 성능에 신속하고 신뢰성있게 변화를 측정 및 다른 신경 자극 설정 시간에 따라 반복 될 수있는 테스트가 필요 깊은 뇌 자극 프로토콜의 효과를 평가한다. 몇몇 그룹은 매우 다양하고 일관성 결과 ^11-14 래트 ^(11)에 모터의 기능을 평가하기 위해 다른 자극 방법 및 다른 테스트를 제안 하였다. 이 유효성 및 보완 예측 높은와 테스트 세트를 선택하라고 강요했다. 또한, 뇌 심부 자극 조건에서 모터 결과의 평가를 위해, 테스트 ANI 의해 수행 될 수있는 선호 된MALS는 자극 발생기에 케이블을 통해 연결되어 있습니다. 이러한 목적을 위해 우리는 발 사용 비대칭 하나의 테스트 및 숙련에 도달하기위한 하나의 테스트로 구성된 우리의 테스트 배터리를 설립했다. 이 연구 디자인은도 1에 도시되어있다.

자연 발 사용을 위해 우리는 수직 탐사하는 동안 발 사용하기 위해 널리 사용되는 시험이다 Shallert ^(15)에 의해 기술 된 실린더 시험을 수행 하였다. 동물의 어떤 훈련이 필요하지 않습니다. 더 복잡한 파지 동작의 평가를 위해 우리는 몬토야 ^(16)에 따라 계단 테스트를 설립했다. 우리의 프로토콜은 Kloth ^(17)에 따라 수정됩니다. 래트는 시험 상자 펠릿 도달 열두 일 동안 훈련된다. 훈련 기간 이후에 테스트 먹게 알갱이의 수로서 기술 성공률을 계산하여 파지 복잡한 거동을 측정하기 위해 적용될 수있다. 이 기사는 BEH 계단 상자에 대한 자세한 교육뿐만 아니라 모두의 성능을 제공합니다순진, hemiparkinsonian과 깊은 뇌 자극 조건에서 avioral 테스트합니다.

프로토콜

동물 실험은 동물 보호 지침 및 유럽 공동체위원회 지침 (: 55.2-2531.01 11분의 76 승인 번호)에 따라 뷔르츠부르크 대학과 운터 프랑켄 현의 법적 상태 당국에 의해 승인되었다. 모든 노력은 사용되는 동물의 통증 또는 불편 함을 최소화하기 위해 만들어졌다.

주의 : 다른 한 바와 같이 전극 ^(18)의 주입을 수행 하였다.

1. 실린더 테스트 (그림 2)

1. 0.1 % 아세트산 용액으로 세척하여 실린더 투명한 플라스틱 유리 실린더 (19cm : 40cm, 직경 높이)를 준비한다.
2. 실험의 날짜와 각 쥐의 식별 번호와 카드를 준비합니다.
3. 실린더 뒤에 90 ° 각도로 두 개의 거울을 배치합니다.
4. 카메라와 상기 실린더 사이의 거리가 발을 잘 볼 수 있도록 실린더의 전방에 카메라를 배치했다.
5. 운송 상자에 쥐를 놓습니다.
   참고 : 동물은 스트레스를 피하기 위해 테스트하기 전에 실험에 의해 처리되어야한다.
6. 운송 상자를 사용하여 실린더에 홈 케이지에서 쥐를 전송.
7. 실린더 (그림 3)에서 쥐를 놓습니다.
   1. 항상 활동의 주기성 차이 않도록 하루 동시에 모든 행동 검사를 수행한다. 동물이 케이블에 의해 자극 발생기에 연결되어있는 경우 케이블이 실험 기간 동안 꼬여 있지 않은지 확인합니다.
8. 카메라의 "기록"버튼을 누릅니다. 실험 카메라에 쥐의 식별 번호의 실제 날짜 카드를 표시합니다. 기록 시작합니다.
9. 5 분 후에, 실린더으로부터 동물을 제거하고 상기 전송 창을 사용하여 홈 케이지에 다시 넣어.
10. 0.1 % 아세트산 용액으로 실린더를 청소합니다.
11. 왼쪽과 오른쪽 발을 벽에 접촉 (퍼센트에서 발 사용)뿐만 아니라 R을 계산하여 녹화 된 비디오에서 발 사용 평가earings는 (또는 실린더 벽에지지 않고 뒷발 서). 실린더 테스트는 또한 적절한 소프트웨어에 의해 자동적으로 평가 될 수있다.
    참고 : 건강한 쥐 똑같이 두 발을 사용합니다. hemiparkinsonian 쥐가 적은 범위를 병변에 의한 영향을받는 발을 사용합니다.

2. 계단 시험 (그림 4)

1. 취득 단계
   1. 이전에 훈련에 하루는 계단 테스트에 사용 된 펠릿과 동물을했습니다.
      1. 옵션 : 동물의 동기는 (무료 공급 레벨 ^16의 90 %에서 체중을 유지하기 위해 표준 실험실 우 10 ~ 15 g)을식이 제한을 사용하여 증가합니다. 그러나,이 양의 훈련 효과를 얻을 필수 아니다. 본 연구는 식품 제한없이 실시 하였다.
   2. 투명한 플라스틱 유리 계단 상자를 준비합니다 (높이 : 34.5 cm, 길이 : 35.5 cm, 폭 : 12 cm 좁은 구획 6cm) 0.1 %의 교류와 함께 상자를 청소하여etic 산 용액. 주 : 계단 상자 상승 플랫폼 및 좁은 구획 개의 계단 두 구획 박스이다. 좁은 구획 계단에 왼쪽 단계는 단지 왼쪽 발 만 오른쪽 발과 오른쪽 단계에 도달 할 수 있습니다.
      참고 : 뚜껑없이 높은 상자를 사용하여, 케이블을 통해 자극 쥐 실험을 위해 사용되는 경우, 표준 계단 상자 뚜껑 두 개의 구획으로 구성.
   3. 계단을 제거하고 팔 45 mg의 알약과 각 단계에 우물을 입력합니다.
   4. 계단을 삽입하고 강화 된 플랫폼에서 8 개의 추가 알약을 넣어.
   5. 운송 상자에 쥐를 놓습니다.
   6. 운송 상자를 사용하여 계단 상자에 홈 케이지에서 쥐를 전송.
   7. 계단 상자에 쥐를 (그림 5)를 배치합니다.
   8. 5 분 후에, 계단 상자에서 동물을 제거하고 상기 전송 창을 사용하여 홈 케이지에 다시 넣어.
   9. 얼마나 많은 주펠릿은 오른쪽과 왼쪽 계단에서 플랫폼 (결국)에서 먹게되었다.
   10. 팔 45 mg의 알약과 각 단계에 우물을 작성하여 계단 리필.
   11. 0.1 % 아세트산 용액으로 계단 상자를 청소하고 플랫폼에 추가 알약을 배치합니다.
   12. 이 절차 (취득 단계) 연속 3 일을 반복합니다.
       주 : 수컷 스프 라그 돌리 래트에서 수행 하였다 기재된 모든 실험. 다른 교육 모듈의 지속 기간은 다른 변형, 성별 벤더 래트에서 다를 수있다.
2. 무료 선택 테스트
   1. 0.1 % 아세트산 용액으로 계단 상자를 청소합니다.
   2. 계단을 제거하고 팔 45 mg의 알약과 각 단계에 우물을 입력합니다.
   3. 운송 상자에 쥐를 놓습니다.
   4. 운송 상자를 사용하여 계단 상자에 홈 케이지에서 쥐를 전송.
   5. 계단 상자에 쥐를 놓습니다.
   6. 5 분 후에, 계단에서 동물을 제거케이스 박스 운송 상자를 사용하여 홈 케이지로 돌려 넣어.
      오른쪽 및 왼쪽 계단에서 먹을 얼마나 많은 펠릿 있습니다.
   7. 참고 : 동물이 여전히 펠렛을 파악에 문제가있는 경우, 그들은 쉽게 도달 할 수있는 플랫폼을 좀 더 추가 할 수 있습니다.
   8. 팔 45 mg의 알약과 각 단계에 우물을 작성하여 계단 리필.
   9. 다음 동물에 대한 0.1 % 초산 용액으로 계단 상자를 청소합니다.
   10. 이 절차 (자유 선택 단계) 연속 3 일을 반복합니다.
       주 : 제시된 결과는 모듈 간의 휴식 기간없이 수행 훈련에 의해 얻어졌다. 일부 그룹은 트레이닝 프로세스를 지원하기 위해, 통합을위한 일 휴식 선호한다.
3. 외부 힘에 의한 선택 테스트
   1. 0.1 % 아세트산 용액으로 계단 상자를 청소합니다.
   2. 계단을 제거하고 팔 (모듈 3 일) 또는 사 (연속 THR과 왼​​쪽 계단의 각 단계에 우물을 채우기모듈) 45 mg을 알약의 EE 일.
      1. 손상이 발생합니다 측에 강제 선택 테스트를 수행합니다.
         참고 : 우리는 오른쪽 반구에있는 파킨슨 병변을 수행하기 때문에 선택적으로 왼쪽 발을 훈련.
   3. 운송 상자에 쥐를 놓습니다.
   4. 운송 상자를 사용하여 계단 상자에 홈 케이지에서 쥐를 전송.
   5. 계단 상자에 쥐를 놓습니다.
   6. 5 분 후에, 계단 상자에서 동물을 제거하고 상기 전송 창을 사용하여 홈 케이지에 다시 넣어.
   7. 왼쪽 계단에서 먹을 얼마나 많은 펠릿 있습니다.
   8. 팔 또는 네 개의 45 mg의 펠렛 (펠렛의 수는 교육 일에 따라 다름)와 각 단계에 우물을 작성하여 계단 리필.
   9. 다음 동물에 대한 0.1 % 초산 용액으로 계단 상자를 청소합니다.
   10. 이 절차 (강제 선택 단계) 행의 육일를 반복합니다.
4. 데이터 취득
   <두 개의 연속적인 일에 (왼쪽 계단에 잘 각각 네 개의 알약을) 강제 선택 모듈에 기재 한 바와 같이 리>는 실험을 수행합니다. 이틀의 수단으로 성공률 (먹게 알갱이의 수)를 계산한다.

결과

모든 동물은 도파민 병변 전극 위치 모두 후 부검 학적 검증을 시행 하였다. STN 내부 올바른 전극 배치 (그림 6) 완전한 도파민 성 병변 (> 흑질에서 도파민 뉴런의 90 % 손실) 만 동물은 결과 섹션 (그림 7)에 포함되었다.

병변 조건에서 수행되는 실린더 검사는 병변 왼쪽 발 사용이 15.11 % (평균)에 약 50...

토론

이 문서에서는 실린더와 계단 테스트에 대한 자세한 훈련 프로토콜을 설명합니다. 후자 인해 숙련 된 쥐 ^{16, 17에} 도달 복잡한 파지 행동과 미세 운동의 움직임을 평가하기 위해 설계되었습니다. 결과 측정은 객관적으로 측정되는 테스트 기간 동안 식사 펠릿의 숫자로 표현된다. 프로토콜은 파킨슨 병 및 다른 운동 질환 모델 랫트 모델에서 이용 될 수있다. 실린더 시험은 래트에서 발 사용...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Staircase box without lid	Glas Keil, Germany		custom made
Cylinder box	Glas Keil, Germany		custom made
Dustless precision pellets, 45 mg	Bio Serv	F0021